胰腺癌组织c-Ki-ras基因点突变分析
1中国医科大学第二临床学院消化内科 辽宁省沈阳市 110004
2沈阳医学院附属中心医院 110024
3沈阳军区总医院消化内科 110004
项目负责人 徐永泉，中国医科大学第二临床学院消化内科 辽宁省沈阳市 110004
Telephone:024-23893501-6986
收稿日期 2001-08-25 接受日期 2001-09-0
摘 要目的 研究14例胰腺癌的c-K-ras基因的点突变.
, 百拇医药
方法 采用PCR和DNA直接测序方法(direct sequencing method)分析 14例胰腺癌的福尔马林固定—石蜡包埋的癌组织.
结果 在14例胰腺癌组织中，12例有c-k-ras 基因的点突变，突 变发生率为86%.点突变发生在第12，13位密码子，点突变的形式为甘氨酸(GGT)→天冬氨 酸(GAT)8例→缬氨酸(GTT)3例→精氨酸(CGT)1例.
结论 胰腺癌ras基因点突变发生率高(86%)，可为有争议胰腺癌 病例的诊断提供一个可靠的新方法，并可为其基因治疗开辟新途径.
主题词 胰腺肿瘤/遗传学；基因，ras；点突变；序列分析 ，DNA；聚合酶链反应
, 百拇医药
徐永泉，刘香，夏玉亭.胰腺癌组织c-Ki-ras基因点突变分析.世界华人消 化杂志，2001；9(11)：1329-1330
0 引言人类肿瘤中最常见的与转化活性有关的基因是ras家族癌基因(N-ras，Ki -ras，Ha-ras).其编码蛋白为P21.ras基因的激活在肿瘤发生中 起重要作用.ras基因激活的主要方式是点突变.点突变发生在第12位，13位和61位密码 子.ras基因点突变可能使其获得转化细胞能力，也就是调节细胞的生长与分化.一旦r as基因突变导致P21蛋白结构改变和功能异常，则可引起恶性肿瘤发生.人类许多恶性肿瘤发现有ras基因的点突变.其中胰 腺癌ras基因点突变发生率为最高，可达75%-95%.我们采用灵敏的聚合酶链式反应(po lym erase chain reaction PCR)和DNA直接序列测定方法(direct sequencing)分析了14例胰 腺癌的福尔马林固定—石蜡包埋的癌组织，结果有12例在第12位，13位密码子有ras基 因的点突变，占86%.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 14例胰腺癌组织标本均来自中国医科大学第二临床学 院病理科自1989-04/1992-04经外科手术后切除的胰腺癌标本.男10例，女4例.年龄从54 岁～73岁(平均63岁).胰腺癌组织福尔马林固定，石蜡包埋，室温储存.正常对照DNA来自 本院献血员的血液.DNA制备采用美国产Iso-Quick DNA提取药盒. PCR 引物及测序引物由 美国南加利福尼亚大学医学院分子生物中心实验室合成并提供.Ki-ras基因第12，13和 61位点突变引物见表1.
表1 Ki-ras 12, 13和61位点突变用引物及测序引物
, 百拇医药
蛋白水解酶K，Taq DNA聚合酶(Biolabs, USA)DNA 测序酶(Biocohemical Corp，USA ).2.0版DNA测序药盒(Biochemical Corp,USA).同位素采用美国南加利福尼亚大学医学 院同位素中心提供.
