原位种植肝癌新生血管的检测及血管内皮细胞生长因子mRMA的表达
彭林，区金锐，王卫东，孙建， 简志祥,广东省人民医院肝胆外科，广东省广州市 510080
项目负责人 彭林，510080，广东省广州市，广东省人民医院肝胆外科 pengl@21cn.com
收稿日期 2002-03-05 接受日期 2002-03-20
摘要
目的:观察大鼠原位种植肝癌模型中的新生血管的生长情况，研究肿瘤血管生长因子基因的表达和肝癌新生血管之间的关系.
方法:采用Walker256癌肉瘤接种40只Wistar大鼠制作原位种植肝癌模型，用微血管计数以及免疫组织化学染色法检测平滑肌激动蛋白(α-SMA)的表达来标志肿瘤新生血管.血管内皮细胞生长因子基因的检测采用原位杂交法进行.
结果:Walker256癌肉瘤接种后1、2、3wk肿瘤微血管密度分别为(15±4.3)/HP、(17±3.6)/HP、(45±7.8)/HP.大血管及正常微血管(毛细血管除外)周围α-SMA呈强阳性染色.在肝癌组织中可见到一些形态不规则的微血管呈弱阳性或阴性染色是肿瘤诱导的新生血管，肝癌组织有大量新生血管形成，新生血管的数量与微血管密度呈喙，Walker256癌肉瘤接种后3wk较前2wk有显著性增加.正常肝脏组织仅有少量VEGF mRNA表达，肝癌组织接种后1wk即有多种细胞表达VEGF.新生血管较密集的肿瘤组织VEGF的表达较多.VEGF的表达与微血管密度和肿瘤组织中新生血管的数量呈正相关.
结论:原位接种肝癌中有大量新生血管形成，平滑肌激动蛋白(α-SMA)的表达可以用来标记肿瘤新生血管.肝癌组织中血管内皮细胞生长因子的表达增加可能和肿瘤新生血管的形成有一定的关系.
彭林，区金锐，王卫东，孙建， 简志祥.原位种植肝癌新生血管的检测及血管内皮细胞生长因子mRMA的表达.
世界华人消化杂志 2002;10(6):717-718
0 引言成熟机体的血管一般由血管内皮细胞及其周围间质细胞如血管平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞共同构成，以维持血管结构的稳定性和适当的通透性.当机体受到创伤、肿瘤、慢性炎症、缺氧等外来或内源性因素的影响时，血管内皮细胞开始增生、迁移形成新的管状结构，然后间质细胞在其周围聚集形成新的血管.目前已知新生血管形成对于肿瘤的生长是非常重要的，如果没有血管生成，肿瘤将局限于原发部位甚至慢慢消退[1，2].由于正常情况下的血管是相对稳定的，肿瘤生长所诱导的新生血管在结构和功能上是不完善的，在某种程度上可以说肿瘤新生血管是不成熟血管.如何区分新生血管和正常血管一直是有重要意义的课题之一，UEA-1、Ⅷ因子、CD34、CD31等是常用的肿瘤血管生成的标记物[3-5]，但这些指标均无法从形态学上直接区分肿瘤新生血管.最近Benjamin发现α-SMA(平滑肌激动蛋白)可在神经胶质细胞瘤中作为新生血管和成熟血管区别的标志[6].但这一指标在肝癌血管生成中是否适用目前尚未见报道.在本实验中，我们采用原位种植肝癌模型，用免疫组织化学染色法检测肝癌组织中α-SMA的表达并分析了其表达和血管内皮细胞生长因子mRNA之间的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 取Wistar大鼠40只，体重160～180g，平均172g，雌雄兼用.取生长旺盛的Walker256癌肉瘤大鼠(上海医药工业研究院提供)，无菌条件下分离出癌组织，切成1mm3左右小块，置于DMEM培养液中备用.Wistar大鼠以3%戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉后，取仰卧位，1%活力碘消毒.上腹正中切口进腹，显露肝脏左叶部位.用眼科镊刺破肝包膜达肝实质，将肝癌组织块埋入肝脏，关腹后常规饲养.随机将大鼠分为4组，其中10只为正常对照.分别于接种后1、2、3wk各取10只开腹取肝脏及肝癌组织，立即以10%甲醛固定，24h内石蜡包埋.连续切片6μm，分别行H.E染色和免疫组织化学染色.原位杂交切片以4%多聚甲醛固定，24h内包埋切片，切片厚度4μm.
