幽门螺杆菌外膜和甲硝唑的结合与耐药性的关系 胡伟玲，戴 宁，朱永良
胡伟玲，戴宁，浙江大学附属邵逸夫医院消化科 浙江省杭州市 310016 ringwh@yahoo.com
朱永良，浙江大学附属第二医院消化科 浙江省杭州市 310009
浙江省自然科学基金资助课题.No.29801
项目负责人 戴宁，310016，浙江省杭州市庆春东路3号，浙江大学附属邵逸夫医院消化科. ndai@mail.hz.zj.cn
电话：0571-86090073-3102 传真：0571-86044817
收稿日期 2002-04-08 接受日期 2002-05-27
, 百拇医药 摘要
目的:研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pyroli)外膜和甲硝唑的结合作用与耐药性的关系.
方法:运用亲和黏附酶反应法，观察H.pylori外膜和甲硝唑结合作用，并对比敏感菌和耐药菌与甲硝唑结合作用的差异：运用甲硝唑亲和层析柱和 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳对比敏感菌和耐药菌的甲硝唑结合蛋白.
结果: H.pylori外膜存在甲硝唑的特异性结合位点，其结合作用能被高浓度甲硝唑竞争性抑制(P <0.001),耐药菌外膜与甲硝唑的结合作用明显低于敏感菌(P = 0.0012).
结论: H.pylori外膜对甲硝唑结合作用降低与甲硝唑耐药性的产生有关.
, 百拇医药
胡伟玲, 戴 宁,朱永良. 幽门螺杆菌外膜和甲硝唑的结合与耐药性的关系. 世界华人消化杂志 2002;10(9):1054-1055
0 引言甲硝唑是最早用于治疗H.pylori的抗生素之一.但随着甲硝唑的应用，H.pylori对其耐药现象日趋严重，已成为临床根治失败的主要原因之一.目前，国内关于H.pylori对甲硝唑耐药机制的研究尚不多见.H.pylori外膜和甲硝唑结合作用与耐药性的关系目前尚未见有报道.本实验采用酶联免疫亲和吸附法 (ELISA)，对H.pylori外膜和甲硝唑结合作用进行研究，并探讨其与耐药性的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 敏感菌ATCC43629，美国艾康生物公司提供.耐药菌:系从消化性溃疡患者胃黏膜活检标本中分离并鉴定.甲硝唑购自江苏同泰制药厂;牛血清白蛋白购自上海华美生物工程公司;溴化Sepharose4B购自瑞典pharmacia公司；碳二亚胺购自德国AMAE公司.
, 百拇医药
1.2 方法 最小抑菌浓度(MIC)的测定用纸片法.H.pylori 外膜和甲硝唑的结合作用及抑制试验采用亲和黏附酶反应法，取用碳二亚胺法制备的甲硝唑-牛血清白蛋白交联物100mL，包被微孔，4 ℃过夜，次日取出，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤微孔3次，用100mL/L 小牛血清37 ℃封闭30min后, 加入从108浓度起倍比稀释的新鲜H.pylori(每组为10个浓度)，同时对照组加入20mL的生理盐水, 抑制组加入甲硝唑溶液20mL (终浓度为0.5g/L)，混合后在37℃微需氧反应2h,PBS洗涤3次，加入10g/L尿素水溶液37℃反应2h，吸出上清液50mL, 和奈氏试剂200ul混和, 室温放置5s后，酶标仪比色(波长570nm)，结果以吸光度(A 值) 表示.甲硝唑结合蛋白的分离：用10%SDS裂解甲硝唑敏感菌和耐药菌，离心后取上清液，进行甲硝唑亲和层析，解析液为0.1mol/L pH 2.8甘氨酸盐酸溶液.洗脱得到的液体经聚乙二醇(Mr：20 000)浓缩后进行 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE).扫描凝胶记录电泳结果.
, 百拇医药
统计学处理 A 值用SPSS 10.0统计软件进行差值 t 检验.
