多种因子在门脉高压大鼠空肠黏膜中的表达
黄穰浪,尹朝晖, 刘浔阳,黄飞舟, 任树平,中南大学湘雅三医院普外科 湖南省长沙市 410013
项目负责人:刘浔阳,410013, 湖南省长沙市,中南大学湘雅三医院普外科.sevenwolf@sina.com
电话:0731-8618098 传真:0731-8921910
收稿日期:2003-05-14 接受日期:2003-06-02
摘要
目的:探讨多种因子在门脉高压大鼠空肠黏膜中的表达及其意义.
, http://www.100md.com
方法:实验组大鼠行门静脉搏两步结扎加左肾上腺静脉结扎；应用免疫组化S-P染色法检测iNOS、ecNOS、ET-1、VEGF及TNF-a在大鼠空肠黏膜中的表达情况.
结果:实验组iNOS、ecNOS、ET-1、VEGF及TNF-a表达较对照组增强，VEGF无明显变化.
结论:iNOS、ecNOS、ET-1、VEGF及TNF-a参与门脉高压大鼠空肠黏膜局部病变.
黄穰浪,尹朝晖, 刘浔阳,黄飞舟, 任树平.多种因子在门脉高压大鼠空肠黏膜中的表达.世界华人消化杂志 2003;11(12):2034-2035
0 引言随着门脉高压性小肠病变(portalhypertensive enteropathy，PHE)[1]概念的提出，局部体液因子的改变在PHE病因学中的作用渐受到关注.但有关此方面的报道甚少.本文选取具有不同作用的一氧化氮合醇(NOS)、内皮素1(ET-1)，血管内皮生长因于(VEGF)及肿瘤坏死因子a(TNF-a)，应用免疫组化技术检测他们在门脉高压大鼠空肠黏膜局部的表达情况.以期探讨门脉高压大鼠空肠黏膜病变中体液因子的变化及其意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物与分组:20 mo♂SD大鼠(体重225-275g，购自中南大学湘雅医学院实验动物中心)随机分成实验组与对照组.实验组行门静脉两步法结扎加左肾上腺静脉结扎手术;对照组为假手术组.
试剂: 兔抗大鼠ecNOS多克隆抗体、兔抗大鼠iNOS多克隆抗体、兔抗大鼠ET-1多克隆抗体、小鼠抗大鼠VEGF单克隆抗体、山羊抗大鼠TNF-a多克隆抗体、通用型s-P染色试剂盘、生物素标记兔抗山羊IgG染色试剂盘及DAB购自北京中山生物技术有限公司.
1.2 方法 动物模型制备：对Tanoueet al [2]方法加以改进，应用门静脉两步法结扎加左肾上腺静脉结扎制备门脉高压大鼠模型，筒言之，先行门静脉部分姑扎加左肾上腺静脉结扎，1wk后收紧皮下门静脉结扎线使其完全阻断.
, 百拇医药
门静脉完全结扎2wk后，将两组大鼠于麻醉后开腹，找到肠系膜上静脉，剪一小口，将一根充满生理盐水的硬膜外导管置入静脉近端，静脉远端结扎;将硬膜外导管前端轻轻送至肠系膜上静脉与脾静脉汇合部，结扎固定后，提起硬膜外导管远端进行门静脉压力的测定，以鼠右心房水平为“0”点后.其后小心切除小段空肠(距空肠悬韧带5cm)，常规固定、脱水、透明、五蜡包埋.
免疫组化SP染色法:抗原悸复(NOS、ET-1且VEGF应用EDTA煮沸20min; TNF-a应用柠檬酸缓冲液煮沸20min，余同说明;DAB显色; PBS代替一抗作阴性对照.判断标准:iNOS、ecNOS、ET-1、TNF-a、及VEGF反应产物的染色强度以光密度值(opticaldensity，A值)表示.选取空肠的不同部位(黏膜、黏膜下层、肌层)，每一部位随机选5处，应用计算机糖助HPIAS-1000图像分析系统测定反应产物的加值(若无记为0)，每一标本取平均A值.
统计学处理 应用SPSSI0.0for window统计软件分析，检测数据以表示，组间比较采用t检验. P
2 结果
2.1 一般情况及静脉压力 实验组大鼠腹壁血管、小肠系膜血管扩张较对照组明显;实验组大鼠有两只可见腹腔内有少量腹水生成，余大鼠及对照组未见明显腹水生成;实验组大鼠门静脉压力较对照组明显升高(20.90±3.27cm H2O vs 11.43±1.55 cm H2O，P<0.01).