1.2 HE染色及血管密度测定 按常规行HE染色，200倍光镜下记数3个视野下微血管数目，取平均值.另记数免疫组织化学染色切片强阳性、弱阳性及阴性血管的数目，取平均值.
1.3 免疫组织化学染色 免疫组化染色采用SP法进行.第一抗体为α-SMA(平滑肌激动蛋白)单克隆抗体，工作浓度1∶40，由SANTA CRUZ公司提供.免疫组织化学染色步骤按SP试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木素轻度复染，棕褐色为阳性染色.用PBS液代替一抗作空白对照，相同浓度小牛血清代替一抗作替代对照，结果均为阴性.显色标准分强阳性、弱阳性及阴性.
1.4 原位杂交染色步骤 切片常规脱蜡至水，用0.5% H2O2/甲醇室温处理30min以灭活内源性过氧化物酶.蒸馏水洗三次.用3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化1min，PBS溶液洗涤3次，每次5min.蒸馏水洗1次.往切片组织中加入20μl经变性处理的地高辛标记的VEGF杂交探针，盖上预先硅化好的盖玻片.置于湿盒中39℃杂交16-18h.杂交反应后，用37℃左右水温的2×SSC溶液洗涤3次，每次5min.滴加杂交后稳定液，37℃，4-6h.以PBS溶液洗涤5min×3次.滴加封闭液，室温20min，不洗.滴加兔抗地高辛，20-37℃反应60min，PBS洗涤2min×3次.滴加生物素化羊抗兔IgG 20-37℃反应20min，0.5M PBS洗涤2min×3次.滴加SABC，20-37℃反应20min，0.5M PBS洗涤5min×4次.DAB显色，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片观察.
统计学处理 实验结果以均数±标准差记录，采用SAS统计分析软件行t检验和方差分析，P<0.05表示有统计学意义.
2 结果
2.1 大体及组织学观察 肝脏组织中接种Walker256癌肉瘤后1wk时即可在接种部位出现大小不等的肝癌肿块，2wk、3wk肿瘤逐渐变大，少数出现临近肝组织的转移和腹水形成.HE染色可证实肝癌的形成和大量血管形成.
2.2 微血管密度测定 Walker256癌肉瘤接种后1、2、3wk肿瘤微血管密度分别为15±4.3/HP、17±3.6/HP、45±7.8/HP，第1、2周相比无显著性差异(P>0.05)，第3周和前2wk相比则微血管数目显著增多(P<0.05).
2.3 免疫组织化学染色观察 大血管及正常微血管(毛细血管除外)由于血管内皮细胞表面有平滑肌细胞和周细胞包围，α-SMA呈强阳性染色.在肝癌组织中可见到一些形态不规则的微血管呈弱阳性或阴性染色，这种血管周围缺乏平滑肌细胞和周细胞等间质细胞，我们认为这是肿瘤诱导的新生血管.正常肝脏组织中几乎没有这种新生血管，而肝癌组织有大量新生血管的的形成.新生血管的数量与微血管密度呈正相关，Walker256癌肉瘤接种后3wk较前2wk有显著性增加.
2.4 原位杂交检测结果 正常肝脏组织仅有少量VEGF表达，肝癌组织接种后1wk即有多种细胞表达VEGF.棕黄色阳性颗粒主要定位于胞质中，以肝癌细胞为多，血管内皮细胞外间质细胞亦有少量表达.新生血管较密集的肿瘤组织VEGF的表达较多VEGF的表达与微血管密度和肿瘤组织中新生血管的数量呈正相关.
