轮状病毒全身感染对肝胆胰的影响
姚英民,李宁,欧巧群,中国人民解放军第一军医大学南方医院儿科 广东省广州市 510515
项目负责人:姚英民,510515,广东省广州市,中国人民解放军第一军医大学南方医院儿科. ningli_cn@hotmail.com
电话:020-85141888-87300 传真:020-61641927
收稿日期:2002-11-19 接受日期:2002-12-02
摘要
目的:进一步了解轮状病毒(RV)全身扩散后对肝、胆、胰的影响，为指导临床的早期诊断与治疗提供有价值参考.
, 百拇医药
方法:观察RV胃肠炎患儿肝、胆、胰损伤的临床表现和化验变化;采用光镜、电镜观察RV胃肠炎死亡患儿，人类RV感染小鼠模型的组织病理变化，采用原位PCR技术获取肝、胆、胰组织RV感染的直接证据.
结果:RV胃肠炎患儿肝酶ALT、AST分别升高者占36.59%和78.05 %，2项均显著升高者占7.32%; 胰淀粉酶显著增高1例，胆指标均在正常范围内.光镜下RV胃肠炎死亡患儿肝细胞浊肿，明显脂肪变性，RV感染小鼠肝窦血管扩张充血、灶性坏死，汇管区和小叶内淋巴细胞、浆细胞浸润，胆道充血，胰腺无明显异常.电镜下RV感染小鼠肝细胞中存在大量脂滴和空泡，肝脏线粒体凝集病变明显，毛细胆管明显扩张，微绒毛脱落.原位PCR结果:RV胃肠炎死亡患儿肠、肝呈阳性，RV感染小鼠胆管上皮细胞和腺体，肝细胞膜、胞质以及枯否细胞胞质，胰腺细胞呈阳性显色.
, 百拇医药
结论:人类RV一旦扩散至全身后，对肝、胆、胰可造成不同程度的损伤.
姚英民,李宁,欧巧群.轮状病毒全身感染对肝胆胰的影响.世界华人消化杂志 2003;11(6):873-875
0 引言轮状病毒(RV)是世界范围内急性感染腹泻病的主要病原体之一，每年有数亿人感染此病，死亡人数达80万之多.近年来， RV也可侵犯全身多个器官，已引起了人们的广泛关注[1-3].我们试图从RV胃肠炎患儿临床表现和化验检查中获取RV感染肠道外消化器官肝胆胰的临床证据;采用光镜、电镜观察RV胃肠炎死亡患儿，人类RV感染小鼠模型组织的病理变化，采用原位PCR技术获取RV感染肝胆胰组织的直接证据.为进一步了解RV对肠外消化器官与组织的影响，为指导临床的早期诊断与治疗提供有价值参考.
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1 材料和方法
1.1 材料 RV感染高峰期来我院就诊的急性腹泻患儿41例，年龄6mo-2岁，临床表现符合儿科学(第四版)关于急性RV胃肠炎的诊断标准，粪便经ELISA检测RV阳性.采取患儿静脉血，检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、胰淀粉酶、直接胆红素、间接胆红素、总胆汁酸水平. ALT和AST≥3倍正常值为明显升高.其他指标≥正常值2倍为明显升高.同时观察肠外消化器官损伤的临床表现.在RV肠炎流行期，2例死亡的RV肠炎患儿，例1，患儿粪便ELISA检测RV++，未检出其他病原菌，在脑脊液、肺组织研磨上清和腹水中以PCR方法检出RV.例2，患儿粪便ELISA检测RV+++.
1.2 人类RV感染新生小鼠 (1)RV来源:RV流行高峰期腹泻患儿临床表现符合急性RV胃肠炎的诊断标准，粪便RV抗原ELISA检测++++，PAGE电泳图形与RVWa株相同. 3份患儿新鲜粪便混合，-37°C冻存过夜，4000 rpm离心30min，取上清，加2倍生理盐水稀释，测pH值为6.9，加青霉素、链霉素各200U/ml 4 °C孵育过夜，0.22mm微孔滤膜过滤.取少量过滤粪上清细菌培养，未发现有细菌生长[5].(2)实验动物:新生清洁级昆明乳鼠，妊娠晚期购回.新生鼠自然娩出，共32只，雌雄各半，3日龄，体重3.5-4.0g，平均3.8 g.试验前大便轮状病毒ELISA和PAGE电泳均为阴性.(3)RV接种小鼠:A组: 8只小鼠灌胃RV悬液0.4ml; B组: 8只小鼠腹腔注射RV悬液0.4mL; C组: 8只小鼠灌胃生理盐水0.4mL作为对照组;D组: 8只小鼠腹腔注射生理盐水0.4mL作为对照组.接种后第3天猝死小鼠.