2.2 NOS与ecNOS表达情况 iNOS与ecN0S表达阳性细胞为胞质内棕黄色颗粒，可见于黏膜上皮、肠腺腺腔、黏膜下层血管内皮，同时在黏膜表面及肌层也可见黄染产物.实验组iNOS及ecNOS的表达强度皆高于对照组(2.71±0.54vs 2.03±0.96，2.66±0.50vs 1.94±0.43，P<0.05).
2.3 ET-1表达情况 ET-1表达阳性为棕黄色颗粒，主要见于黏膜下层，黏膜表面，黏膜上皮.肌层可见少量黄染产物.实验组表达强度高于对照组(1.87±0.52vs 1.15±0.41，P<0.05).
, 百拇医药
2.4 VEGF表达情况 阳性细胞可见胞质内棕黄色颗粒或胞膜黄染，主要见于食管黏膜上皮、黏膜下层血管内皮，同时在黏膜及黏膜下层间质也可见黄染产物.VEGF的表达强度在两组中未见明显差异(0.60±0.11vs 0.57±0.21. P >0.05).
2.5 TNF-a表达情况 阳性表达于黏膜层可见黄染产物，阳性细胞为胞质内可见棕黄色颗粒;实验组表达较对照组增强(1.98±0.64vs 1.51±0.60，P<0.05).
3 讨论门脉高压症小肠黏膜病变发病机至今尚不清楚.随着对门静脉高压症胃黏膜病变认识的加深，血管活性因子等体液因子在PHE中的作用如何受到关注，但国内尚无相关报道.本研究中门静脉完全结扎2wk后，实验组大鼠门静脉压力较对照组明显升高，认为门脉高压大鼠模型制作成功.
, 百拇医药
内源性NO是一种强烈的血管舒张因子，由于NO稳定性差，半衰期甚短，直接测定十分困难，作为合成NO的惟一限速酶NOS成为研究NO的重要手段.本研究中. 空肠中iNOS及ecNOS的表达强度皆高于对照组.推翻其升高可能是由于升高的门脉压力使肠道血流回流受阻，肠道淤血、水肿，肠黏膜屏障受损，毒素物质移位、入血，同时由于回流受阻，高毒素血液在肠局部较长时间刺激血管内皮等，使NOS生成增加，也必然使NO生成增加.致血管扩张，加重淤血.Gusdlandi[3]尚认为NO使平滑肌舒张，调节胃肠动力，NO升高使肠运动功能减弱.延长了黏膜与损伤因素接触时间，从而加剧肠黏膜损伤.
ET-l通过其受体起多效性的生物作用.有研究认为门脉高压时大鼠肠系膜动脉ET-1表达升高，可使血管收缩，减少肠道充血;对于门脉高压症肠道黏膜中ET-1表达情况尚末见报道.本研究中，ET-1在实验组表达强度高于对照组.升高机制可能为扩血管物质升高后的代偿性增加，但由于ET-1尚可诱导黏膜损伤[4]，过量表达的ET-1必然会使肠道黏膜进一步受损.
, http://www.100md.com
本研究中TNF-a在实验组表达强度高于对照组，升高可能为肠道黏膜屏障受损，毒素物质移位，诱使肠道黏膜局部TNF-a生成增加.TNF-a不仅可激活ET-1基因[5]，也可激活NOS基因[6,7]，从而参与门脉高压症后黏膜病变过程；同时TNF-a尚可增加血管通透性[8]，其升高必然加重肠道病变.
VEGF既可促进新生血管形成，加快受损组织修复.也可增加直管通透性，使间质水肿，加重局部病变.但本研究中二组间无明显差异，可能在门脉高压症小肠黏膜病变中VEGF无特殊意义.
由此可见，门脉高压小肠黏膜病变是多因素共同作用的结果，其机制尚有待进一步阐明.