3 讨论原位种植肝癌是研究原发性肝癌较好的模型，由于肝脏本身具有很强的免疫性，大多采用组织种植的办法.接种1～2wk即能形成明显的肝癌，第3周时可见到肿瘤向周围的转移和腹水形成.从肿瘤微血管密度的检测来看，肝癌的生长和发展伴有微血管密度的增加，说明血管形成和肝癌发展有密切关系.
平滑肌激动蛋白(α-SMA)是平滑肌细胞和星状细胞等间质细胞所特有的蛋白，正常情况下除毛细血管外的微血管周围都有平滑肌细胞和周细胞等包绕.而肿瘤新生血管结构尚不完善，属于未成熟血管，周围较少或没有间质细胞，所以新生血管周围可能缺乏α-SMA表达.Benjamin发现α-SMA在神经胶质瘤中可以用来区别正常血管和新生血管，阻断VEGF的表达则新生血管的数量明显减少[6].本实验发现：肝脏组织中正常血管α-SMA呈强阳性表达包围在血管内皮细胞周围，窦状间隙亦有少量表达.在原位种植肝癌组织中可发现较多α-SMA弱阳性或阴性的血管，这种血管和正常血管相比管壁较薄，形态不规则，可见扭曲、折叠现象.我们认为这种血管就是肿瘤诱发的新生血管，由于其结构和功能尚不完善所以呈现出不规则形态.随着肿瘤的长大，这一现象越发明显且新生血管的数量和肿瘤微血管密度呈正相关，说明肿瘤在发展过程中具有诱导新生血管形成的能力.
血管内皮细胞生长因子及其受体是目前研究较多的血管生成的促进因素之一，针对阻断VEGF或其受体而采取的抗血管生成疗法对于实验性肿瘤取得了一定的疗效[7-9].由于这种抗血管生成疗法不是针对肿瘤细胞本身，不会产生耐药性[10]，具有极其广阔的应用前景.肿瘤新生血管在结构和功能上和正常血管是不同的，抗血管生成疗法的靶目标是新生血管，因此副作用很小[11].但是从实验室到临床应用还有较大的距离.我们在本研究中检测了VEGF mRNA在原位种植肝癌中的表达，发现VEGF mRNA在新生血管较密集处周围表达较多，和肿瘤微血管密度及新生血管数呈正相关.提示VEGF参与了肝癌新生血管形成的调控.肿瘤血管形成有其特殊的调控机制和信息通路，VEGF及其酪胺酸激酶受体家族是非常重要的信息通路之一.血清中VEGF的水平和肿瘤患者的预后有一定的关系[14]，使用VEGF的单克隆抗体可以抑制某些肿瘤的发展.很多细胞包括肿瘤细胞本身和周围的间质细胞都可以分泌VEGF，但以肿瘤细胞为主.本实验VEGF mRNA主要在肝癌细胞胞质中表达，且在新生血管较密集处周围表达较多.我们设想，进一步生长的需要使肿瘤细胞分泌VEGF等血管生成因子，这些因子作用于新生的血管促进血管内皮细胞增生，新生血管反过来为肿瘤组织提供营养和氧.VEGF促进血管生成的机制可能还和其作为内皮细胞的稳定剂，抑制血管内皮细胞凋亡有关[12，13].VEGF作用的靶细胞是新生血管内皮细胞，其受体亦分布于血管内皮细胞上.抑制VEGF的产生或拮抗其与受体的结合均能起到对抗肿瘤血管生成的作用.