1.2 方法 模板DNA的制备：胰腺癌组织蜡块切成5μm -8μm厚的切片，经二甲苯，酒精脱蜡，蛋白水解酶K在56℃，消化2h后，在100℃水浴中灭 活10min，冷却后直接用于PCR扩增.PCR包括模板DNA10mmol·L-1，Tris-HCl(PH8 .8),50mmol·L-1KCl,2.5mmol·L-1MgCl2，0.2g·L-1牛血清白 蛋白.引物各1μmol·L-1,dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)1mol·L-1, 2uT agDNA 聚合酶，7μmol·L-1EDTA，10mmol·L-1巯基乙醇.最后反应体积为1 00μL，加90μL矿物油覆盖.经94℃，2min变性.55℃2min退火，72℃2min延伸.35次循环.DN A扩增仪采用美国产Perkin-ElmerDNA扩增仪(Techne Corp).待反应完结后，取10μl PC R产物，经1.5g·L-1琼脂糖凝胶电泳,检查扩增带.PCR产物纯化与浓缩采用Centric on 30管(Amicon Davers，USA)纯化及浓缩扩增后的PCR产物.测序方法 采用Sanger DNA 测序法.在反应液12μL中包括r-32p-dATP 2pmol·L-1标定的测序引物，0.2pmol ·L-1 经纯化后的PCR产物,1μL, 0.1mol·L-1二硫苏糖醇(DTT),2μl, 5倍的测序的缓冲液，加热95℃,5min,然后放入冰中.将2.5μL含有双脱氧腺苷三磷酸(A),双 脱氧胞苷三磷酸(C),双脱鸟苷三磷酸(G)和双脱氧次黄苷三磷酸(T)分别装入4个试管中 ，37℃予热5min，将上述12μL反应液分为4份分别加入4个管中，加热37℃,5min后加4μL 终止反应液.加热至80℃，反应终止后行8mol·L-1尿素80g·L-1聚丙酰胺凝 胶电泳分析.凝胶干燥后进行X光胶片自身显影.
, 百拇医药
2 结果经PCR扩增14例胰腺癌组织切片上含K-ras 第 12位，13位和61位密码子序列，测序显示K-ras基因在第12位，13位密码子有点突变12 例.第 61位密码子未发现有点突变.突变的形式为甘氨酸(GGT)→天冬氨酸(GAT)8例→缬氨酸( GTT)3例，→精氨酸(CGT)1例，突变发生率为86%.
3 讨论
人类及哺乳动物的许多肿瘤发现有ras 基因的点突变.其中75%～95%胰腺癌，40%～50%的结肠癌，38%的胃癌和30%急性白血病，50% 的肺癌都有ras基因的点突变.本组14例胰腺癌采用灵敏的PCR和直接测序检测K-ras 基因点突变，有12例在第12位，13密码子有点突变.突变发生率占86%，这与国外的报告相似.r as基因的突变检测对监测肿瘤的发生有重要临床意义.对判断预后及评估疗效也有指导意义. 探索ras基因的突变对某些恶性肿瘤的基础研究及临床应用也有重要意义.同时，为有争 议胰腺癌病例的诊断提供一个可靠的新方法.并将为胰腺癌的基因治疗开辟新的途径.
, 百拇医药
4 参考文献1 Zambon C, Navaglia F, Basso D, Gallo N, Greco E, Piva MG, Fogar P, Pasquali C, Pedrazzoli S, Plebani M. ME-PCR for the identification
if mutated K-ras in serum and bile of pancreatic cancer patients: an unsatisfactory technique for clinical application. Clin Chim Acta，2000:302:35-48
2 Myung SJ, Kim MH, Kim YS, Kim HJ, Park ET, Yoo KS, Lim BC, Wan Seo D, Lee SK, Min YI, Kim JY. Telimerase activity in pure
, 百拇医药
pancreatic juice for the diagnosis of pancreatic cancer may be complementary to K-ras mutation.
Gastrointest Endosc， 2000:51:708-13
3 Tateishi K, Tada M, Yamagata M, Isayama H, Komatsu Y, Komatsu Y, Kawabe T, Shiratori Y, Omata M. High proportion of mutation
K-ras gene in pancreatic juice of patients with pancreatic cystic lesions. Gut，1999; 45:737-40
4 孙城谊，张延龄，施达仁，陆洪珍.胰腺癌ras癌基因及p53抑癌基因表达的临床意义.华人消化杂志，1998；6(特刊7)：237-239, 百拇医药(徐永泉1 刘香2 夏玉亭3)
2沈阳医学院附属中心医院 110024
3沈阳军区总医院消化内科 110004
项目负责人 徐永泉，中国医科大学第二临床学院消化内科 辽宁省沈阳市 110004
Telephone:024-23893501-6986
收稿日期 2001-08-25 接受日期 2001-09-0
摘 要目的 研究14例胰腺癌的c-K-ras基因的点突变.