, 百拇医药
1.3 光镜下观察RV胃肠炎死亡患儿病理变化，光镜、电镜下观察接种RV后d3猝死小鼠的病理变化.
1.4 原位RT-PCR间接法 检测 RV腹泻高峰期死亡的2例婴儿尸体解剖存档肝、胆、胰腺石蜡标本.阳性对照: RV感染的MA104细胞;阴性对照: RV感染死亡患儿组织标本RT-PCR反应不加MO-MLV逆转录酶;1例同年龄组非RV感染死亡患儿的组织石蜡标本;空白对照: 杂交液中不加探针. 杂交探针:A组RV Gene9的51-392bp之间的序列，地高辛标记.PCR扩增片断:A 组RV Gene9的51-392bp之间. 具体方法见文献[4].
2 结果
2.1 肝胆胰血液检验结果 急性RV胃肠炎患儿ALT值、AST值分别升高者占36.59%和78.05 %，2项均升高者占34.15%，2项均显著升高者占7.32%，胰淀粉酶1例显著增高，胆指标在正常范围内.
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2.2 RV感染后组织病理改变 光镜下，RV胃肠炎患儿肝呈小叶-弥漫性脂肪变性，肝细胞浊肿-明显变性，胞质内颗粒形成，肝窦受压变窄，胆、胰无明显异常. 腹腔注射组小鼠肝窦血管扩张充血、部分肝细胞浊肿，灶性坏死，肝细胞内有脂滴，汇管区和小叶内淋巴细胞、浆细胞浸润，胆道充血.其他组小鼠脏器未见异常改变.电镜下，腹腔注射组小鼠肝细胞中存在大量脂滴和空泡，细胞之间淋巴细胞，浆细胞浸润显著，粗面内质网扩张，肝脏线粒体肿胀-凝集病变明显，轮廓不清，细胞核固缩-崩解，嵴膜模糊不清，部分毛细胆管明显扩张，微绒毛脱落.
2.3 各脏器RV原位PCR结果 第1例患儿小肠，第2例患儿小肠、肝脏呈阳性.腹腔注射组乳鼠小肠绒毛和肠腺细胞质，胆管上皮细胞和腺体，肝脏细胞膜、胞质以及枯否细胞质，胰腺细胞呈阳性显色. 其他组呈阴性.
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3 讨论RV胃肠炎引起一过性肝酶升高，甚至可在人类的肝细胞内复制，引起RV肝炎已被人们关注[6,7]. 本文临床研究与动物实验均证实RV具有嗜肝组织的特性.在RV胃肠炎患儿中约30%肝酶升高，显著升高者约占7%左右. 其中1例证实RV病毒血症小儿，出现明显高脂血症和脂肪肝，2例RV胃肠炎死亡小儿，可见肝细胞浊肿及明显脂肪变性.镜下证实人类RV感染小鼠，除肝脏的炎症改变外，肝细胞中存在大量脂滴和空泡，由此提示RV所致肝脏损伤如同丙型病毒性肝炎一样也具有肝脏脂肪变的病理特征[8].此外，肝脏超微结构也显示线粒体病变尤为显著，推测RV侵犯肝脏后可能主要影响肝细胞能量代谢的场所，导致能量代谢紊乱，此点恰与某些病毒所致以急性脑病合并肝脂肪变性，以器官线粒体受损组织学改变为特点的瑞氏(Reye)综合征有某些相似之处.