4 参考文献1 Folkman J. Cancer: principles and practice of oncology. Lippincott-Raven Publishers. Philadelphia 1997： 3075-3085
2 Holmgren L, O'Reilly MS, Folkman J. Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence
of angiogenesis suppression. Nat Med 1995；1:149-153
3 Ruck P, Xiao JC, Kaiserling E. Immunoreactivity of sinusoids in hepatocellular carcinoma. An immunohistochemical study using lectin
UEA-1 and antibodies against endothelial markers, including CD34. Arch Pathol Lab Med 1995; 119: 173-178
4 Ito A, Nomura S, Hirota S, Suda J. Enhanced expression of CD34 messenger RNA by developing endothelial cells of mice.
Lab Invest 1995; 72: 532-538
5 Martin L, Green B, Renshaw C, Lowe D. Examining the technique of angiogenesis assessment in invasive breast cancer.
Br J Cancer 1997; 76: 1046-1054
6 Benjamin LE, Golijanin D, Itin A. Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelial
growth factor withdrawal. J Clin Invest 1999; 103: 159-165
7 Millauer B. Dominant-negative inhibition of Flk-1 suppresses the growth of many tumor types in vivo. Cancer Res 1996; 56: 1615-1620
8 Borgstrom P, Hillan KJ, Sriramarao P. Complete inhibition of angiogenesis and growth of microtumors by anti-vascular endothelial growth
factor neutralizing antibody: novel concepts of angiostatic therapy from intravital videomicroscopy. Cancer Res 1996; 56: 4032-4039
9 Borgstrom P, Bourdon MA, Hillan KJ. Neutralizing anti-vascular endothelial growth factor antibody completely inhibits angiogenesis
and growth of human prostate carcinoma micro tumors in vivo . Prostate 1998; 56:4032-4039
10 Boehm T, Folkman J, Browder T. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance.
Nature 1997; 390: 404-407
11 Denekamp J. Angiogenesis, neovascular proliferation and vascular pathophysiology as targets for cancer therapy.
Br J Radiol 1993; 66: 181-196
12 Alon T. Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for
retinopathy of prematurity. Nat Med 1995; 1: 1024-1028
13 Marx PT, Mulder AB, Van Den Bergh FA. Apoptosis inducers endotoxin and Fas-ligation enhance the expression of vascular
endothelial growth factor in human endothelial cells. Endothelium 1999;6:335-340
14 Jinno K, Tanimizu M, Hyodo L. Circulating vascular endothelial growth factor is a possible tumor marker in human hepatocellular
carcinoma. J Gastroenterol 1998; 33: 376-382, 百拇医药(彭 林，区金锐，王卫东，孙 建，简志祥)
项目负责人 彭林，510080，广东省广州市，广东省人民医院肝胆外科 pengl@21cn.com
收稿日期 2002-03-05 接受日期 2002-03-20
摘要
目的:观察大鼠原位种植肝癌模型中的新生血管的生长情况，研究肿瘤血管生长因子基因的表达和肝癌新生血管之间的关系.
方法:采用Walker256癌肉瘤接种40只Wistar大鼠制作原位种植肝癌模型，用微血管计数以及免疫组织化学染色法检测平滑肌激动蛋白(α-SMA)的表达来标志肿瘤新生血管.血管内皮细胞生长因子基因的检测采用原位杂交法进行.
结果:Walker256癌肉瘤接种后1、2、3wk肿瘤微血管密度分别为(15±4.3)/HP、(17±3.6)/HP、(45±7.8)/HP.大血管及正常微血管(毛细血管除外)周围α-SMA呈强阳性染色.在肝癌组织中可见到一些形态不规则的微血管呈弱阳性或阴性染色是肿瘤诱导的新生血管，肝癌组织有大量新生血管形成，新生血管的数量与微血管密度呈喙，Walker256癌肉瘤接种后3wk较前2wk有显著性增加.正常肝脏组织仅有少量VEGF mRNA表达，肝癌组织接种后1wk即有多种细胞表达VEGF.新生血管较密集的肿瘤组织VEGF的表达较多.VEGF的表达与微血管密度和肿瘤组织中新生血管的数量呈正相关.
结论:原位接种肝癌中有大量新生血管形成，平滑肌激动蛋白(α-SMA)的表达可以用来标记肿瘤新生血管.肝癌组织中血管内皮细胞生长因子的表达增加可能和肿瘤新生血管的形成有一定的关系.
彭林，区金锐，王卫东，孙建， 简志祥.原位种植肝癌新生血管的检测及血管内皮细胞生长因子mRMA的表达.
