端粒酶与肿瘤
王伟,首都医科大学附属北京同仁医院泌尿外科 北京市 100370
刘俊平,Baker Medical Research Institute, P.O.Box 6492, Melbourne 8008, Australia
项目负责人 王伟,100370， 北京市，首都医科大学附属北京同仁医院泌尿外科. medtrip@163.com
收稿日期 2002-01-09 接受日期 2002-02-12
王伟, 刘俊平.端粒酶与肿瘤.世界华人消化杂志 2002;10(6):683-688
0 引言目前端粒酶的调节及其在肿瘤发生发展中的作用已成为生命科学研究的一个热点.本文总结了近几年来有关端粒酶活性调节机制及其在肿瘤发生发展中作用的研究进展.
1 端粒、端粒酶的结构与功能
1.1 端粒 端粒 (telomere),也称端粒体,是真核细胞线形染色体末端的一种特殊结构,由端粒DNA和端粒蛋白质构成,其端粒DNA是富含GC的高度保守的重复核苷酸序列.人的端粒DNA序列由5'→3'方向的 (TTAGGG)n重复串联组成,大约有2～15kb.在正常情况下,随着细胞分裂,端粒的进行性缩短会诱发一系列分子事件,最终导致细胞凋亡.首先,端粒的进行性缩短会导致端粒相关分子结构的改变；其次,端粒的进行性缩短会破坏端粒末端效应,导致端粒附近某些基因的异常表达.另外,虽然端粒序列不含功能基因,但是如果没有这些类似染色体的"帽子"结构的端粒,染色体之间就会出现端-端融合、降解、重排和染色体丢失等变化,这些变化影响染色体的正确复制和细胞的生存.端粒还充当细胞有丝分裂中的作用,可以记录细胞有丝分裂的次数.同时他还监视DNA的丧失,以保持基因的稳定性.这些机制解释了当端粒缩短到一定程度后,细胞就会停止分裂,进入终止期.如果端粒进一步缩短,就会造成基因组失恒,诱发凋亡.
1.2 端粒酶 端粒酶(或端粒体酶)是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶,主要成分是RNA和蛋白质,其含有引物特异识别位点,能以自身RNA为模板,合成端粒DNA并加到染色体末端,使端粒延长,从而延长细胞的寿命甚至使其永生化[1].在细胞有丝分裂过程中,伴随部分端粒序列的丢失,端粒长度缩短.当端粒缩短到一定长度,可能触发某种信号,使细胞进入第一致死期M1,此时细胞不再分裂,退出细胞周期而死亡.如果细胞被病毒转染,或者某些抑癌基因如p53、RB等突变,细胞可越过M1期而继续分裂,端粒继续缩短,最终达到一个关键阈值,细胞进入第二致死期M2,这时染色体可能出现形态异常,某些细胞由于端粒太短而失去功能,导致细胞死亡.但极少数细胞在此阶段进一步激活端粒酶,使端粒功能得以恢复,维持了染色体的稳定,从而避免死亡,具有无限增生的能力.这就是目前著名的端粒与端粒酶假说.尽管迄今还不知道端粒酶激活的具体过程,但这一假说已被一些研究证实,提示端粒酶再激活可能参与细胞的癌变过程.最近Shay et al[2]在Science上发表了一幅有趣的模式图,简要介绍了端粒、端粒酶介导细胞凋亡或永生化的过程.
大量的证据表明,端粒酶的激活或抑制会分别导致细胞永生化或进入分裂终止期.端粒酶在超过80%的永生细胞系及大多数肿瘤组织中呈激活状态[2].而端粒酶的抑制会使胚胎干细胞、骨髓造血细胞的增生受到抑制,并使肿瘤细胞系增生减弱,凋亡增加.有必要指出端粒酶对细胞增生,衰老及凋亡的调节是通过不同的途径进行的.其中端粒延长依赖性机制作用缓慢,需要多代细胞端粒的进行性缩短积累到一定程度,才会诱发细胞静止信号的激活.最近我们提出一种端粒延长非依赖性机制,其作用较快,可能涉及到端粒三级结构的改变,蛋白相互作用的改变,转位的改变等[3].
1.3 端粒酶亚单位 根据目前的研究,端粒酶至少有3个亚单位组成,RNA亚单位TR (telomerase RNA)、端粒酶催化亚单位TERT (telomerase reverse transcriptase)和TEP1 (telomerase-associated protein1).人类TERT (hTERT)是由1132个氨基酸残基组成的多肽,PI为11.3.Lundblad等在研究突变的酵母菌时发现了三种新的Est基因：Est2、Est3和Est4.对Est2基因的克隆显示其编码一个新的蛋白.异位显性分析表明这几种Est基因与端粒酶RNA基因TLC1通过相同的途径作用于端粒的复制过程,可能编码着端粒酶组分或调节端粒酶活性的因子.与此同时,Lingner et al[4]提纯了Euplotes的端粒酶,发现两种蛋白质能够与端粒酶活性联合纯化,并与端粒酶RNA表现出化学记量的关系.对编码P123亚基蛋白的基因进行克隆显示,P123与酵母Est2蛋白有极大的相似性.其他实验室独立报道了TERT在人、小鼠、四膜虫以及oxytricha trifallax中的结构特征.将其序列与P123、Est2p、Trt1p进行比较分析后发现,hTERT拥有与低等原核生物(46-90%)、小鼠(90%)高度同源的氨基酸序列[5].所有的端粒酶催化亚单位拥有一个共同的保守区域,称为T模体,位于多肽的中间和7个保守的逆转录模板(RT)的上游.敲除T模体(560FFYVTE565)或单个氨基酸变异(如F561A)会显著降低端粒酶活性[6]以及与TR的结合能力[7].另外,在延长的N末端区,还发现了另一个端粒酶特异性结构-T2模体.对T2模体的单个氨基酸残基进行选择性变异,同样也会导致端粒酶活性丧失[8].RT模宓难≡裥员湟旎峒跎賀NA模板的用量,而对RNA的结合影响不大.这些研究表明RT有助与模板重复序列结合的激活位点的形成.T, T2模体对与RNA模板稳定的特异性结合发挥重要作用[7,8].目前急待了解TERT和RNA亚单位、TERT和其他蛋白组分是如何作用的以及其他细胞因子通过何种途径调节他们的分子结构.TERT的N末端包括T 、T2模体,对端粒酶活性的分子调节起到决定性的作用.而包含RT的C末端则起到逆转录酶的作用.因此我们分别将TERT的N末端,C末端称为TE结构域,RT结构域.TE结构域包含调控因子的作用位点,可以调控TERT和端粒酶RNA亚单位的相互作用,是我们重点研究的对象.最近发现存在hTERT mRNA的不同剪接体.hTERT剪接体α在逆转录酶区A内丢失12个氨基酸,hTERTβ剪接体在逆转录酶区域B上游丢失182个碱基,造成下游的移码突变.另外一剪接体编码变异羧基.重组实验表明只有完整的hTERT转录产物才表达端粒酶活性[6].在人组织器官发育过程中,这些剪接体可能替代全长的hTERT,改变端粒酶活性.不同的hTERT蛋白也有可能组成一系列端粒酶全酶,在细胞分化不同阶段中发挥不同的生理功能.