经消化道接种 RV后一般不易造成肠道外感染，或肠道外感染的脏器少，程度较轻.经腹腔接种，RV通过腹膜以及腹腔内的血管和淋巴系统直接转移到靶器官，相当于模拟RV已穿过肠道屏障，人为地造成了RV 病毒血症后，肠道外感染的情况.近来，国外采用此方法建立RV所致的胆汁瘀积，先天性肝外胆管闭锁动物模型，证实RV是导致这一病理改变的最佳病原体之一[9,10].在国外也发现小婴儿先天性胆道闭锁与RV感染有关.我们在急性RV胃肠炎患儿中未发现RV引起胆道病变的病例，但我们动物实验证实人类RV可以引起新生小鼠胆管病变，由此推测RV嗜胆细胞可能具有一定的年龄限制.最近的研究有力的支持了我们的推测，他们发现胆道闭锁除与病毒数量有关外，RV引起先天性胆道闭锁，一般发生在生后12h内新生动物，此后新生儿不易发生，考虑可能与免疫有关[11].
, 百拇医药
最近国外研究证明，RV可以在胰腺细胞内生长[12]，RV的基因序列与人类胰岛某部分组织的抗原决定簇高度相似，RV感染可触发或加重遗传易感儿胰岛的自身免疫，导致I型糖尿病的发生[13].也有RV引起急性胰腺炎以及胰高血糖素升高的报道[14].我们的初步调查显示约1.6%患儿可出现胰淀粉酶明显升高且伴有腹痛.我们的动物实验也首次证实人类RV可以侵犯新生小鼠的胰腺，进一步证实人类RV具有嗜胰腺组织的特性.这对将胰腺也列为RV全身感染的监测对象，以及对胰腺受损患儿的远期追踪观察提供了有价值的参考资料.
总之，一旦RV有机会扩散至全身，肝，胆，胰都可能有不同程度的受累.认识这种可能性，对此保持一定的警惕性，在RV腹泻病程中及时诊断这些并发症，尤其某些具有致死性的并发症，早期预防，早期诊断，及时调整治疗方案.合理处理治疗矛盾，对于提高危重症RV感染的治愈率，减少死亡率都具有重要的意义.
4 参考文献1 Mossel EC, Ramig RF. Rotavirus genome segment 7 (NSP3) is adeterminant of extraintestinal spread in the
, 百拇医药
neonatal mouse. J Virol 2002;76:6502-6509
2 Morrison C, Gilson T, Nuovo GJ. Histologic distribution of fatalrotaviral infection: an immunohistochemical and
reverse transcriptase in situ polymerasechain reaction analysis. Hum Pathol 2001;32:216-221
3 李宁,姚英民.轮状病毒多系统感染二例分析.中华儿科杂志 2002;40:141-143
4 李宁,张素娟,姚英民.间接原位RT-PCR方法检测组织中轮状病毒.临床与实验病理学杂志 2001;17: 82-83
, http://www.100md.com
5 施新猷.现代医学实验动物学.第1版.北京:人民军医出版社, 2000:540.
6 McMaster P, HuntR, Wojtulewicz J, Wilcken B. An unusual cause of hepatitis. J PaediatrChild Health2001;37:587-588
7 欧巧群,李宁,姚英民,张传仓.轮状病毒致肝功能损害及其和病毒血症的初步探讨.世界华人消化杂志 2001;9:476-477
8 成军. 慢性丙型病毒肝炎肝脏脂肪变的机制及其意义.世界华人消化杂志 2002;10:999-1003
9 Petersen C, Kuske M, Bruns E, Biermanns D, Wussow PV, MildenbergerH. Progress in developing animal models for
, 百拇医药
biliary atresia. Eur J Pediatr Surg 1998;8:137-141
10 Petersen C, Grasshoff S, Luciano L. Diverse morphology of biliaryatresia in an animal model. J Hepatol
1998;28:603-607
11 Czech-Schmidt G, Verhagen W, Szavay P, Leonhardt J, Petersen C.Immunological gap in the infectious animal
model for biliary atresia. J Surg Res 2001;101:62-67
, http://www.100md.com
12 Coulson BS, Witterick PD, Tan Y, Hewish MJ, Mountford JN, HarrisonLC, Honeyman MC. Growth of rotaviruses in
primary pancreatic cells. J Virol 2002;76:9537-9544
13 Gellert SA, Goldwater PN, Steele CE, Couper JJ, Tait BD, Colman PG,Harrison LC. Association between rotavirus
infection and pancreatic islet autoimmunityin children at risk of developing type 1 diabetes. Diabetes
2000;49:1319-1324
14 姚英民,欧巧群,李宁.轮状病毒肠炎患儿胰高血糖素的变化.世界华人消化杂志 2001;9:112-113, 百拇医药( 姚英民,李 宁,欧巧群)
项目负责人:姚英民,510515,广东省广州市,中国人民解放军第一军医大学南方医院儿科. ningli_cn@hotmail.com
电话:020-85141888-87300 传真:020-61641927
收稿日期:2002-11-19 接受日期:2002-12-02
摘要
目的:进一步了解轮状病毒(RV)全身扩散后对肝、胆、胰的影响，为指导临床的早期诊断与治疗提供有价值参考.