世界华人消化杂志 2002;10(6):717-718
0 引言成熟机体的血管一般由血管内皮细胞及其周围间质细胞如血管平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞共同构成，以维持血管结构的稳定性和适当的通透性.当机体受到创伤、肿瘤、慢性炎症、缺氧等外来或内源性因素的影响时，血管内皮细胞开始增生、迁移形成新的管状结构，然后间质细胞在其周围聚集形成新的血管.目前已知新生血管形成对于肿瘤的生长是非常重要的，如果没有血管生成，肿瘤将局限于原发部位甚至慢慢消退[1，2].由于正常情况下的血管是相对稳定的，肿瘤生长所诱导的新生血管在结构和功能上是不完善的，在某种程度上可以说肿瘤新生血管是不成熟血管.如何区分新生血管和正常血管一直是有重要意义的课题之一，UEA-1、Ⅷ因子、CD34、CD31等是常用的肿瘤血管生成的标记物[3-5]，但这些指标均无法从形态学上直接区分肿瘤新生血管.最近Benjamin发现α-SMA(平滑肌激动蛋白)可在神经胶质细胞瘤中作为新生血管和成熟血管区别的标志[6].但这一指标在肝癌血管生成中是否适用目前尚未见报道.在本实验中，我们采用原位种植肝癌模型，用免疫组织化学染色法检测肝癌组织中α-SMA的表达并分析了其表达和血管内皮细胞生长因子mRNA之间的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 取Wistar大鼠40只，体重160～180g，平均172g，雌雄兼用.取生长旺盛的Walker256癌肉瘤大鼠(上海医药工业研究院提供)，无菌条件下分离出癌组织，切成1mm3左右小块，置于DMEM培养液中备用.Wistar大鼠以3%戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉后，取仰卧位，1%活力碘消毒.上腹正中切口进腹，显露肝脏左叶部位.用眼科镊刺破肝包膜达肝实质，将肝癌组织块埋入肝脏，关腹后常规饲养.随机将大鼠分为4组，其中10只为正常对照.分别于接种后1、2、3wk各取10只开腹取肝脏及肝癌组织，立即以10%甲醛固定，24h内石蜡包埋.连续切片6μm，分别行H.E染色和免疫组织化学染色.原位杂交切片以4%多聚甲醛固定，24h内包埋切片，切片厚度4μm.
1.2 HE染色及血管密度测定 按常规行HE染色，200倍光镜下记数3个视野下微血管数目，取平均值.另记数免疫组织化学染色切片强阳性、弱阳性及阴性血管的数目，取平均值.
1.3 免疫组织化学染色 免疫组化染色采用SP法进行.第一抗体为α-SMA(平滑肌激动蛋白)单克隆抗体，工作浓度1∶40，由SANTA CRUZ公司提供.免疫组织化学染色步骤按SP试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木素轻度复染，棕褐色为阳性染色.用PBS液代替一抗作空白对照，相同浓度小牛血清代替一抗作替代对照，结果均为阴性.显色标准分强阳性、弱阳性及阴性.
1.4 原位杂交染色步骤 切片常规脱蜡至水，用0.5% H2O2/甲醇室温处理30min以灭活内源性过氧化物酶.蒸馏水洗三次.用3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化1min，PBS溶液洗涤3次，每次5min.蒸馏水洗1次.往切片组织中加入20μl经变性处理的地高辛标记的VEGF杂交探针，盖上预先硅化好的盖玻片.置于湿盒中39℃杂交16-18h.杂交反应后，用37℃左右水温的2×SSC溶液洗涤3次，每次5min.滴加杂交后稳定液，37℃，4-6h.以PBS溶液洗涤5min×3次.滴加封闭液，室温20min，不洗.滴加兔抗地高辛，20-37℃反应60min，PBS洗涤2min×3次.滴加生物素化羊抗兔IgG 20-37℃反应20min，0.5M PBS洗涤2min×3次.滴加SABC，20-37℃反应20min，0.5M PBS洗涤5min×4次.DAB显色，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片观察.