2 结果敏感菌MIC:8mg/L，耐药菌 >25 mg/L.随着细菌浓度的下降，A值也下降，在抑制试验中，抑制组的A值比同细菌浓度的对照组明显下降(t =13.14 , P<0.001，图1).随着细菌浓度的下降，A值也下降， 耐药组的A值明显低于敏感组( t=6.469,P=0.0012，图2).对提取到的H.pylori膜蛋白及胞质蛋白，进行甲硝唑亲和层析和SDS-PAGE，结果显示两组间蛋白条带没有显著差异.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
图1(PDF) 甲硝唑敏感H.pylori加入500mg/L甲硝唑后,吸收值明显下降(P<0.001)
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, http://www.100md.com
图2(PDF) 甲硝唑敏感组的吸光值明显高于耐药组(P<0.001)
3 讨论随着 H.pylori 治疗中抗生素的广泛应用，H.pylori耐药现象日趋严重.H.pylori对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林等药物均产生了不同程度的耐药，其中对甲硝唑的耐药性尤为突出[ 1 ].新加坡1993年甲硝唑耐药率为 50.5%，在1996年上升到72.7%[ 2 ].上海1995年甲硝唑耐药率为42%，在1998年上升到70%[ 3 ].H.pylori对甲硝唑的耐药机制还不很清楚，主要认为是由于编码硝基还原酶的rdxA基因的突变，使得硝基还原酶失活产生[ 4,5 ]，但是完整的rdxA基因也可产生高水平的耐药性[ 6 ].Lacey et al 发现 H.pylori的甲硝唑耐药菌对甲硝唑的摄取比敏感菌减少，Moore et al等认为耐药菌和敏感菌都能较快的摄取甲硝唑，但耐药菌胞质内的甲硝唑浓度及蓄积速率比敏感菌低，氰化钾(KCN)及羰基氰化叶绿素腙(CCCP)能抑制H.pylori其对甲硝唑的摄取.我们以往研究结果表明质子泵抑制剂奥美拉唑和钙离子拮抗剂维拉帕米能抑制H.pylori的药物泵，减少药物外排，对H.pylori的耐药性有良好的逆转作用，显示膜耐药是H.pylori产生耐药的重要机制之一.但有关H.pylori外膜上是否存在甲硝唑的特异性结合位点及与耐药性的关系，目前尚未见报道.本实验中，甲硝唑-BSA包被微孔后，甲硝唑只能和H.pylori外膜结合，不能进入细菌，测得的A 值即反映了甲硝唑和细菌外膜的结合作用.在抑制试验中，抑制组的A值比同细菌浓度的对照组明显下降，其提示H.pylori外膜表面存在甲硝唑特异性的结合位点，结合作用能被高浓度的甲硝唑竞争性抑制，但结合位点的结构和生理活性功能尚不清楚.另外，耐药菌组的A 值明显低于敏感菌，表明耐药菌外膜对甲硝唑结合作用明显少于敏感菌，提示H.pylori外膜与甲硝唑结合作用可能与耐药性有关，而甲硝唑和外膜的结合直接影响其进入胞质，发挥抗菌作用.因此，我们推测，甲硝唑和外膜的结合作用下降，可能会影响外膜对甲硝唑的渗透性，导致胞质中的甲硝唑浓度下降，从而出现了耐药性.
, http://www.100md.com
H.pylori是革兰氏阴性杆菌，阴性菌通过外膜孔蛋白(porin)组成或数量的变化会改变膜的通透性，产生对抗生素的耐药性.文献报道，H.pylori至少含5种porins.与别的细菌相比，除了HopE形成较大的通道外，其他非特异性的孔蛋白表达相对较低.本实验对能和甲硝唑结合的蛋白进行SDS-PAGE，发现敏感菌和耐药菌间蛋白条带无显著性差异，提示H.pylori甲硝唑耐药菌中甲硝唑结合蛋白可能没有显著性的改变，同国内报道相一致.本实验的电泳样本包括膜蛋白和胞质蛋白，外膜蛋白的含量较低，今后我们将进一步分离和纯化外膜蛋白作更深入的研究.