, 百拇医药
方法:观察RV胃肠炎患儿肝、胆、胰损伤的临床表现和化验变化;采用光镜、电镜观察RV胃肠炎死亡患儿，人类RV感染小鼠模型的组织病理变化，采用原位PCR技术获取肝、胆、胰组织RV感染的直接证据.
结果:RV胃肠炎患儿肝酶ALT、AST分别升高者占36.59%和78.05 %，2项均显著升高者占7.32%; 胰淀粉酶显著增高1例，胆指标均在正常范围内.光镜下RV胃肠炎死亡患儿肝细胞浊肿，明显脂肪变性，RV感染小鼠肝窦血管扩张充血、灶性坏死，汇管区和小叶内淋巴细胞、浆细胞浸润，胆道充血，胰腺无明显异常.电镜下RV感染小鼠肝细胞中存在大量脂滴和空泡，肝脏线粒体凝集病变明显，毛细胆管明显扩张，微绒毛脱落.原位PCR结果:RV胃肠炎死亡患儿肠、肝呈阳性，RV感染小鼠胆管上皮细胞和腺体，肝细胞膜、胞质以及枯否细胞胞质，胰腺细胞呈阳性显色.
, 百拇医药
结论:人类RV一旦扩散至全身后，对肝、胆、胰可造成不同程度的损伤.
姚英民,李宁,欧巧群.轮状病毒全身感染对肝胆胰的影响.世界华人消化杂志 2003;11(6):873-875
0 引言轮状病毒(RV)是世界范围内急性感染腹泻病的主要病原体之一，每年有数亿人感染此病，死亡人数达80万之多.近年来， RV也可侵犯全身多个器官，已引起了人们的广泛关注[1-3].我们试图从RV胃肠炎患儿临床表现和化验检查中获取RV感染肠道外消化器官肝胆胰的临床证据;采用光镜、电镜观察RV胃肠炎死亡患儿，人类RV感染小鼠模型组织的病理变化，采用原位PCR技术获取RV感染肝胆胰组织的直接证据.为进一步了解RV对肠外消化器官与组织的影响，为指导临床的早期诊断与治疗提供有价值参考.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 RV感染高峰期来我院就诊的急性腹泻患儿41例，年龄6mo-2岁，临床表现符合儿科学(第四版)关于急性RV胃肠炎的诊断标准，粪便经ELISA检测RV阳性.采取患儿静脉血，检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、胰淀粉酶、直接胆红素、间接胆红素、总胆汁酸水平. ALT和AST≥3倍正常值为明显升高.其他指标≥正常值2倍为明显升高.同时观察肠外消化器官损伤的临床表现.在RV肠炎流行期，2例死亡的RV肠炎患儿，例1，患儿粪便ELISA检测RV++，未检出其他病原菌，在脑脊液、肺组织研磨上清和腹水中以PCR方法检出RV.例2，患儿粪便ELISA检测RV+++.
1.2 人类RV感染新生小鼠 (1)RV来源:RV流行高峰期腹泻患儿临床表现符合急性RV胃肠炎的诊断标准，粪便RV抗原ELISA检测++++，PAGE电泳图形与RVWa株相同. 3份患儿新鲜粪便混合，-37°C冻存过夜，4000 rpm离心30min，取上清，加2倍生理盐水稀释，测pH值为6.9，加青霉素、链霉素各200U/ml 4 °C孵育过夜，0.22mm微孔滤膜过滤.取少量过滤粪上清细菌培养，未发现有细菌生长[5].(2)实验动物:新生清洁级昆明乳鼠，妊娠晚期购回.新生鼠自然娩出，共32只，雌雄各半，3日龄，体重3.5-4.0g，平均3.8 g.试验前大便轮状病毒ELISA和PAGE电泳均为阴性.(3)RV接种小鼠:A组: 8只小鼠灌胃RV悬液0.4ml; B组: 8只小鼠腹腔注射RV悬液0.4mL; C组: 8只小鼠灌胃生理盐水0.4mL作为对照组;D组: 8只小鼠腹腔注射生理盐水0.4mL作为对照组.接种后第3天猝死小鼠.