人的TEP1有2627个氨基酸.在TEP1氨基末端是4个由30个氨基酸组成的串联重复子,他的羧基端由16个 WD-40重复子组成,之间包含一个P80同源区,可能是一个ATP结合框架.与四膜虫P80类似,TEP1与端粒酶RNA亚基结合[9].而且,hTEP1可与p123/Est2p的同源蛋白hTERT免疫共沉淀,并和端粒酶活性有关[9-11].如果TEP1与端粒酶RNA及其催化亚基的相互作用介导蛋白、蛋白相互作用,那么TEP1可能决定端粒酶全酶的三级或四级结构,或作为端粒酶调节因子的募集蛋白.因此,鉴定出与hTEP1相互作用的因子有助于了解端粒酶全酶的结构和调控端粒酶全酶的机制.尽管TEP1可能没有直接的调节端粒酶活性的作用,但他在RNA模板和TERT的结合中起到脚手架的作用,有必要进一步的研究TEP1在各种环境下对稳定RNA,调节其代谢所起的作用.
许多物种的端粒酶RNA已被克隆,如纤毛虫,酵母,人和小鼠.人端粒酶RNA基因位于3q26.3,为单拷贝基因,由RNA聚合酶II进行转录,转录成熟产物约445nt,模板序列为5′-CUAACCCUAAC-3′.体外突变研究显示,端粒酶RNA功能区位于第44-203残基[12,13].敲除或减少端粒酶RNA亚单位会导致端粒酶抑制,端粒结构的破坏.端粒酶的抑制会使胚胎干细胞[14]、骨髓造血细胞[15]的增生受到抑制,并可使肿瘤细胞系的增生减弱,凋亡增加[16,17].
2 人端粒酶催化亚单位hTERT基因表达和调控
2.1 hTERT基因表达 端粒酶活性和hTERT基因表达高度相关.hTERT在胚胎组织体细胞中正常表达[18-20],但在大多数肿瘤组织或肿瘤细胞系中被重新激活[18,19,21,22].这与hTR,hTEP1在正常人体组织中普遍表达明显不同[16,23,24].hTERT在端粒酶阴性细胞中的异位表达也会导致端粒酶激活[6,25-27],端粒的延长,从而延长了细胞具有分裂能力的寿命[26,28,29].因此肿瘤组织中hTERT基因的从头合成成为端粒酶激活的关键的限速步骤.他被多种转录因子、抑制子、癌基因、抑癌基因调控.
应用hTERT cDNA探针,hTERT基因已从人基因文库中克隆,他至少包括35Kb DNA,编码16个外显子,15个内含子.hTERT基因转录和调节的启动子位于翻译起始点上游330bp(-330)至第2个外显子(+228)之间[30].其中59bp(-208～-150)对于维持大多数启动子活性是必须的[31].hTERT启动子富含G,C,形成5′调节性CpG岛.CpG岛在正常动物细胞中没有甲基化. 而研究发现胚胎后期CpG岛中Cyt残基的甲基化会导致转录抑制[32].值得注意的是,CpG岛的甲基化与细胞老化及肿瘤形成紧密相连.Rb和P16INK4α就是通过这种途径接受抑制性调控的.研究表明,大多数正常组织和培养细胞中hTERT中CpG岛没有甲基化,这表明端粒酶阴性细胞中hTERT表达抑制不是CpG岛甲基化介导的[33,34].在多数肿瘤组织中,CpG岛却处于甲基化状态.尽管甲基化水平与hTERT表达并不相关,使用5-azacytidine使DNA去甲基化后,可诱导hTERT表达[34].
2.2 hTERT基因的转录激活 序列分析表明hTERT包含c-Myc,SP1等多个转录激活因子的结合位点,这就提示hTERT 的表达受不同转录因子的联合调节[30].
2.2.1 c-Myc c-Myc可以直接结合hTERT 启动子区的E-box[31,35,36],促进人正常上皮细胞和双倍体纤维母细胞 hTERT的表达,激活端粒酶.用针对c-Myc mRNA的反义核酸作用于人白血病细胞可导致端粒酶活性下降[37].c-Myc对hTERT 启动子的激活作用可能是由于hTERT 启动子对c-Myc局部回收作用,因为使用蛋白合成阻断剂cycloheximide并不能阻断c-Myc对hTERT 启动子的激活[38].
2.2.2 SP1 SP1是通过作用于启动子和增强子上的GC-box,来激活看家基因、细胞周期调控基因,同时可防止CpG岛的甲基化[39].对TERT启动子区结构和功能的分析显示,E-box、GC-box对于TERT转录的发动同样重要[40].SP1的过度表达会明显增强TERT转录[40].将TERT启动子和SP1联合转染入SP1阴性细胞,会导致TERT转录增强.另外因为SP1和抑制子SP3可在同一细胞中表达,有共同的DNA结合位点[39],因此有必要进一步探讨他们对TERT基因转录的联合调控作用.