总之，H.pylori外膜与甲硝唑结合作用的降低可能与甲硝唑耐药性的产生有关. H.pylori对甲硝唑的耐药机制是多种多样的， 而本实验只是对H.pylori外膜和甲硝唑结合作用与耐药性的关系作了初步探讨，还待今后做更深入的研究，为逆转 H.pylori的耐药性提供依据.
4 参考文献1 Maeda S, Yoshida H. Mechanism of drug resistance in Helicobacter pylori.Nippon Rinsho 2001;59:367-373
, 百拇医药
2 Teo EK, Fock KM, Ng TM, Khor CJ,Tan AL . Metronidazole- resistant Helicobacter pylori in an urban Asian population.
J Gastroenterol Hepatol 2000;15:494-497
3 史彤,刘文忠,萧树东,徐蔚文.上海地区幽门螺杆菌对抗生素耐药率的变迁.中华内科杂志 2000 ; 39:576
4 Jenks PJ, Ferrero RL, Labigne A. The role of the rdxA gene in the evolution of metronidazole resistance in Helicobacter
pylori. J Antimicrob Chemother 1999;43:753-758
, http://www.100md.com
5 Jeong JY, Mukhopadhyay AK, Dailidiene D, Wang Y, Velapatino B, Gilman RH, Parkinsor AJ, Nair GB, Wong BC, Lam SK,Mistry R, Segal I, Yuan Y, Gao H, Alarcon T, Brea ML, Ito Y, Kersulyte D, Lee HK, Gong Y, GoAwin A, Hoffman PS, Berg
DE. Sequential inactivation of rdxA (HP0954) and frxA (HP0642) nitroreductase genes causes mAerate and high-level
metronidazole resistance in Helicobacter pylori. J Bacteriol 2000;182:5082-5090
6 Solca NM, Bernasconi MV, Piffaretti JC. Mechanism of metronidazole resistance in Helicobacter pylori: comparison of
the rdxA gene sequences in 30 strains. Antimicrob Agents Chemother 2000;44:2207-2210, 百拇医药(幽门螺杆菌外膜和甲硝唑的结合与耐药性的关系 胡伟玲，戴 宁，朱永良)
朱永良，浙江大学附属第二医院消化科 浙江省杭州市 310009
浙江省自然科学基金资助课题.No.29801
项目负责人 戴宁，310016，浙江省杭州市庆春东路3号，浙江大学附属邵逸夫医院消化科. ndai@mail.hz.zj.cn
电话：0571-86090073-3102 传真：0571-86044817
收稿日期 2002-04-08 接受日期 2002-05-27
, 百拇医药 摘要
目的:研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pyroli)外膜和甲硝唑的结合作用与耐药性的关系.
方法:运用亲和黏附酶反应法，观察H.pylori外膜和甲硝唑结合作用，并对比敏感菌和耐药菌与甲硝唑结合作用的差异：运用甲硝唑亲和层析柱和 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳对比敏感菌和耐药菌的甲硝唑结合蛋白.
结果: H.pylori外膜存在甲硝唑的特异性结合位点，其结合作用能被高浓度甲硝唑竞争性抑制(P <0.001),耐药菌外膜与甲硝唑的结合作用明显低于敏感菌(P = 0.0012).
结论: H.pylori外膜对甲硝唑结合作用降低与甲硝唑耐药性的产生有关.
, 百拇医药
胡伟玲, 戴 宁,朱永良. 幽门螺杆菌外膜和甲硝唑的结合与耐药性的关系. 世界华人消化杂志 2002;10(9):1054-1055
0 引言甲硝唑是最早用于治疗H.pylori的抗生素之一.但随着甲硝唑的应用，H.pylori对其耐药现象日趋严重，已成为临床根治失败的主要原因之一.目前，国内关于H.pylori对甲硝唑耐药机制的研究尚不多见.H.pylori外膜和甲硝唑结合作用与耐药性的关系目前尚未见有报道.本实验采用酶联免疫亲和吸附法 (ELISA)，对H.pylori外膜和甲硝唑结合作用进行研究，并探讨其与耐药性的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 敏感菌ATCC43629，美国艾康生物公司提供.耐药菌:系从消化性溃疡患者胃黏膜活检标本中分离并鉴定.甲硝唑购自江苏同泰制药厂;牛血清白蛋白购自上海华美生物工程公司;溴化Sepharose4B购自瑞典pharmacia公司；碳二亚胺购自德国AMAE公司.