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1.3 光镜下观察RV胃肠炎死亡患儿病理变化，光镜、电镜下观察接种RV后d3猝死小鼠的病理变化.
1.4 原位RT-PCR间接法 检测 RV腹泻高峰期死亡的2例婴儿尸体解剖存档肝、胆、胰腺石蜡标本.阳性对照: RV感染的MA104细胞;阴性对照: RV感染死亡患儿组织标本RT-PCR反应不加MO-MLV逆转录酶;1例同年龄组非RV感染死亡患儿的组织石蜡标本;空白对照: 杂交液中不加探针. 杂交探针:A组RV Gene9的51-392bp之间的序列，地高辛标记.PCR扩增片断:A 组RV Gene9的51-392bp之间. 具体方法见文献[4].
2 结果
2.1 肝胆胰血液检验结果 急性RV胃肠炎患儿ALT值、AST值分别升高者占36.59%和78.05 %，2项均升高者占34.15%，2项均显著升高者占7.32%，胰淀粉酶1例显著增高，胆指标在正常范围内.
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2.2 RV感染后组织病理改变 光镜下，RV胃肠炎患儿肝呈小叶-弥漫性脂肪变性，肝细胞浊肿-明显变性，胞质内颗粒形成，肝窦受压变窄，胆、胰无明显异常. 腹腔注射组小鼠肝窦血管扩张充血、部分肝细胞浊肿，灶性坏死，肝细胞内有脂滴，汇管区和小叶内淋巴细胞、浆细胞浸润，胆道充血.其他组小鼠脏器未见异常改变.电镜下，腹腔注射组小鼠肝细胞中存在大量脂滴和空泡，细胞之间淋巴细胞，浆细胞浸润显著，粗面内质网扩张，肝脏线粒体肿胀-凝集病变明显，轮廓不清，细胞核固缩-崩解，嵴膜模糊不清，部分毛细胆管明显扩张，微绒毛脱落.
2.3 各脏器RV原位PCR结果 第1例患儿小肠，第2例患儿小肠、肝脏呈阳性.腹腔注射组乳鼠小肠绒毛和肠腺细胞质，胆管上皮细胞和腺体，肝脏细胞膜、胞质以及枯否细胞质，胰腺细胞呈阳性显色. 其他组呈阴性.
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3 讨论RV胃肠炎引起一过性肝酶升高，甚至可在人类的肝细胞内复制，引起RV肝炎已被人们关注[6,7]. 本文临床研究与动物实验均证实RV具有嗜肝组织的特性.在RV胃肠炎患儿中约30%肝酶升高，显著升高者约占7%左右. 其中1例证实RV病毒血症小儿，出现明显高脂血症和脂肪肝，2例RV胃肠炎死亡小儿，可见肝细胞浊肿及明显脂肪变性.镜下证实人类RV感染小鼠，除肝脏的炎症改变外，肝细胞中存在大量脂滴和空泡，由此提示RV所致肝脏损伤如同丙型病毒性肝炎一样也具有肝脏脂肪变的病理特征[8].此外，肝脏超微结构也显示线粒体病变尤为显著，推测RV侵犯肝脏后可能主要影响肝细胞能量代谢的场所，导致能量代谢紊乱，此点恰与某些病毒所致以急性脑病合并肝脂肪变性，以器官线粒体受损组织学改变为特点的瑞氏(Reye)综合征有某些相似之处.