, 百拇医药
方法 采用PCR和DNA直接测序方法(direct sequencing method)分析 14例胰腺癌的福尔马林固定—石蜡包埋的癌组织.
结果 在14例胰腺癌组织中，12例有c-k-ras 基因的点突变，突 变发生率为86%.点突变发生在第12，13位密码子，点突变的形式为甘氨酸(GGT)→天冬氨 酸(GAT)8例→缬氨酸(GTT)3例→精氨酸(CGT)1例.
结论 胰腺癌ras基因点突变发生率高(86%)，可为有争议胰腺癌 病例的诊断提供一个可靠的新方法，并可为其基因治疗开辟新途径.
主题词 胰腺肿瘤/遗传学；基因，ras；点突变；序列分析 ，DNA；聚合酶链反应
, 百拇医药
徐永泉，刘香，夏玉亭.胰腺癌组织c-Ki-ras基因点突变分析.世界华人消 化杂志，2001；9(11)：1329-1330
0 引言人类肿瘤中最常见的与转化活性有关的基因是ras家族癌基因(N-ras，Ki -ras，Ha-ras).其编码蛋白为P21.ras基因的激活在肿瘤发生中 起重要作用.ras基因激活的主要方式是点突变.点突变发生在第12位，13位和61位密码 子.ras基因点突变可能使其获得转化细胞能力，也就是调节细胞的生长与分化.一旦r as基因突变导致P21蛋白结构改变和功能异常，则可引起恶性肿瘤发生.人类许多恶性肿瘤发现有ras基因的点突变.其中胰 腺癌ras基因点突变发生率为最高，可达75%-95%.我们采用灵敏的聚合酶链式反应(po lym erase chain reaction PCR)和DNA直接序列测定方法(direct sequencing)分析了14例胰 腺癌的福尔马林固定—石蜡包埋的癌组织，结果有12例在第12位，13位密码子有ras基 因的点突变，占86%.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 14例胰腺癌组织标本均来自中国医科大学第二临床学 院病理科自1989-04/1992-04经外科手术后切除的胰腺癌标本.男10例，女4例.年龄从54 岁～73岁(平均63岁).胰腺癌组织福尔马林固定，石蜡包埋，室温储存.正常对照DNA来自 本院献血员的血液.DNA制备采用美国产Iso-Quick DNA提取药盒. PCR 引物及测序引物由 美国南加利福尼亚大学医学院分子生物中心实验室合成并提供.Ki-ras基因第12，13和 61位点突变引物见表1.
表1 Ki-ras 12, 13和61位点突变用引物及测序引物
| 引物 | 序列 |
| PCR引物 | |
| 12/13 | 5’GACTGAATATAAACTTGTGG 3’ |
| 5’CTATTGTTGGATCATATTCG 3’ | |
| 61 | 5’TTCCTACAGGAAGCAAGTAG 3’ |
| 5’CACAAAGAAAGCCCTCCCCA 3’ | |
| 测序引物 | |
| 12/ 13 | 5’TCTGAATTAGCTGTATCGTC 3’ |
| 61 | 5’AACCTGTCTCTTGGATATTC 3’ |
, 百拇医药
蛋白水解酶K，Taq DNA聚合酶(Biolabs, USA)DNA 测序酶(Biocohemical Corp，USA ).2.0版DNA测序药盒(Biochemical Corp,USA).同位素采用美国南加利福尼亚大学医学 院同位素中心提供.
