卷苦肝泰对CCl4肝损伤大鼠肝脏线粒体膜的影响
周学文,周奇,辽宁中医学院附属医院消化内科 辽宁省沈阳市 110032
王威,辽宁中医学院针灸推拿系 辽宁省沈阳市 110032
倪力强,上海中医药大学博士后流动站
都广伍,山东中医药大学博士后流动站
辽宁省科技厅基金资助课题,NO.962231
项目负责人 周学文,110032,辽宁省沈阳市北陵大街31号.辽宁中医学院附属医院.
电话:024-86900630 传真:024-86900630
, 百拇医药
收稿日期 2001-04-30 接受日期 2002-05-22
摘要
目的:观察中药复方卷苦肝泰对慢性四氯化碳肝损伤的治疗作用,探讨其可能的作用机制,为中医药治疗肝病提供一定依据.
方法:用CCl4灌胃4 wk复制慢性肝损伤模型.予卷苦肝泰6 wk.检测并观察了各组大鼠：肝线粒体膜总磷脂(DL)、总胆固醇(Chol)的含量及膜脂质组分磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、神经磷脂(SM)、心磷脂(CL)的含量.
结果:与自然恢复组比较，卷苦肝泰煎剂能降低膜胆固醇含量，维持膜磷脂稳定；显著提高PC、PE、CL含量；降低膜老化指数Ch/PL，SM/PC.
, 百拇医药
结论:卷苦肝泰具有保护肝线粒体膜的作用即抗膜磷脂降解作用；降低膜胆固醇含量；稳定膜流动性、防止膜老化.
周学文,王威,倪力强,都广伍,周奇.卷苦肝泰对CCl4肝损伤大鼠肝脏线粒体膜的影响.世界华人消化杂志 2002;10(12):1465-1466
0 引言各种原因引起的慢性肝病及各种损肝因素所致的肝损伤的发病率与日俱增，日益危害着人类的健康，据统计全世界约有3亿多乙肝病毒(HBV)慢性携带者，其中我国约占1.3亿，而其中约1/4的携带者将发展为慢性肝病[1] .而对于其中许多疾病,目前尚无行之有效的治疗手段,卷苦肝泰是周学文教授根据传统的中医理论,在总结历代医家治疗肝病经验的基础上,经多年的临床实践总结出的治疗慢性肝炎的有效方药.现对该方剂对CCl4肝损伤大鼠肝脏线粒体膜影响的实验研究报告如下:
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1 材料和方法
1.1 材料 健康纯系wistar大鼠46只购于中国医科大学实验动物中心，雌雄各半，体质量180-200 g.四氯化碳(CCl4)(宜兴化学试剂厂，批号：920801);卷苦肝泰(主要药物有卷柏20 g、苦参15 g、柴胡12 g、积雪草10 g、龙胆草12 g、茵陈11 g、叶下珠10 g、白茅根15 g、三七3 g、甘草10 g)辽宁中医学院附属医院制剂室提供；b-NADPH2，日本协和株式会社；细胞色素C，57F-7175，美国Sigma公司产品；HieN试剂，上海医学检验所；磷脂标准品，66F-8375，胆碱磷脂，P-5763，神经磷脂S-7004，脑磷脂，C-2250，均为美国Sigma公司产品.
1.2 方法 所有实验动物适应环境1 wk后,随机抽取6只大鼠，经病理检查证实无肝脏病变,纳入实验动物,按体重层次随机抽取10只为正常对照组,按10 ml.Kg-1.d-1口服灌胃蒸馏水，连续10 wk，余下30只大鼠为肝损伤组，按10 ml.Kg-1.d-1口服灌胃造模液(10 ml/L CCl4大豆油溶液)，连续4 wk，实验至第29天起，将肝损伤组所有大鼠称重，并按体重层次再随机分为3组，每组10只，其中模型对照组，口服灌胃蒸馏水每日10 mL.Kg，连续6 wk；卷苦肝泰组口服灌胃方式给药,10 mL.Kg/d (相当于生药剂量32.4 g/Kg),药量均按人临床用量以体表面积换算成大鼠用量,连续治疗6 wk.所有实验动物在实验前后30 min内，禁食禁水，其余时间自由进食饮水，饲以标准颗粒饲料.