2.2.3 性激素 性激素是通过经典的激素受体途径调节hTERT基因表达. hTERT启动子上存在雌激素作用位点 (ERE).用E2处理ER阳性的卵巢上皮细胞3h后,雌激素受体 ERα就会结合到 ERE区,同时观察到原先端粒酶阴性的上皮细胞hTERT启动子活性增强,端粒酶活性增强.除了对hTERT启动子的直接作用,雌激素和孕激素也可通过其他信号传导通路调节端粒酶活性.如E2可以通过上调c-myc基因表达,进而增强c-myc对hTERT E-box的作用[41].
此外发现多种因素,如人HPV16 E6蛋白转染人角质细胞的早期几代[42],SV40或v-Ki-ras在人前列腺上皮细胞,前列腺内皮细胞,脐带静脉纤维母细胞中的表达[43,44],Bcl-2在人癌细胞中过度表达均可上调端粒酶活性[45].
2.3 TERT基因的转录抑制
2.3.1 hTERT抑制子 大量研究表明hTERT抑制子位于3号染色体,而不是以前所认为的7,8,11,12,或20号染色体[46,47]. 将3号染色体导入肾癌细胞系[48,49],乳癌细胞系[50]会导致hTERT表达的抑制.设想中的hTERT抑制基因位于染色体3p14.2-p21.3[49,51].
2.3.2 Mad Oh等运用表达克隆技术发现转录因子Mad是hTERT的直接负调节因子[38].Mad是通过作用于E-box来抑制hTERT转录,因为如果敲除或使E-box变异会降低Mad的抑制作用.Mad在端粒酶表达阴性的人正常肾组织和人胚胎肺细胞WI-38中高度表达,而轻度表达于端粒酶阳性的肿瘤细胞[38,52].Myc的作用正好相反,而且Myc还可拮抗Mad对hTERT的负调控作用[38].
2.3.3 P53 将P53导入肿瘤细胞会导致hTERT mRNA和端粒酶活性的明显抑制[53,54].内源性P53的激活也会明显抑制hTERT启动子活性.进一步的研究表明P53是通过直接与SP1作用来抑制端粒酶活性,而不是通过影响P21的转录来间接抑制端粒酶活性.全长的野生型P53与SP1结合会阻断SP1对hTERT启动子的作用.SP1结合位点的变异可抑制P53的作用[55].
2.3.4 TERT mRNA的不同剪接体 hTERT基因的转录也参与端粒酶活性的调节.现已在不同的组织和细胞中发现不同的hTERT mRNA的剪接体[56-58].由于几个剪切点位于保守的逆转录酶区域内,这些剪接体有可能没有活性. 正常及肿瘤组织均表达hTERT mRNA的不同剪接体,肿瘤组织只有完整表达逆转录区域的hTERT mRNA才表现出端粒酶活性.有些正常组织虽完整表达逆转录区域的hTERT mRNA,却无端粒酶活性,提示正常组织在基因转录下游存在抑制端粒酶活性的机制,而此机制在肿瘤形成过程中丧失[6,58].
此外还发现在RB/P53阴性的肿瘤细胞中重新表达Rb蛋白,会导致端粒酶抑制和细胞死亡.在人鳞状细胞癌中过度表达全长Rb也会造成端粒酶活性下调. 而且在人永生化角质细胞和人角质瘤细胞中过度表达P21WAF1会下调端粒酶活性.除P21可能通过下调hTR基因表达抑制端粒酶活性外,目前还不清楚上述因素调节端粒酶活性的机制.总之,癌细胞中端粒酶活性及活性的维持可能是多种因素在多个水平对不同分子靶作用的结果.
3 翻译后修饰：蛋白磷酸化与去磷酸化蛋白质磷酸化是决定蛋白质结构和功能的非常重要的翻译后机制.蛋白磷酸酯酶2A (PP2A) 可显著抑制端粒酶活性[59],非特异性蛋白磷酸酶如碱性磷酸酶和黑色素瘤细胞共孵也可抑制端粒酶活性,并且可被PP2A抑制剂拮抗.提示去磷酸化使端粒酶成为失活构相,蛋白磷酸化可恢复端粒酶活性.因此端粒酶以失活/激活两种状态存在,蛋白磷酸化/去磷酸化对两种状态进行转化.
利用亲和层析已证明,hTERT和hTEP1不与cdc2激酶、casin激酶IIα和ERK结合,而与蛋白激酶Cα紧密结合,提示PKCα可能参与调节端粒酶的活性和结构.免疫共沉淀研究表明PP2A可去磷酸化hTERT和hTEP1,PKCα可将两者磷酸化.进一步研究表明,纯化的重组PKCα以ATP依赖形式显著提高PP2A抑制的端粒酶活性[11].上述证据说明PKCα介导的磷酸化在端粒酶全酶的装配及活化过程中起重要作用.此外,尽管cdc2激酶和DNA依赖的蛋白激酶无上述效应,PKCδ、PKCε、PKCζ均可在PP2A去磷酸化后重新激活端粒酶[11].
PKC刺激剂phorbol myristate acetate (PMA)可提高培养的外周血单核细胞端粒酶活性,而PKC抑制剂bisindolylmaleimide可下调B细胞活化过程中升高的端粒酶活性.因此可以认为,PKC和PP2A 在调控端粒酶活性机制中起相反的作用.在乳腺癌细胞中,癌基因和促癌物可显著提高PKC活性,降低PP2A活性[61].这与PKC和PP2A对端粒酶的调节一致,也与在肿瘤形成过程中PKC激活和PP2A抑制之间的平衡相一致[62].
此外,蛋白激酶B (PKB或Akt)也上调端粒酶活性[60].PKB可磷酸化hTERT肽链AVRIRGKSYV, 激活端粒酶.用蛋白磷酸酶抑制剂okadaic acid处理人黑色素瘤细胞激活hTERT肽链磷酸化,激活端粒酶.而PI3激酶抑制剂wortmannin抑制蛋白磷酸化并下调端粒酶活性.这些结果提示hTERT 824位上丝氨酸残基可被PKB磷酸化,而且此磷酸化也参与生长因子活化PI3激酶信号途径[60].所以,在细胞老化和肿瘤形成过程中,PKB可能作用于细胞凋亡和增生途径中包括端粒酶在内的多个分子靶.