统计学处理 实验结果以均数±标准差记录，采用SAS统计分析软件行t检验和方差分析，P<0.05表示有统计学意义.
2 结果
2.1 大体及组织学观察 肝脏组织中接种Walker256癌肉瘤后1wk时即可在接种部位出现大小不等的肝癌肿块，2wk、3wk肿瘤逐渐变大，少数出现临近肝组织的转移和腹水形成.HE染色可证实肝癌的形成和大量血管形成.
2.2 微血管密度测定 Walker256癌肉瘤接种后1、2、3wk肿瘤微血管密度分别为15±4.3/HP、17±3.6/HP、45±7.8/HP，第1、2周相比无显著性差异(P>0.05)，第3周和前2wk相比则微血管数目显著增多(P<0.05).
2.3 免疫组织化学染色观察 大血管及正常微血管(毛细血管除外)由于血管内皮细胞表面有平滑肌细胞和周细胞包围，α-SMA呈强阳性染色.在肝癌组织中可见到一些形态不规则的微血管呈弱阳性或阴性染色，这种血管周围缺乏平滑肌细胞和周细胞等间质细胞，我们认为这是肿瘤诱导的新生血管.正常肝脏组织中几乎没有这种新生血管，而肝癌组织有大量新生血管的的形成.新生血管的数量与微血管密度呈正相关，Walker256癌肉瘤接种后3wk较前2wk有显著性增加.
2.4 原位杂交检测结果 正常肝脏组织仅有少量VEGF表达，肝癌组织接种后1wk即有多种细胞表达VEGF.棕黄色阳性颗粒主要定位于胞质中，以肝癌细胞为多，血管内皮细胞外间质细胞亦有少量表达.新生血管较密集的肿瘤组织VEGF的表达较多VEGF的表达与微血管密度和肿瘤组织中新生血管的数量呈正相关.
3 讨论原位种植肝癌是研究原发性肝癌较好的模型，由于肝脏本身具有很强的免疫性，大多采用组织种植的办法.接种1～2wk即能形成明显的肝癌，第3周时可见到肿瘤向周围的转移和腹水形成.从肿瘤微血管密度的检测来看，肝癌的生长和发展伴有微血管密度的增加，说明血管形成和肝癌发展有密切关系.
平滑肌激动蛋白(α-SMA)是平滑肌细胞和星状细胞等间质细胞所特有的蛋白，正常情况下除毛细血管外的微血管周围都有平滑肌细胞和周细胞等包绕.而肿瘤新生血管结构尚不完善，属于未成熟血管，周围较少或没有间质细胞，所以新生血管周围可能缺乏α-SMA表达.Benjamin发现α-SMA在神经胶质瘤中可以用来区别正常血管和新生血管，阻断VEGF的表达则新生血管的数量明显减少[6].本实验发现：肝脏组织中正常血管α-SMA呈强阳性表达包围在血管内皮细胞周围，窦状间隙亦有少量表达.在原位种植肝癌组织中可发现较多α-SMA弱阳性或阴性的血管，这种血管和正常血管相比管壁较薄，形态不规则，可见扭曲、折叠现象.我们认为这种血管就是肿瘤诱发的新生血管，由于其结构和功能尚不完善所以呈现出不规则形态.随着肿瘤的长大，这一现象越发明显且新生血管的数量和肿瘤微血管密度呈正相关，说明肿瘤在发展过程中具有诱导新生血管形成的能力.