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实验至71 d,大鼠禁食16 h,称质量,以10 g/L戊巴比妥钠4 mL/Kg制备肝脏线粒体后上清取肝脏1 g,在1:9匀浆递质(冷0.25 mol/Lsucrose-10 mol/LTris-HCl, PH7.4)中，以组织匀浆器制成100 g/L匀浆(10 000 r/ min)，然后将组织匀浆以3 000 r/min离心10 min，取上清，再以10 000 r/mil离心15 min,即分离出线粒体后上清.肝线粒体总磷脂测定用硫氰亚铁铵比色法.肝线粒体总胆固醇测定按Friedewld et al 法并加以改进.肝线粒体磷脂组分变化的测定采用磷脂薄层色谱分析法.肝线粒体脂质过氧化物(LPO)测定采用丙二醛TBA反应比色法.
统计学处理 计量资料以x±s 表示，各组间比较用两样本均数的t检验.
2 结果2.1卷苦肝剂对大鼠肝脏线粒体膜总磷脂(PL)含量的影响.模型对照组线粒体膜总磷脂量明显低于其他各组，卷苦肝泰组对维持膜磷脂含量有恢复作用，与正常对照组相比无明显差异.
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2.2卷苦肝泰对大鼠肝脏线粒体总胆固醇(Ch)含量的影响.模型对照组大鼠肝脏线粒体总胆固醇含量明显高于其他各组，卷苦肝泰组能调节线粒体总胆固醇含量，使之保持在正常对照组水平.
2.3卷苦肝泰对大鼠肝脏线粒体神经磷脂(SM)、胆碱磷脂(PC)含量的影响各组大鼠肝脏线粒体膜内SM含量没有明显改变,模型对照组大鼠肝脏线粒体膜内PC明显低于正常对照组，卷苦肝泰组PC含量高于模型对照组，且接近正常对照组水平.
2.4 卷苦肝泰对大鼠肝脏线粒体膜总胆固醇与总磷脂比值的影响.模型对照组大鼠肝脏线粒体Ch/PL明显高于正常对照组；卷苦肝泰组的Ch/PL比值均低于模型对照组.
2.5 卷苦肝泰对各组大鼠肝脏线粒体膜内神经磷脂与胆碱磷脂的比值变化的影响.模型对照组肝脏线粒体内膜SM/PC的比值明显高于正常对照组，卷苦肝泰组SM/PC的比值低于模型对照组.
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2.6大鼠肝脏线粒体膜内磷脂酰乙醇胺(PE)、心磷脂(CL)含量的变化.从表可见，模型对照组大鼠肝脏线粒体膜内心磷脂含量明显低于正常对照组)，卷苦肝泰组高于模型对照组.