最近,Kharbanda et al[63]研究发现酪氨酸激酶c-Ab1可使hTERT酪氨酸残基磷酸化,导致端粒酶抑制.C-Ab1通过其SH3结构域与富含脯氨酸的hTERT模体(308PSTSRPPRP310)相作用,导致酪氨酸磷酸化.在人293细胞或鼠胚胎纤维母细胞中的C-Ab1暂时性高表达会导致端粒酶活性抑制.如去除鼠胚胎纤维母细胞中的C-Ab1则会使端粒延长.因为DNA受损后,hTERT会被DNA依赖性蛋白激酶和ATM激酶激活,因此可以设想DNA受损后,可能通过DNA依赖性蛋白激酶/TERT/信号途径来抑制细胞增生.新近发现的DNA依赖性蛋白激酶缺乏总会伴有较长的端粒也可证明此点[64].
4 hTERT的细胞内转运
Seimiya et al[65]利用hTERT C末端区129个氨基酸到HeLa 细胞和人睾丸细胞文库中杂交,发现14-3-3蛋白与hTERT C末端结合,促进hTERT转运到核内. 14-3-3蛋白的C末端与hTERT C末端由Ser/Thr组成的α螺旋结合,α螺旋上3个Ser/Thr的变异会阻碍与14-3-3蛋白结合,以至hTERT无法运入核内.序列分析显示hTERT上有富含Leu的核外运信号区(NES,hTERT970-981),其N末端有14-3-3的结合位点.NES通过与CRM1 (chromosome region maintenance 1)或exportin的结合,促进hTERT外运.应用CRM1/exportin 的抑制剂Leptomycin会阻止hTERT的外运[65].
5 端粒酶各亚单位分子间的相互作用
大量的证据表明端粒酶活性受转录后机制调控.翻译后,端粒酶全酶的组装,功能活性的维持都需要和其他蛋白的相互作用.由于端粒酶的半衰期达数小时,直接的蛋白相互作用导致全酶构相的改变有可能调控其活性.至今还不清楚端粒酶全酶内蛋白相互作用的方式.
5.1 TEIPP1 在hTEP1氨基末端区域的一段多肽(aa 385-399)在体外能特异性抑制端粒酶活性,这段多肽被命名为端粒酶抑制性多肽1 (telomerase inhibitory polypeptide 1,TEIPP1),在亲和柱上他与完整的全长hTEP1结合,提示在体内有可能与hTEP1形成寡聚体,从而调节端粒酶活性[66].由上可知hTEP1有可能作为hTR、hTERT、端粒酶底物和其他可能的调节因子新陈代谢和组装的支架.
5.2 TEIPP2 此外,从hTERT里合成的多肽641GARTFRREKRAERLTSRVK659,称为TEIPP2,对端粒酶活性有明显的浓度依赖性抑制.这种抑制随端粒酶提取物的浓度升高而被逆转,但与端粒酶底物DNA的浓度无关.这表明这种抑制作用发生于端粒酶全酶复合体各蛋白组分之间,而不发生于端粒酶与其底物DNA之间.
5.3 P53 已经证实野生或重组抑癌基因P53蛋白与hTEP1免疫共沉淀,而且重组P53蛋白不仅与hTEP1结合,还抑制端粒酶活性,完整的P53羧基末端是抑制端粒酶活性所必须的[66].同时发现,P53抑制端粒酶活性可被TEIPP1取消,进一步提示P53与hTEP1发生相互作用.这些证据说明端粒酶可能是P53的靶因子.这与过度日晒后人皮肤细胞P53发生特异突变,端粒酶激活的现象一致.因此,P53可能通过控制端粒酶活性而促进细胞死亡,下调P53或干扰P53与端粒酶的相互作用可活化端粒酶,使细胞发生永生化[67,68].
5.4 P23,HSP90 利用hTERT氨基酸末端(氨基酸1-195)进行酵母双杂交,发现陪伴蛋白P23与hTERT结合[69].另外,有研究发现HSP90与hTERT免疫共沉淀. P23,HSP90对端粒酶全酶的组装及活性的维持是必须的,若去除P23会抑制端粒酶活性.纯化后的P23,HSP90可有效的完成端粒酶的组装.而应用HSP90抑制剂 geldanamycin会抑制P23和hTERT结合[69].由上可见端粒酶全酶的组装是一个ATP依赖性从头合成过程,并需要在P23,HSP90的作用下转为活性构相.
很多研究证实TRF1[70,71]、酵母Rap1p[72]和Taz1p[73]是调节端粒酶活性的重要因子.在端粒酶阳性肿瘤细胞中长期表达TRF1,可顺式抑制端粒酶活性,端粒持续缩短.在酵母中,Rap1p与端粒结合后会导致端粒缩短,且端粒缩短程度与结合的Rap1p分子数成比例.破坏或去除Taz1p基因可延长端粒长度.说明酵母Rap1p和Taz1p可能以与TRF1类似的机制作为端粒长度的负调节因子.此外,Smith等还分离出一个TRF1结合蛋白 (Tankyrase)[74,75].Tankyrase属于ADP多聚酶,在端粒上催化TRF1的ADP-核糖化,使得Tankyrase与TRF1均脱离端粒,不再影响端粒酶的作用.有些组织表达有功能的端粒酶复合体,却无端粒酶活性,这可能与TRF1和Tankyrase相互作用有关.
端粒酶活性对于端粒及基因组的稳定起到重要作用.端粒酶的激活是一个多因子参与的多水平的调节过程,涉及TERT基因的重头转录,TERT mRNA的适当剪接,TERT蛋白质翻译后修饰,以及将全长的TERT蛋白组装为全酶等.每一项调节均涉及复杂的相互作用,这就导致了端粒酶活性在细胞增生及恶变的各个时相均发挥不同的作用.TERT基因的调节最可能发生于启动子水平.各种癌基因或抑癌基因可以调节hTERT基因表达.TERT翻译表达后,与14-3-3蛋白结合被输运入核,避免了被CRM1外运.在HSP作用下,端粒酶经过恰当的组装,并在PKC,PKB的磷酸化作用下激活.而TEIPP1,肿瘤抑制因子P53,PP2A所致的去磷酸化,C-Ab1所介导的Tyr磷酸化都会导致hTERT基因表达的下调,继而抑制端粒酶活性.无疑,对端粒酶活性调节机制的深入了解有助于认识端粒酶在肿瘤发生发展中的意义,从而针对端粒酶的激活途径,设计抗肿瘤的新策略.