血管内皮细胞生长因子及其受体是目前研究较多的血管生成的促进因素之一，针对阻断VEGF或其受体而采取的抗血管生成疗法对于实验性肿瘤取得了一定的疗效[7-9].由于这种抗血管生成疗法不是针对肿瘤细胞本身，不会产生耐药性[10]，具有极其广阔的应用前景.肿瘤新生血管在结构和功能上和正常血管是不同的，抗血管生成疗法的靶目标是新生血管，因此副作用很小[11].但是从实验室到临床应用还有较大的距离.我们在本研究中检测了VEGF mRNA在原位种植肝癌中的表达，发现VEGF mRNA在新生血管较密集处周围表达较多，和肿瘤微血管密度及新生血管数呈正相关.提示VEGF参与了肝癌新生血管形成的调控.肿瘤血管形成有其特殊的调控机制和信息通路，VEGF及其酪胺酸激酶受体家族是非常重要的信息通路之一.血清中VEGF的水平和肿瘤患者的预后有一定的关系[14]，使用VEGF的单克隆抗体可以抑制某些肿瘤的发展.很多细胞包括肿瘤细胞本身和周围的间质细胞都可以分泌VEGF，但以肿瘤细胞为主.本实验VEGF mRNA主要在肝癌细胞胞质中表达，且在新生血管较密集处周围表达较多.我们设想，进一步生长的需要使肿瘤细胞分泌VEGF等血管生成因子，这些因子作用于新生的血管促进血管内皮细胞增生，新生血管反过来为肿瘤组织提供营养和氧.VEGF促进血管生成的机制可能还和其作为内皮细胞的稳定剂，抑制血管内皮细胞凋亡有关[12，13].VEGF作用的靶细胞是新生血管内皮细胞，其受体亦分布于血管内皮细胞上.抑制VEGF的产生或拮抗其与受体的结合均能起到对抗肿瘤血管生成的作用.
4 参考文献1 Folkman J. Cancer: principles and practice of oncology. Lippincott-Raven Publishers. Philadelphia 1997： 3075-3085
2 Holmgren L, O'Reilly MS, Folkman J. Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence
of angiogenesis suppression. Nat Med 1995；1:149-153
3 Ruck P, Xiao JC, Kaiserling E. Immunoreactivity of sinusoids in hepatocellular carcinoma. An immunohistochemical study using lectin
UEA-1 and antibodies against endothelial markers, including CD34. Arch Pathol Lab Med 1995; 119: 173-178
4 Ito A, Nomura S, Hirota S, Suda J. Enhanced expression of CD34 messenger RNA by developing endothelial cells of mice.
Lab Invest 1995; 72: 532-538
5 Martin L, Green B, Renshaw C, Lowe D. Examining the technique of angiogenesis assessment in invasive breast cancer.
Br J Cancer 1997; 76: 1046-1054
6 Benjamin LE, Golijanin D, Itin A. Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelial
growth factor withdrawal. J Clin Invest 1999; 103: 159-165
7 Millauer B. Dominant-negative inhibition of Flk-1 suppresses the growth of many tumor types in vivo. Cancer Res 1996; 56: 1615-1620
8 Borgstrom P, Hillan KJ, Sriramarao P. Complete inhibition of angiogenesis and growth of microtumors by anti-vascular endothelial growth
factor neutralizing antibody: novel concepts of angiostatic therapy from intravital videomicroscopy. Cancer Res 1996; 56: 4032-4039
9 Borgstrom P, Bourdon MA, Hillan KJ. Neutralizing anti-vascular endothelial growth factor antibody completely inhibits angiogenesis
and growth of human prostate carcinoma micro tumors in vivo . Prostate 1998; 56:4032-4039
10 Boehm T, Folkman J, Browder T. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance.
Nature 1997; 390: 404-407
11 Denekamp J. Angiogenesis, neovascular proliferation and vascular pathophysiology as targets for cancer therapy.
Br J Radiol 1993; 66: 181-196
12 Alon T. Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for
retinopathy of prematurity. Nat Med 1995; 1: 1024-1028
13 Marx PT, Mulder AB, Van Den Bergh FA. Apoptosis inducers endotoxin and Fas-ligation enhance the expression of vascular
endothelial growth factor in human endothelial cells. Endothelium 1999;6:335-340
14 Jinno K, Tanimizu M, Hyodo L. Circulating vascular endothelial growth factor is a possible tumor marker in human hepatocellular
carcinoma. J Gastroenterol 1998; 33: 376-382, 百拇医药(彭 林，区金锐，王卫东，孙 建，简志祥)