表1 各组大鼠肝脏线粒体总磷脂(PL)、总胆固醇(Ch)、SM、PC含量的检测结果及Ch/PL SM/PC比值变化(x±s )
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aP <0.05,bP <0.01,vs 模型对照组
表2 大鼠肝脏线粒体膜内磷脂酰乙醇胺(PE)、心磷脂(CL)含量的变化
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aP <0.05, bP <0.01, vs 模型对照组
3 讨论卷苦肝泰是我们经过大量反复临床实践总结出的治疗慢性肝病的有效方剂具有疏肝健脾、清热利湿、解毒消瘀之功效.方以具有行气活血，入足厥阴、少阳血分之卷柏，功擅清热燥湿、杀虫利尿，入肝、胃、膀胱等经的苦参共为主药.辅以清热燥湿之龙胆草、凉血散瘀之丹参等.全方主辅互济，其力倍增，既行清热燥湿之功，又奏辅脾养肝之效，祛邪而不伤正，补正而不助邪.现代药理学实验表明，苦参中主要成份苦参碱能有效降低CCl4肝损伤大鼠血清透明质酸(ALT，ELA)、肝组织羟脯氨酸(HyP)的含量，能减少肝细胞坏死,减轻炎细胞浸润,且有抗乙肝病毒(HBV)的作用[2] ;此外，苦参碱尚有类似糖皮质激素样的直接抗炎作用，能稳定细胞膜[3] ;丹参的主要成份为丹参酮，作为传统的活血化瘀药，其改善微循环，护肝降酶，促进肝细胞再生、抗脂质过氧化作用已为实验临床所证实[4].线粒体膜磷脂降解和脂质过氧化的脂质改变是引起肝细胞损伤的重要起始原因，线粒体膜质完整性的破坏是上述两种作用机制相互促进作用的结果.而对于肝细胞膜整体功能的早期损害，线粒体膜激活磷脂酶A2(PLA2)激活导致的膜磷脂降解可能起更重要的作用.CCl4肝损伤大鼠肝线粒体膜内总磷脂(PL)含量明显降低，模型组与正常对照组之间差异显著，提示线粒体膜磷脂受到严重损伤而降解；而在减少的磷脂中，又以PC、CL减少更为明显，二者又是线粒体内膜呼吸酶细胞色素氧化酶(CCO)的必需“界面脂”，其中，CL又是构成线粒体内膜的重要磷脂之一,他和内膜功能有十分密切的关系，CL可以认为是线粒体内膜的特征性磷脂，因此，PC、CL的减少，又提示肝线粒体膜出现了自由基氧化损伤，肝线粒体能量(转换)代谢的关键酶CCO活性的下降.治疗后各组PL，PC，CL的含量均显著高于模型对照组，表明治疗各组均具有抗线粒体膜磷脂降解的作用，表明治疗各组均具有抗线粒体膜磷脂降解作用，其作用可能与以下因素有关：(1)与提高抗氧化酶活性、抑制自由基的产生作用有关；(2)可能是通过抑制PLA2的活性而起作用，这方面还有待于以后的工作中进一步探讨.
, 百拇医药
此外,本研究显示,模型对照组胆固醇(Ch)含量明显高于正常对照组，提示CCl4肝损伤时线粒体膜Ch的代谢或排除障碍.卷苦肝泰组能使Ch含量降低.根据生物膜的液态镶嵌理论，膜具有流动性.合适的膜流动性是维持膜的各种功能的极为重要条件，膜的流动性是生物膜的重要特征之一.模型组PC、CL含量降低Ch含量升高，提示膜流动性下降，卷苦肝泰具有抗PC、CL降解，并能降低Ch含量的作用，而具有稳定细胞膜流动性，防止膜老化的作用.
4 参考文献1 徐克成,危北海.慢性乙型肝炎治疗.中国中西医结合消化杂志 2001;9:323-324
2 陈伟忠.苦参碱对大鼠实验性肝纤维化的影响.第二军医大学学报 1996;17:424-425
3 巫善明.苦参碱抗鸭乙肝病毒作用的实验观察.中西医结合肝病杂志1993:3:18-19
4 刘尔瑜.丹参对实验性肝纤维化的治疗作用.肝脏病杂志 1993:1:39, 百拇医药(周学文,王 威,倪力强,都广伍,周 奇)
王威,辽宁中医学院针灸推拿系 辽宁省沈阳市 110032
倪力强,上海中医药大学博士后流动站
都广伍,山东中医药大学博士后流动站
辽宁省科技厅基金资助课题,NO.962231
项目负责人 周学文,110032,辽宁省沈阳市北陵大街31号.辽宁中医学院附属医院.