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刘俊平,Baker Medical Research Institute, P.O.Box 6492, Melbourne 8008, Australia
项目负责人 王伟,100370， 北京市，首都医科大学附属北京同仁医院泌尿外科. medtrip@163.com
收稿日期 2002-01-09 接受日期 2002-02-12
王伟, 刘俊平.端粒酶与肿瘤.世界华人消化杂志 2002;10(6):683-688
0 引言目前端粒酶的调节及其在肿瘤发生发展中的作用已成为生命科学研究的一个热点.本文总结了近几年来有关端粒酶活性调节机制及其在肿瘤发生发展中作用的研究进展.
1 端粒、端粒酶的结构与功能
1.1 端粒 端粒 (telomere),也称端粒体,是真核细胞线形染色体末端的一种特殊结构,由端粒DNA和端粒蛋白质构成,其端粒DNA是富含GC的高度保守的重复核苷酸序列.人的端粒DNA序列由5'→3'方向的 (TTAGGG)n重复串联组成,大约有2～15kb.在正常情况下,随着细胞分裂,端粒的进行性缩短会诱发一系列分子事件,最终导致细胞凋亡.首先,端粒的进行性缩短会导致端粒相关分子结构的改变；其次,端粒的进行性缩短会破坏端粒末端效应,导致端粒附近某些基因的异常表达.另外,虽然端粒序列不含功能基因,但是如果没有这些类似染色体的"帽子"结构的端粒,染色体之间就会出现端-端融合、降解、重排和染色体丢失等变化,这些变化影响染色体的正确复制和细胞的生存.端粒还充当细胞有丝分裂中的作用,可以记录细胞有丝分裂的次数.同时他还监视DNA的丧失,以保持基因的稳定性.这些机制解释了当端粒缩短到一定程度后,细胞就会停止分裂,进入终止期.如果端粒进一步缩短,就会造成基因组失恒,诱发凋亡.
1.2 端粒酶 端粒酶(或端粒体酶)是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶,主要成分是RNA和蛋白质,其含有引物特异识别位点,能以自身RNA为模板,合成端粒DNA并加到染色体末端,使端粒延长,从而延长细胞的寿命甚至使其永生化[1].在细胞有丝分裂过程中,伴随部分端粒序列的丢失,端粒长度缩短.当端粒缩短到一定长度,可能触发某种信号,使细胞进入第一致死期M1,此时细胞不再分裂,退出细胞周期而死亡.如果细胞被病毒转染,或者某些抑癌基因如p53、RB等突变,细胞可越过M1期而继续分裂,端粒继续缩短,最终达到一个关键阈值,细胞进入第二致死期M2,这时染色体可能出现形态异常,某些细胞由于端粒太短而失去功能,导致细胞死亡.但极少数细胞在此阶段进一步激活端粒酶,使端粒功能得以恢复,维持了染色体的稳定,从而避免死亡,具有无限增生的能力.这就是目前著名的端粒与端粒酶假说.尽管迄今还不知道端粒酶激活的具体过程,但这一假说已被一些研究证实,提示端粒酶再激活可能参与细胞的癌变过程.最近Shay et al[2]在Science上发表了一幅有趣的模式图,简要介绍了端粒、端粒酶介导细胞凋亡或永生化的过程.
大量的证据表明,端粒酶的激活或抑制会分别导致细胞永生化或进入分裂终止期.端粒酶在超过80%的永生细胞系及大多数肿瘤组织中呈激活状态[2].而端粒酶的抑制会使胚胎干细胞、骨髓造血细胞的增生受到抑制,并使肿瘤细胞系增生减弱,凋亡增加.有必要指出端粒酶对细胞增生,衰老及凋亡的调节是通过不同的途径进行的.其中端粒延长依赖性机制作用缓慢,需要多代细胞端粒的进行性缩短积累到一定程度,才会诱发细胞静止信号的激活.最近我们提出一种端粒延长非依赖性机制,其作用较快,可能涉及到端粒三级结构的改变,蛋白相互作用的改变,转位的改变等[3].
1.3 端粒酶亚单位 根据目前的研究,端粒酶至少有3个亚单位组成,RNA亚单位TR (telomerase RNA)、端粒酶催化亚单位TERT (telomerase reverse transcriptase)和TEP1 (telomerase-associated protein1).人类TERT (hTERT)是由1132个氨基酸残基组成的多肽,PI为11.3.Lundblad等在研究突变的酵母菌时发现了三种新的Est基因：Est2、Est3和Est4.对Est2基因的克隆显示其编码一个新的蛋白.异位显性分析表明这几种Est基因与端粒酶RNA基因TLC1通过相同的途径作用于端粒的复制过程,可能编码着端粒酶组分或调节端粒酶活性的因子.与此同时,Lingner et al[4]提纯了Euplotes的端粒酶,发现两种蛋白质能够与端粒酶活性联合纯化,并与端粒酶RNA表现出化学记量的关系.对编码P123亚基蛋白的基因进行克隆显示,P123与酵母Est2蛋白有极大的相似性.其他实验室独立报道了TERT在人、小鼠、四膜虫以及oxytricha trifallax中的结构特征.将其序列与P123、Est2p、Trt1p进行比较分析后发现,hTERT拥有与低等原核生物(46-90%)、小鼠(90%)高度同源的氨基酸序列[5].所有的端粒酶催化亚单位拥有一个共同的保守区域,称为T模体,位于多肽的中间和7个保守的逆转录模板(RT)的上游.敲除T模体(560FFYVTE565)或单个氨基酸变异(如F561A)会显著降低端粒酶活性[6]以及与TR的结合能力[7].另外,在延长的N末端区,还发现了另一个端粒酶特异性结构-T2模体.对T2模体的单个氨基酸残基进行选择性变异,同样也会导致端粒酶活性丧失[8].RT模宓难≡裥员湟旎峒跎賀NA模板的用量,而对RNA的结合影响不大.这些研究表明RT有助与模板重复序列结合的激活位点的形成.T, T2模体对与RNA模板稳定的特异性结合发挥重要作用[7,8].目前急待了解TERT和RNA亚单位、TERT和其他蛋白组分是如何作用的以及其他细胞因子通过何种途径调节他们的分子结构.TERT的N末端包括T 、T2模体,对端粒酶活性的分子调节起到决定性的作用.而包含RT的C末端则起到逆转录酶的作用.因此我们分别将TERT的N末端,C末端称为TE结构域,RT结构域.TE结构域包含调控因子的作用位点,可以调控TERT和端粒酶RNA亚单位的相互作用,是我们重点研究的对象.最近发现存在hTERT mRNA的不同剪接体.hTERT剪接体α在逆转录酶区A内丢失12个氨基酸,hTERTβ剪接体在逆转录酶区域B上游丢失182个碱基,造成下游的移码突变.另外一剪接体编码变异羧基.重组实验表明只有完整的hTERT转录产物才表达端粒酶活性[6].在人组织器官发育过程中,这些剪接体可能替代全长的hTERT,改变端粒酶活性.不同的hTERT蛋白也有可能组成一系列端粒酶全酶,在细胞分化不同阶段中发挥不同的生理功能.