, 百拇医药
1.2 方法 最小抑菌浓度(MIC)的测定用纸片法.H.pylori 外膜和甲硝唑的结合作用及抑制试验采用亲和黏附酶反应法，取用碳二亚胺法制备的甲硝唑-牛血清白蛋白交联物100mL，包被微孔，4 ℃过夜，次日取出，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤微孔3次，用100mL/L 小牛血清37 ℃封闭30min后, 加入从108浓度起倍比稀释的新鲜H.pylori(每组为10个浓度)，同时对照组加入20mL的生理盐水, 抑制组加入甲硝唑溶液20mL (终浓度为0.5g/L)，混合后在37℃微需氧反应2h,PBS洗涤3次，加入10g/L尿素水溶液37℃反应2h，吸出上清液50mL, 和奈氏试剂200ul混和, 室温放置5s后，酶标仪比色(波长570nm)，结果以吸光度(A 值) 表示.甲硝唑结合蛋白的分离：用10%SDS裂解甲硝唑敏感菌和耐药菌，离心后取上清液，进行甲硝唑亲和层析，解析液为0.1mol/L pH 2.8甘氨酸盐酸溶液.洗脱得到的液体经聚乙二醇(Mr：20 000)浓缩后进行 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE).扫描凝胶记录电泳结果.
, 百拇医药
统计学处理 A 值用SPSS 10.0统计软件进行差值 t 检验.
2 结果敏感菌MIC:8mg/L，耐药菌 >25 mg/L.随着细菌浓度的下降，A值也下降，在抑制试验中，抑制组的A值比同细菌浓度的对照组明显下降(t =13.14 , P<0.001，图1).随着细菌浓度的下降，A值也下降， 耐药组的A值明显低于敏感组( t=6.469,P=0.0012，图2).对提取到的H.pylori膜蛋白及胞质蛋白，进行甲硝唑亲和层析和SDS-PAGE，结果显示两组间蛋白条带没有显著差异.
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图1(PDF) 甲硝唑敏感H.pylori加入500mg/L甲硝唑后,吸收值明显下降(P<0.001)
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图2(PDF) 甲硝唑敏感组的吸光值明显高于耐药组(P<0.001)
3 讨论随着 H.pylori 治疗中抗生素的广泛应用，H.pylori耐药现象日趋严重.H.pylori对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林等药物均产生了不同程度的耐药，其中对甲硝唑的耐药性尤为突出[ 1 ].新加坡1993年甲硝唑耐药率为 50.5%，在1996年上升到72.7%[ 2 ].上海1995年甲硝唑耐药率为42%，在1998年上升到70%[ 3 ].H.pylori对甲硝唑的耐药机制还不很清楚，主要认为是由于编码硝基还原酶的rdxA基因的突变，使得硝基还原酶失活产生[ 4,5 ]，但是完整的rdxA基因也可产生高水平的耐药性[ 6 ].Lacey et al 发现 H.pylori的甲硝唑耐药菌对甲硝唑的摄取比敏感菌减少，Moore et al等认为耐药菌和敏感菌都能较快的摄取甲硝唑，但耐药菌胞质内的甲硝唑浓度及蓄积速率比敏感菌低，氰化钾(KCN)及羰基氰化叶绿素腙(CCCP)能抑制H.pylori其对甲硝唑的摄取.我们以往研究结果表明质子泵抑制剂奥美拉唑和钙离子拮抗剂维拉帕米能抑制H.pylori的药物泵，减少药物外排，对H.pylori的耐药性有良好的逆转作用，显示膜耐药是H.pylori产生耐药的重要机制之一.但有关H.pylori外膜上是否存在甲硝唑的特异性结合位点及与耐药性的关系，目前尚未见报道.本实验中，甲硝唑-BSA包被微孔后，甲硝唑只能和H.pylori外膜结合，不能进入细菌，测得的A 值即反映了甲硝唑和细菌外膜的结合作用.在抑制试验中，抑制组的A值比同细菌浓度的对照组明显下降，其提示H.pylori外膜表面存在甲硝唑特异性的结合位点，结合作用能被高浓度的甲硝唑竞争性抑制，但结合位点的结构和生理活性功能尚不清楚.另外，耐药菌组的A 值明显低于敏感菌，表明耐药菌外膜对甲硝唑结合作用明显少于敏感菌，提示H.pylori外膜与甲硝唑结合作用可能与耐药性有关，而甲硝唑和外膜的结合直接影响其进入胞质，发挥抗菌作用.因此，我们推测，甲硝唑和外膜的结合作用下降，可能会影响外膜对甲硝唑的渗透性，导致胞质中的甲硝唑浓度下降，从而出现了耐药性.