电话:024-86900630 传真:024-86900630
, 百拇医药
收稿日期 2001-04-30 接受日期 2002-05-22
摘要
目的:观察中药复方卷苦肝泰对慢性四氯化碳肝损伤的治疗作用,探讨其可能的作用机制,为中医药治疗肝病提供一定依据.
方法:用CCl4灌胃4 wk复制慢性肝损伤模型.予卷苦肝泰6 wk.检测并观察了各组大鼠：肝线粒体膜总磷脂(DL)、总胆固醇(Chol)的含量及膜脂质组分磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、神经磷脂(SM)、心磷脂(CL)的含量.
结果:与自然恢复组比较，卷苦肝泰煎剂能降低膜胆固醇含量，维持膜磷脂稳定；显著提高PC、PE、CL含量；降低膜老化指数Ch/PL，SM/PC.
, 百拇医药
结论:卷苦肝泰具有保护肝线粒体膜的作用即抗膜磷脂降解作用；降低膜胆固醇含量；稳定膜流动性、防止膜老化.
周学文,王威,倪力强,都广伍,周奇.卷苦肝泰对CCl4肝损伤大鼠肝脏线粒体膜的影响.世界华人消化杂志 2002;10(12):1465-1466
0 引言各种原因引起的慢性肝病及各种损肝因素所致的肝损伤的发病率与日俱增，日益危害着人类的健康，据统计全世界约有3亿多乙肝病毒(HBV)慢性携带者，其中我国约占1.3亿，而其中约1/4的携带者将发展为慢性肝病[1] .而对于其中许多疾病,目前尚无行之有效的治疗手段,卷苦肝泰是周学文教授根据传统的中医理论,在总结历代医家治疗肝病经验的基础上,经多年的临床实践总结出的治疗慢性肝炎的有效方药.现对该方剂对CCl4肝损伤大鼠肝脏线粒体膜影响的实验研究报告如下:
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 健康纯系wistar大鼠46只购于中国医科大学实验动物中心，雌雄各半，体质量180-200 g.四氯化碳(CCl4)(宜兴化学试剂厂，批号：920801);卷苦肝泰(主要药物有卷柏20 g、苦参15 g、柴胡12 g、积雪草10 g、龙胆草12 g、茵陈11 g、叶下珠10 g、白茅根15 g、三七3 g、甘草10 g)辽宁中医学院附属医院制剂室提供；b-NADPH2，日本协和株式会社；细胞色素C，57F-7175，美国Sigma公司产品；HieN试剂，上海医学检验所；磷脂标准品，66F-8375，胆碱磷脂，P-5763，神经磷脂S-7004，脑磷脂，C-2250，均为美国Sigma公司产品.
1.2 方法 所有实验动物适应环境1 wk后,随机抽取6只大鼠，经病理检查证实无肝脏病变,纳入实验动物,按体重层次随机抽取10只为正常对照组,按10 ml.Kg-1.d-1口服灌胃蒸馏水，连续10 wk，余下30只大鼠为肝损伤组，按10 ml.Kg-1.d-1口服灌胃造模液(10 ml/L CCl4大豆油溶液)，连续4 wk，实验至第29天起，将肝损伤组所有大鼠称重，并按体重层次再随机分为3组，每组10只，其中模型对照组，口服灌胃蒸馏水每日10 mL.Kg，连续6 wk；卷苦肝泰组口服灌胃方式给药,10 mL.Kg/d (相当于生药剂量32.4 g/Kg),药量均按人临床用量以体表面积换算成大鼠用量,连续治疗6 wk.所有实验动物在实验前后30 min内，禁食禁水，其余时间自由进食饮水，饲以标准颗粒饲料.