人的TEP1有2627个氨基酸.在TEP1氨基末端是4个由30个氨基酸组成的串联重复子,他的羧基端由16个 WD-40重复子组成,之间包含一个P80同源区,可能是一个ATP结合框架.与四膜虫P80类似,TEP1与端粒酶RNA亚基结合[9].而且,hTEP1可与p123/Est2p的同源蛋白hTERT免疫共沉淀,并和端粒酶活性有关[9-11].如果TEP1与端粒酶RNA及其催化亚基的相互作用介导蛋白、蛋白相互作用,那么TEP1可能决定端粒酶全酶的三级或四级结构,或作为端粒酶调节因子的募集蛋白.因此,鉴定出与hTEP1相互作用的因子有助于了解端粒酶全酶的结构和调控端粒酶全酶的机制.尽管TEP1可能没有直接的调节端粒酶活性的作用,但他在RNA模板和TERT的结合中起到脚手架的作用,有必要进一步的研究TEP1在各种环境下对稳定RNA,调节其代谢所起的作用.
许多物种的端粒酶RNA已被克隆,如纤毛虫,酵母,人和小鼠.人端粒酶RNA基因位于3q26.3,为单拷贝基因,由RNA聚合酶II进行转录,转录成熟产物约445nt,模板序列为5′-CUAACCCUAAC-3′.体外突变研究显示,端粒酶RNA功能区位于第44-203残基[12,13].敲除或减少端粒酶RNA亚单位会导致端粒酶抑制,端粒结构的破坏.端粒酶的抑制会使胚胎干细胞[14]、骨髓造血细胞[15]的增生受到抑制,并可使肿瘤细胞系的增生减弱,凋亡增加[16,17].
2 人端粒酶催化亚单位hTERT基因表达和调控
2.1 hTERT基因表达 端粒酶活性和hTERT基因表达高度相关.hTERT在胚胎组织体细胞中正常表达[18-20],但在大多数肿瘤组织或肿瘤细胞系中被重新激活[18,19,21,22].这与hTR,hTEP1在正常人体组织中普遍表达明显不同[16,23,24].hTERT在端粒酶阴性细胞中的异位表达也会导致端粒酶激活[6,25-27],端粒的延长,从而延长了细胞具有分裂能力的寿命[26,28,29].因此肿瘤组织中hTERT基因的从头合成成为端粒酶激活的关键的限速步骤.他被多种转录因子、抑制子、癌基因、抑癌基因调控.
应用hTERT cDNA探针,hTERT基因已从人基因文库中克隆,他至少包括35Kb DNA,编码16个外显子,15个内含子.hTERT基因转录和调节的启动子位于翻译起始点上游330bp(-330)至第2个外显子(+228)之间[30].其中59bp(-208～-150)对于维持大多数启动子活性是必须的[31].hTERT启动子富含G,C,形成5′调节性CpG岛.CpG岛在正常动物细胞中没有甲基化. 而研究发现胚胎后期CpG岛中Cyt残基的甲基化会导致转录抑制[32].值得注意的是,CpG岛的甲基化与细胞老化及肿瘤形成紧密相连.Rb和P16INK4α就是通过这种途径接受抑制性调控的.研究表明,大多数正常组织和培养细胞中hTERT中CpG岛没有甲基化,这表明端粒酶阴性细胞中hTERT表达抑制不是CpG岛甲基化介导的[33,34].在多数肿瘤组织中,CpG岛却处于甲基化状态.尽管甲基化水平与hTERT表达并不相关,使用5-azacytidine使DNA去甲基化后,可诱导hTERT表达[34].
2.2 hTERT基因的转录激活 序列分析表明hTERT包含c-Myc,SP1等多个转录激活因子的结合位点,这就提示hTERT 的表达受不同转录因子的联合调节[30].
2.2.1 c-Myc c-Myc可以直接结合hTERT 启动子区的E-box[31,35,36],促进人正常上皮细胞和双倍体纤维母细胞 hTERT的表达,激活端粒酶.用针对c-Myc mRNA的反义核酸作用于人白血病细胞可导致端粒酶活性下降[37].c-Myc对hTERT 启动子的激活作用可能是由于hTERT 启动子对c-Myc局部回收作用,因为使用蛋白合成阻断剂cycloheximide并不能阻断c-Myc对hTERT 启动子的激活[38].
2.2.2 SP1 SP1是通过作用于启动子和增强子上的GC-box,来激活看家基因、细胞周期调控基因,同时可防止CpG岛的甲基化[39].对TERT启动子区结构和功能的分析显示,E-box、GC-box对于TERT转录的发动同样重要[40].SP1的过度表达会明显增强TERT转录[40].将TERT启动子和SP1联合转染入SP1阴性细胞,会导致TERT转录增强.另外因为SP1和抑制子SP3可在同一细胞中表达,有共同的DNA结合位点[39],因此有必要进一步探讨他们对TERT基因转录的联合调控作用.
2.2.3 性激素 性激素是通过经典的激素受体途径调节hTERT基因表达. hTERT启动子上存在雌激素作用位点 (ERE).用E2处理ER阳性的卵巢上皮细胞3h后,雌激素受体 ERα就会结合到 ERE区,同时观察到原先端粒酶阴性的上皮细胞hTERT启动子活性增强,端粒酶活性增强.除了对hTERT启动子的直接作用,雌激素和孕激素也可通过其他信号传导通路调节端粒酶活性.如E2可以通过上调c-myc基因表达,进而增强c-myc对hTERT E-box的作用[41].