, http://www.100md.com
H.pylori是革兰氏阴性杆菌，阴性菌通过外膜孔蛋白(porin)组成或数量的变化会改变膜的通透性，产生对抗生素的耐药性.文献报道，H.pylori至少含5种porins.与别的细菌相比，除了HopE形成较大的通道外，其他非特异性的孔蛋白表达相对较低.本实验对能和甲硝唑结合的蛋白进行SDS-PAGE，发现敏感菌和耐药菌间蛋白条带无显著性差异，提示H.pylori甲硝唑耐药菌中甲硝唑结合蛋白可能没有显著性的改变，同国内报道相一致.本实验的电泳样本包括膜蛋白和胞质蛋白，外膜蛋白的含量较低，今后我们将进一步分离和纯化外膜蛋白作更深入的研究.
总之，H.pylori外膜与甲硝唑结合作用的降低可能与甲硝唑耐药性的产生有关. H.pylori对甲硝唑的耐药机制是多种多样的， 而本实验只是对H.pylori外膜和甲硝唑结合作用与耐药性的关系作了初步探讨，还待今后做更深入的研究，为逆转 H.pylori的耐药性提供依据.
4 参考文献1 Maeda S, Yoshida H. Mechanism of drug resistance in Helicobacter pylori.Nippon Rinsho 2001;59:367-373
, 百拇医药
2 Teo EK, Fock KM, Ng TM, Khor CJ,Tan AL . Metronidazole- resistant Helicobacter pylori in an urban Asian population.
J Gastroenterol Hepatol 2000;15:494-497
3 史彤,刘文忠,萧树东,徐蔚文.上海地区幽门螺杆菌对抗生素耐药率的变迁.中华内科杂志 2000 ; 39:576
4 Jenks PJ, Ferrero RL, Labigne A. The role of the rdxA gene in the evolution of metronidazole resistance in Helicobacter
pylori. J Antimicrob Chemother 1999;43:753-758
, http://www.100md.com
5 Jeong JY, Mukhopadhyay AK, Dailidiene D, Wang Y, Velapatino B, Gilman RH, Parkinsor AJ, Nair GB, Wong BC, Lam SK,Mistry R, Segal I, Yuan Y, Gao H, Alarcon T, Brea ML, Ito Y, Kersulyte D, Lee HK, Gong Y, GoAwin A, Hoffman PS, Berg
DE. Sequential inactivation of rdxA (HP0954) and frxA (HP0642) nitroreductase genes causes mAerate and high-level
metronidazole resistance in Helicobacter pylori. J Bacteriol 2000;182:5082-5090
6 Solca NM, Bernasconi MV, Piffaretti JC. Mechanism of metronidazole resistance in Helicobacter pylori: comparison of
the rdxA gene sequences in 30 strains. Antimicrob Agents Chemother 2000;44:2207-2210, 百拇医药(幽门螺杆菌外膜和甲硝唑的结合与耐药性的关系 胡伟玲，戴 宁，朱永良)