, 百拇医药
实验至71 d,大鼠禁食16 h,称质量,以10 g/L戊巴比妥钠4 mL/Kg制备肝脏线粒体后上清取肝脏1 g,在1:9匀浆递质(冷0.25 mol/Lsucrose-10 mol/LTris-HCl, PH7.4)中，以组织匀浆器制成100 g/L匀浆(10 000 r/ min)，然后将组织匀浆以3 000 r/min离心10 min，取上清，再以10 000 r/mil离心15 min,即分离出线粒体后上清.肝线粒体总磷脂测定用硫氰亚铁铵比色法.肝线粒体总胆固醇测定按Friedewld et al 法并加以改进.肝线粒体磷脂组分变化的测定采用磷脂薄层色谱分析法.肝线粒体脂质过氧化物(LPO)测定采用丙二醛TBA反应比色法.
统计学处理 计量资料以x±s 表示，各组间比较用两样本均数的t检验.
2 结果2.1卷苦肝剂对大鼠肝脏线粒体膜总磷脂(PL)含量的影响.模型对照组线粒体膜总磷脂量明显低于其他各组，卷苦肝泰组对维持膜磷脂含量有恢复作用，与正常对照组相比无明显差异.
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2.2卷苦肝泰对大鼠肝脏线粒体总胆固醇(Ch)含量的影响.模型对照组大鼠肝脏线粒体总胆固醇含量明显高于其他各组，卷苦肝泰组能调节线粒体总胆固醇含量，使之保持在正常对照组水平.
2.3卷苦肝泰对大鼠肝脏线粒体神经磷脂(SM)、胆碱磷脂(PC)含量的影响各组大鼠肝脏线粒体膜内SM含量没有明显改变,模型对照组大鼠肝脏线粒体膜内PC明显低于正常对照组，卷苦肝泰组PC含量高于模型对照组，且接近正常对照组水平.
2.4 卷苦肝泰对大鼠肝脏线粒体膜总胆固醇与总磷脂比值的影响.模型对照组大鼠肝脏线粒体Ch/PL明显高于正常对照组；卷苦肝泰组的Ch/PL比值均低于模型对照组.
2.5 卷苦肝泰对各组大鼠肝脏线粒体膜内神经磷脂与胆碱磷脂的比值变化的影响.模型对照组肝脏线粒体内膜SM/PC的比值明显高于正常对照组，卷苦肝泰组SM/PC的比值低于模型对照组.
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2.6大鼠肝脏线粒体膜内磷脂酰乙醇胺(PE)、心磷脂(CL)含量的变化.从表可见，模型对照组大鼠肝脏线粒体膜内心磷脂含量明显低于正常对照组)，卷苦肝泰组高于模型对照组.
表1 各组大鼠肝脏线粒体总磷脂(PL)、总胆固醇(Ch)、SM、PC含量的检测结果及Ch/PL SM/PC比值变化(x±s )
| 分组 | PL(mg/g) | Ch(mg/g) | SM(mg/kg) | PC(mg/kg) | Ch/PL | SM/PC |
| 正常对照 | 128±19b | 128±17b | 721±453a | 1581±365b | 101±23a | 46±8a |
| 模型对照 | 72±13 | 195±32 | 756±295 | 689±194 | 272±19 | 140±30 |
| 自然恢复 | 94±1a | 123±26a | 716±338b | 561±119a | 113±26b | 82±30b |
| 卷苦肝泰 | 98±11b | 165±41a | 796±312b | 1511±286b | 166±31b | 1.81±0.34a |
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aP <0.05,bP <0.01,vs 模型对照组
表2 大鼠肝脏线粒体膜内磷脂酰乙醇胺(PE)、心磷脂(CL)含量的变化
| 分组 | PE(mg/kg) | CL(mg/kg) |