此外发现多种因素,如人HPV16 E6蛋白转染人角质细胞的早期几代[42],SV40或v-Ki-ras在人前列腺上皮细胞,前列腺内皮细胞,脐带静脉纤维母细胞中的表达[43,44],Bcl-2在人癌细胞中过度表达均可上调端粒酶活性[45].
2.3 TERT基因的转录抑制
2.3.1 hTERT抑制子 大量研究表明hTERT抑制子位于3号染色体,而不是以前所认为的7,8,11,12,或20号染色体[46,47]. 将3号染色体导入肾癌细胞系[48,49],乳癌细胞系[50]会导致hTERT表达的抑制.设想中的hTERT抑制基因位于染色体3p14.2-p21.3[49,51].
2.3.2 Mad Oh等运用表达克隆技术发现转录因子Mad是hTERT的直接负调节因子[38].Mad是通过作用于E-box来抑制hTERT转录,因为如果敲除或使E-box变异会降低Mad的抑制作用.Mad在端粒酶表达阴性的人正常肾组织和人胚胎肺细胞WI-38中高度表达,而轻度表达于端粒酶阳性的肿瘤细胞[38,52].Myc的作用正好相反,而且Myc还可拮抗Mad对hTERT的负调控作用[38].
2.3.3 P53 将P53导入肿瘤细胞会导致hTERT mRNA和端粒酶活性的明显抑制[53,54].内源性P53的激活也会明显抑制hTERT启动子活性.进一步的研究表明P53是通过直接与SP1作用来抑制端粒酶活性,而不是通过影响P21的转录来间接抑制端粒酶活性.全长的野生型P53与SP1结合会阻断SP1对hTERT启动子的作用.SP1结合位点的变异可抑制P53的作用[55].
2.3.4 TERT mRNA的不同剪接体 hTERT基因的转录也参与端粒酶活性的调节.现已在不同的组织和细胞中发现不同的hTERT mRNA的剪接体[56-58].由于几个剪切点位于保守的逆转录酶区域内,这些剪接体有可能没有活性. 正常及肿瘤组织均表达hTERT mRNA的不同剪接体,肿瘤组织只有完整表达逆转录区域的hTERT mRNA才表现出端粒酶活性.有些正常组织虽完整表达逆转录区域的hTERT mRNA,却无端粒酶活性,提示正常组织在基因转录下游存在抑制端粒酶活性的机制,而此机制在肿瘤形成过程中丧失[6,58].
此外还发现在RB/P53阴性的肿瘤细胞中重新表达Rb蛋白,会导致端粒酶抑制和细胞死亡.在人鳞状细胞癌中过度表达全长Rb也会造成端粒酶活性下调. 而且在人永生化角质细胞和人角质瘤细胞中过度表达P21WAF1会下调端粒酶活性.除P21可能通过下调hTR基因表达抑制端粒酶活性外,目前还不清楚上述因素调节端粒酶活性的机制.总之,癌细胞中端粒酶活性及活性的维持可能是多种因素在多个水平对不同分子靶作用的结果.
3 翻译后修饰：蛋白磷酸化与去磷酸化蛋白质磷酸化是决定蛋白质结构和功能的非常重要的翻译后机制.蛋白磷酸酯酶2A (PP2A) 可显著抑制端粒酶活性[59],非特异性蛋白磷酸酶如碱性磷酸酶和黑色素瘤细胞共孵也可抑制端粒酶活性,并且可被PP2A抑制剂拮抗.提示去磷酸化使端粒酶成为失活构相,蛋白磷酸化可恢复端粒酶活性.因此端粒酶以失活/激活两种状态存在,蛋白磷酸化/去磷酸化对两种状态进行转化.
利用亲和层析已证明,hTERT和hTEP1不与cdc2激酶、casin激酶IIα和ERK结合,而与蛋白激酶Cα紧密结合,提示PKCα可能参与调节端粒酶的活性和结构.免疫共沉淀研究表明PP2A可去磷酸化hTERT和hTEP1,PKCα可将两者磷酸化.进一步研究表明,纯化的重组PKCα以ATP依赖形式显著提高PP2A抑制的端粒酶活性[11].上述证据说明PKCα介导的磷酸化在端粒酶全酶的装配及活化过程中起重要作用.此外,尽管cdc2激酶和DNA依赖的蛋白激酶无上述效应,PKCδ、PKCε、PKCζ均可在PP2A去磷酸化后重新激活端粒酶[11].
PKC刺激剂phorbol myristate acetate (PMA)可提高培养的外周血单核细胞端粒酶活性,而PKC抑制剂bisindolylmaleimide可下调B细胞活化过程中升高的端粒酶活性.因此可以认为,PKC和PP2A 在调控端粒酶活性机制中起相反的作用.在乳腺癌细胞中,癌基因和促癌物可显著提高PKC活性,降低PP2A活性[61].这与PKC和PP2A对端粒酶的调节一致,也与在肿瘤形成过程中PKC激活和PP2A抑制之间的平衡相一致[62].
此外,蛋白激酶B (PKB或Akt)也上调端粒酶活性[60].PKB可磷酸化hTERT肽链AVRIRGKSYV, 激活端粒酶.用蛋白磷酸酶抑制剂okadaic acid处理人黑色素瘤细胞激活hTERT肽链磷酸化,激活端粒酶.而PI3激酶抑制剂wortmannin抑制蛋白磷酸化并下调端粒酶活性.这些结果提示hTERT 824位上丝氨酸残基可被PKB磷酸化,而且此磷酸化也参与生长因子活化PI3激酶信号途径[60].所以,在细胞老化和肿瘤形成过程中,PKB可能作用于细胞凋亡和增生途径中包括端粒酶在内的多个分子靶.