1.2 方法 模板DNA的制备：胰腺癌组织蜡块切成5μm -8μm厚的切片，经二甲苯，酒精脱蜡，蛋白水解酶K在56℃，消化2h后，在100℃水浴中灭 活10min，冷却后直接用于PCR扩增.PCR包括模板DNA10mmol·L-1，Tris-HCl(PH8 .8),50mmol·L-1KCl,2.5mmol·L-1MgCl2，0.2g·L-1牛血清白 蛋白.引物各1μmol·L-1,dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)1mol·L-1, 2uT agDNA 聚合酶，7μmol·L-1EDTA，10mmol·L-1巯基乙醇.最后反应体积为1 00μL，加90μL矿物油覆盖.经94℃，2min变性.55℃2min退火，72℃2min延伸.35次循环.DN A扩增仪采用美国产Perkin-ElmerDNA扩增仪(Techne Corp).待反应完结后，取10μl PC R产物，经1.5g·L-1琼脂糖凝胶电泳,检查扩增带.PCR产物纯化与浓缩采用Centric on 30管(Amicon Davers，USA)纯化及浓缩扩增后的PCR产物.测序方法 采用Sanger DNA 测序法.在反应液12μL中包括r-32p-dATP 2pmol·L-1标定的测序引物，0.2pmol ·L-1 经纯化后的PCR产物,1μL, 0.1mol·L-1二硫苏糖醇(DTT),2μl, 5倍的测序的缓冲液，加热95℃,5min,然后放入冰中.将2.5μL含有双脱氧腺苷三磷酸(A),双 脱氧胞苷三磷酸(C),双脱鸟苷三磷酸(G)和双脱氧次黄苷三磷酸(T)分别装入4个试管中 ，37℃予热5min，将上述12μL反应液分为4份分别加入4个管中，加热37℃,5min后加4μL 终止反应液.加热至80℃，反应终止后行8mol·L-1尿素80g·L-1聚丙酰胺凝 胶电泳分析.凝胶干燥后进行X光胶片自身显影.
, 百拇医药
2 结果经PCR扩增14例胰腺癌组织切片上含K-ras 第 12位，13位和61位密码子序列，测序显示K-ras基因在第12位，13位密码子有点突变12 例.第 61位密码子未发现有点突变.突变的形式为甘氨酸(GGT)→天冬氨酸(GAT)8例→缬氨酸( GTT)3例，→精氨酸(CGT)1例，突变发生率为86%.
3 讨论
人类及哺乳动物的许多肿瘤发现有ras 基因的点突变.其中75%～95%胰腺癌，40%～50%的结肠癌，38%的胃癌和30%急性白血病，50% 的肺癌都有ras基因的点突变.本组14例胰腺癌采用灵敏的PCR和直接测序检测K-ras 基因点突变，有12例在第12位，13密码子有点突变.突变发生率占86%，这与国外的报告相似.r as基因的突变检测对监测肿瘤的发生有重要临床意义.对判断预后及评估疗效也有指导意义. 探索ras基因的突变对某些恶性肿瘤的基础研究及临床应用也有重要意义.同时，为有争 议胰腺癌病例的诊断提供一个可靠的新方法.并将为胰腺癌的基因治疗开辟新的途径.
, 百拇医药
4 参考文献1 Zambon C, Navaglia F, Basso D, Gallo N, Greco E, Piva MG, Fogar P, Pasquali C, Pedrazzoli S, Plebani M. ME-PCR for the identification
if mutated K-ras in serum and bile of pancreatic cancer patients: an unsatisfactory technique for clinical application. Clin Chim Acta，2000:302:35-48
2 Myung SJ, Kim MH, Kim YS, Kim HJ, Park ET, Yoo KS, Lim BC, Wan Seo D, Lee SK, Min YI, Kim JY. Telimerase activity in pure
, 百拇医药
pancreatic juice for the diagnosis of pancreatic cancer may be complementary to K-ras mutation.
Gastrointest Endosc， 2000:51:708-13
3 Tateishi K, Tada M, Yamagata M, Isayama H, Komatsu Y, Komatsu Y, Kawabe T, Shiratori Y, Omata M. High proportion of mutation
K-ras gene in pancreatic juice of patients with pancreatic cystic lesions. Gut，1999; 45:737-40
4 孙城谊，张延龄，施达仁，陆洪珍.胰腺癌ras癌基因及p53抑癌基因表达的临床意义.华人消化杂志，1998；6(特刊7)：237-239, 百拇医药(徐永泉1 刘香2 夏玉亭3)