经消化道接种 RV后一般不易造成肠道外感染，或肠道外感染的脏器少，程度较轻.经腹腔接种，RV通过腹膜以及腹腔内的血管和淋巴系统直接转移到靶器官，相当于模拟RV已穿过肠道屏障，人为地造成了RV 病毒血症后，肠道外感染的情况.近来，国外采用此方法建立RV所致的胆汁瘀积，先天性肝外胆管闭锁动物模型，证实RV是导致这一病理改变的最佳病原体之一[9,10].在国外也发现小婴儿先天性胆道闭锁与RV感染有关.我们在急性RV胃肠炎患儿中未发现RV引起胆道病变的病例，但我们动物实验证实人类RV可以引起新生小鼠胆管病变，由此推测RV嗜胆细胞可能具有一定的年龄限制.最近的研究有力的支持了我们的推测，他们发现胆道闭锁除与病毒数量有关外，RV引起先天性胆道闭锁，一般发生在生后12h内新生动物，此后新生儿不易发生，考虑可能与免疫有关[11].
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最近国外研究证明，RV可以在胰腺细胞内生长[12]，RV的基因序列与人类胰岛某部分组织的抗原决定簇高度相似，RV感染可触发或加重遗传易感儿胰岛的自身免疫，导致I型糖尿病的发生[13].也有RV引起急性胰腺炎以及胰高血糖素升高的报道[14].我们的初步调查显示约1.6%患儿可出现胰淀粉酶明显升高且伴有腹痛.我们的动物实验也首次证实人类RV可以侵犯新生小鼠的胰腺，进一步证实人类RV具有嗜胰腺组织的特性.这对将胰腺也列为RV全身感染的监测对象，以及对胰腺受损患儿的远期追踪观察提供了有价值的参考资料.
总之，一旦RV有机会扩散至全身，肝，胆，胰都可能有不同程度的受累.认识这种可能性，对此保持一定的警惕性，在RV腹泻病程中及时诊断这些并发症，尤其某些具有致死性的并发症，早期预防，早期诊断，及时调整治疗方案.合理处理治疗矛盾，对于提高危重症RV感染的治愈率，减少死亡率都具有重要的意义.
4 参考文献1 Mossel EC, Ramig RF. Rotavirus genome segment 7 (NSP3) is adeterminant of extraintestinal spread in the
, 百拇医药
neonatal mouse. J Virol 2002;76:6502-6509
2 Morrison C, Gilson T, Nuovo GJ. Histologic distribution of fatalrotaviral infection: an immunohistochemical and
reverse transcriptase in situ polymerasechain reaction analysis. Hum Pathol 2001;32:216-221
3 李宁,姚英民.轮状病毒多系统感染二例分析.中华儿科杂志 2002;40:141-143
4 李宁,张素娟,姚英民.间接原位RT-PCR方法检测组织中轮状病毒.临床与实验病理学杂志 2001;17: 82-83
, http://www.100md.com
5 施新猷.现代医学实验动物学.第1版.北京:人民军医出版社, 2000:540.
6 McMaster P, HuntR, Wojtulewicz J, Wilcken B. An unusual cause of hepatitis. J PaediatrChild Health2001;37:587-588
7 欧巧群,李宁,姚英民,张传仓.轮状病毒致肝功能损害及其和病毒血症的初步探讨.世界华人消化杂志 2001;9:476-477
8 成军. 慢性丙型病毒肝炎肝脏脂肪变的机制及其意义.世界华人消化杂志 2002;10:999-1003
9 Petersen C, Kuske M, Bruns E, Biermanns D, Wussow PV, MildenbergerH. Progress in developing animal models for
, 百拇医药
biliary atresia. Eur J Pediatr Surg 1998;8:137-141
10 Petersen C, Grasshoff S, Luciano L. Diverse morphology of biliaryatresia in an animal model. J Hepatol
1998;28:603-607
11 Czech-Schmidt G, Verhagen W, Szavay P, Leonhardt J, Petersen C.Immunological gap in the infectious animal
model for biliary atresia. J Surg Res 2001;101:62-67
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12 Coulson BS, Witterick PD, Tan Y, Hewish MJ, Mountford JN, HarrisonLC, Honeyman MC. Growth of rotaviruses in
primary pancreatic cells. J Virol 2002;76:9537-9544
13 Gellert SA, Goldwater PN, Steele CE, Couper JJ, Tait BD, Colman PG,Harrison LC. Association between rotavirus
infection and pancreatic islet autoimmunityin children at risk of developing type 1 diabetes. Diabetes
2000;49:1319-1324
14 姚英民,欧巧群,李宁.轮状病毒肠炎患儿胰高血糖素的变化.世界华人消化杂志 2001;9:112-113, 百拇医药( 姚英民,李 宁,欧巧群)