最近,Kharbanda et al[63]研究发现酪氨酸激酶c-Ab1可使hTERT酪氨酸残基磷酸化,导致端粒酶抑制.C-Ab1通过其SH3结构域与富含脯氨酸的hTERT模体(308PSTSRPPRP310)相作用,导致酪氨酸磷酸化.在人293细胞或鼠胚胎纤维母细胞中的C-Ab1暂时性高表达会导致端粒酶活性抑制.如去除鼠胚胎纤维母细胞中的C-Ab1则会使端粒延长.因为DNA受损后,hTERT会被DNA依赖性蛋白激酶和ATM激酶激活,因此可以设想DNA受损后,可能通过DNA依赖性蛋白激酶/TERT/信号途径来抑制细胞增生.新近发现的DNA依赖性蛋白激酶缺乏总会伴有较长的端粒也可证明此点[64].
4 hTERT的细胞内转运
Seimiya et al[65]利用hTERT C末端区129个氨基酸到HeLa 细胞和人睾丸细胞文库中杂交,发现14-3-3蛋白与hTERT C末端结合,促进hTERT转运到核内. 14-3-3蛋白的C末端与hTERT C末端由Ser/Thr组成的α螺旋结合,α螺旋上3个Ser/Thr的变异会阻碍与14-3-3蛋白结合,以至hTERT无法运入核内.序列分析显示hTERT上有富含Leu的核外运信号区(NES,hTERT970-981),其N末端有14-3-3的结合位点.NES通过与CRM1 (chromosome region maintenance 1)或exportin的结合,促进hTERT外运.应用CRM1/exportin 的抑制剂Leptomycin会阻止hTERT的外运[65].
5 端粒酶各亚单位分子间的相互作用
大量的证据表明端粒酶活性受转录后机制调控.翻译后,端粒酶全酶的组装,功能活性的维持都需要和其他蛋白的相互作用.由于端粒酶的半衰期达数小时,直接的蛋白相互作用导致全酶构相的改变有可能调控其活性.至今还不清楚端粒酶全酶内蛋白相互作用的方式.
5.1 TEIPP1 在hTEP1氨基末端区域的一段多肽(aa 385-399)在体外能特异性抑制端粒酶活性,这段多肽被命名为端粒酶抑制性多肽1 (telomerase inhibitory polypeptide 1,TEIPP1),在亲和柱上他与完整的全长hTEP1结合,提示在体内有可能与hTEP1形成寡聚体,从而调节端粒酶活性[66].由上可知hTEP1有可能作为hTR、hTERT、端粒酶底物和其他可能的调节因子新陈代谢和组装的支架.
5.2 TEIPP2 此外,从hTERT里合成的多肽641GARTFRREKRAERLTSRVK659,称为TEIPP2,对端粒酶活性有明显的浓度依赖性抑制.这种抑制随端粒酶提取物的浓度升高而被逆转,但与端粒酶底物DNA的浓度无关.这表明这种抑制作用发生于端粒酶全酶复合体各蛋白组分之间,而不发生于端粒酶与其底物DNA之间.
5.3 P53 已经证实野生或重组抑癌基因P53蛋白与hTEP1免疫共沉淀,而且重组P53蛋白不仅与hTEP1结合,还抑制端粒酶活性,完整的P53羧基末端是抑制端粒酶活性所必须的[66].同时发现,P53抑制端粒酶活性可被TEIPP1取消,进一步提示P53与hTEP1发生相互作用.这些证据说明端粒酶可能是P53的靶因子.这与过度日晒后人皮肤细胞P53发生特异突变,端粒酶激活的现象一致.因此,P53可能通过控制端粒酶活性而促进细胞死亡,下调P53或干扰P53与端粒酶的相互作用可活化端粒酶,使细胞发生永生化[67,68].
5.4 P23,HSP90 利用hTERT氨基酸末端(氨基酸1-195)进行酵母双杂交,发现陪伴蛋白P23与hTERT结合[69].另外,有研究发现HSP90与hTERT免疫共沉淀. P23,HSP90对端粒酶全酶的组装及活性的维持是必须的,若去除P23会抑制端粒酶活性.纯化后的P23,HSP90可有效的完成端粒酶的组装.而应用HSP90抑制剂 geldanamycin会抑制P23和hTERT结合[69].由上可见端粒酶全酶的组装是一个ATP依赖性从头合成过程,并需要在P23,HSP90的作用下转为活性构相.
很多研究证实TRF1[70,71]、酵母Rap1p[72]和Taz1p[73]是调节端粒酶活性的重要因子.在端粒酶阳性肿瘤细胞中长期表达TRF1,可顺式抑制端粒酶活性,端粒持续缩短.在酵母中,Rap1p与端粒结合后会导致端粒缩短,且端粒缩短程度与结合的Rap1p分子数成比例.破坏或去除Taz1p基因可延长端粒长度.说明酵母Rap1p和Taz1p可能以与TRF1类似的机制作为端粒长度的负调节因子.此外,Smith等还分离出一个TRF1结合蛋白 (Tankyrase)[74,75].Tankyrase属于ADP多聚酶,在端粒上催化TRF1的ADP-核糖化,使得Tankyrase与TRF1均脱离端粒,不再影响端粒酶的作用.有些组织表达有功能的端粒酶复合体,却无端粒酶活性,这可能与TRF1和Tankyrase相互作用有关.
端粒酶活性对于端粒及基因组的稳定起到重要作用.端粒酶的激活是一个多因子参与的多水平的调节过程,涉及TERT基因的重头转录,TERT mRNA的适当剪接,TERT蛋白质翻译后修饰,以及将全长的TERT蛋白组装为全酶等.每一项调节均涉及复杂的相互作用,这就导致了端粒酶活性在细胞增生及恶变的各个时相均发挥不同的作用.TERT基因的调节最可能发生于启动子水平.各种癌基因或抑癌基因可以调节hTERT基因表达.TERT翻译表达后,与14-3-3蛋白结合被输运入核,避免了被CRM1外运.在HSP作用下,端粒酶经过恰当的组装,并在PKC,PKB的磷酸化作用下激活.而TEIPP1,肿瘤抑制因子P53,PP2A所致的去磷酸化,C-Ab1所介导的Tyr磷酸化都会导致hTERT基因表达的下调,继而抑制端粒酶活性.无疑,对端粒酶活性调节机制的深入了解有助于认识端粒酶在肿瘤发生发展中的意义,从而针对端粒酶的激活途径,设计抗肿瘤的新策略.
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