| 正常对照 | 1041±373a | 58.35±11.73b |
| 模型对照 | 895±477 | 21.35±10.34 |
| 自然恢复 | 1156±364b | 36.44±15.58a |
| 卷苦肝泰 | 1117±499b | 54.09±16.29b |
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aP <0.05, bP <0.01, vs 模型对照组
3 讨论卷苦肝泰是我们经过大量反复临床实践总结出的治疗慢性肝病的有效方剂具有疏肝健脾、清热利湿、解毒消瘀之功效.方以具有行气活血，入足厥阴、少阳血分之卷柏，功擅清热燥湿、杀虫利尿，入肝、胃、膀胱等经的苦参共为主药.辅以清热燥湿之龙胆草、凉血散瘀之丹参等.全方主辅互济，其力倍增，既行清热燥湿之功，又奏辅脾养肝之效，祛邪而不伤正，补正而不助邪.现代药理学实验表明，苦参中主要成份苦参碱能有效降低CCl4肝损伤大鼠血清透明质酸(ALT，ELA)、肝组织羟脯氨酸(HyP)的含量，能减少肝细胞坏死,减轻炎细胞浸润,且有抗乙肝病毒(HBV)的作用[2] ;此外，苦参碱尚有类似糖皮质激素样的直接抗炎作用，能稳定细胞膜[3] ;丹参的主要成份为丹参酮，作为传统的活血化瘀药，其改善微循环，护肝降酶，促进肝细胞再生、抗脂质过氧化作用已为实验临床所证实[4].线粒体膜磷脂降解和脂质过氧化的脂质改变是引起肝细胞损伤的重要起始原因，线粒体膜质完整性的破坏是上述两种作用机制相互促进作用的结果.而对于肝细胞膜整体功能的早期损害，线粒体膜激活磷脂酶A2(PLA2)激活导致的膜磷脂降解可能起更重要的作用.CCl4肝损伤大鼠肝线粒体膜内总磷脂(PL)含量明显降低，模型组与正常对照组之间差异显著，提示线粒体膜磷脂受到严重损伤而降解；而在减少的磷脂中，又以PC、CL减少更为明显，二者又是线粒体内膜呼吸酶细胞色素氧化酶(CCO)的必需“界面脂”，其中，CL又是构成线粒体内膜的重要磷脂之一,他和内膜功能有十分密切的关系，CL可以认为是线粒体内膜的特征性磷脂，因此，PC、CL的减少，又提示肝线粒体膜出现了自由基氧化损伤，肝线粒体能量(转换)代谢的关键酶CCO活性的下降.治疗后各组PL，PC，CL的含量均显著高于模型对照组，表明治疗各组均具有抗线粒体膜磷脂降解的作用，表明治疗各组均具有抗线粒体膜磷脂降解作用，其作用可能与以下因素有关：(1)与提高抗氧化酶活性、抑制自由基的产生作用有关；(2)可能是通过抑制PLA2的活性而起作用，这方面还有待于以后的工作中进一步探讨.
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此外,本研究显示,模型对照组胆固醇(Ch)含量明显高于正常对照组，提示CCl4肝损伤时线粒体膜Ch的代谢或排除障碍.卷苦肝泰组能使Ch含量降低.根据生物膜的液态镶嵌理论，膜具有流动性.合适的膜流动性是维持膜的各种功能的极为重要条件，膜的流动性是生物膜的重要特征之一.模型组PC、CL含量降低Ch含量升高，提示膜流动性下降，卷苦肝泰具有抗PC、CL降解，并能降低Ch含量的作用，而具有稳定细胞膜流动性，防止膜老化的作用.
4 参考文献1 徐克成,危北海.慢性乙型肝炎治疗.中国中西医结合消化杂志 2001;9:323-324
2 陈伟忠.苦参碱对大鼠实验性肝纤维化的影响.第二军医大学学报 1996;17:424-425
3 巫善明.苦参碱抗鸭乙肝病毒作用的实验观察.中西医结合肝病杂志1993:3:18-19
4 刘尔瑜.丹参对实验性肝纤维化的治疗作用.肝脏病杂志 1993:1:39, 百拇医药(周学文,王 威,倪力强,都广伍,周 奇)