4 参考文献1 Viggiano TR, Gostout CJ. Portal hypertnsive intestinal vasulopathy:a review of the clinical, endosopic, ahd
, http://www.100md.com
histopathologic features. Am JGastroenterol 1992;87:944-954
2 Tanoue K, Kitano S, Hashizume M, Wada H, Sugimachi K. A rat modelof esophageal varices. Hepatlogy
1991;13:353-358
3 Gusdlandi M. Nitric oxide: an ubiquitous actor in thegastrointestinal tract. Dig Dis 1994;12:28-32
4 Lazaratos S, Kashimura H, Nakahara A, Fukutomi H, Osuga T,Urushidani T, Miyauchi T, Goto K. Gastric ulcer induced
, 百拇医药
by submucosal injection of ET-1:role orpotent vasoconstriction and intraluminal acid. Am J Physiol
1993;265(3 Pt 1):G491-G498
5 Marsden PA, Brenner BM. Transcriptional regulation of theendothelin-1 gene by TNF-alpha. Am J Physiol
1992;262(4 Pt 1):C854-C861
6 Lopez-Talavera JC, Cadelina G, Olchowski J, Merrill W, GroszmannRJ. Thalidomide inhibits tumor necrosis factor
, http://www.100md.com
alpha, decreases nitric oxide synthesis,and ameliorates the hyperdynamic circulatory syndrome in portal-hypertensive
rats. Hepatology 1999;23:1616-1621
7 Ohta M, Tarnawski AS, Itani R, Pai R, Tomikawa M, Sugimachi K,Sarfeh IJ. Tumor necrosis factor alpha regulates
nitric oxide synthase expression in portalhypertensive gastric mucosa of ratx. Hepatology 1998;27:906-913
8 Stephens KE, Ishizaka A, Larrick JW, Raffin TA.Tumor necrosisfactor causes increased pulmonary permeability and
edema. Comparison to septic acute lunginjury. Am Rev Respir Dis 1988;137:1364-1370, 百拇医药( 黄穰浪, 尹朝晖, 刘浔阳, 黄飞舟, 任树平)
项目负责人:刘浔阳,410013, 湖南省长沙市,中南大学湘雅三医院普外科.sevenwolf@sina.com
电话:0731-8618098 传真:0731-8921910
收稿日期:2003-05-14 接受日期:2003-06-02
摘要
目的:探讨多种因子在门脉高压大鼠空肠黏膜中的表达及其意义.
, http://www.100md.com
方法:实验组大鼠行门静脉搏两步结扎加左肾上腺静脉结扎；应用免疫组化S-P染色法检测iNOS、ecNOS、ET-1、VEGF及TNF-a在大鼠空肠黏膜中的表达情况.
结果:实验组iNOS、ecNOS、ET-1、VEGF及TNF-a表达较对照组增强，VEGF无明显变化.
结论:iNOS、ecNOS、ET-1、VEGF及TNF-a参与门脉高压大鼠空肠黏膜局部病变.
黄穰浪,尹朝晖, 刘浔阳,黄飞舟, 任树平.多种因子在门脉高压大鼠空肠黏膜中的表达.世界华人消化杂志 2003;11(12):2034-2035
0 引言随着门脉高压性小肠病变(portalhypertensive enteropathy，PHE)[1]概念的提出，局部体液因子的改变在PHE病因学中的作用渐受到关注.但有关此方面的报道甚少.本文选取具有不同作用的一氧化氮合醇(NOS)、内皮素1(ET-1)，血管内皮生长因于(VEGF)及肿瘤坏死因子a(TNF-a)，应用免疫组化技术检测他们在门脉高压大鼠空肠黏膜局部的表达情况.以期探讨门脉高压大鼠空肠黏膜病变中体液因子的变化及其意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物与分组:20 mo♂SD大鼠(体重225-275g，购自中南大学湘雅医学院实验动物中心)随机分成实验组与对照组.实验组行门静脉两步法结扎加左肾上腺静脉结扎手术;对照组为假手术组.
试剂: 兔抗大鼠ecNOS多克隆抗体、兔抗大鼠iNOS多克隆抗体、兔抗大鼠ET-1多克隆抗体、小鼠抗大鼠VEGF单克隆抗体、山羊抗大鼠TNF-a多克隆抗体、通用型s-P染色试剂盘、生物素标记兔抗山羊IgG染色试剂盘及DAB购自北京中山生物技术有限公司.
1.2 方法 动物模型制备：对Tanoueet al [2]方法加以改进，应用门静脉两步法结扎加左肾上腺静脉结扎制备门脉高压大鼠模型，筒言之，先行门静脉部分姑扎加左肾上腺静脉结扎，1wk后收紧皮下门静脉结扎线使其完全阻断.
, 百拇医药
门静脉完全结扎2wk后，将两组大鼠于麻醉后开腹，找到肠系膜上静脉，剪一小口，将一根充满生理盐水的硬膜外导管置入静脉近端，静脉远端结扎;将硬膜外导管前端轻轻送至肠系膜上静脉与脾静脉汇合部，结扎固定后，提起硬膜外导管远端进行门静脉压力的测定，以鼠右心房水平为“0”点后.其后小心切除小段空肠(距空肠悬韧带5cm)，常规固定、脱水、透明、五蜡包埋.
免疫组化SP染色法:抗原悸复(NOS、ET-1且VEGF应用EDTA煮沸20min; TNF-a应用柠檬酸缓冲液煮沸20min，余同说明;DAB显色; PBS代替一抗作阴性对照.判断标准:iNOS、ecNOS、ET-1、TNF-a、及VEGF反应产物的染色强度以光密度值(opticaldensity，A值)表示.选取空肠的不同部位(黏膜、黏膜下层、肌层)，每一部位随机选5处，应用计算机糖助HPIAS-1000图像分析系统测定反应产物的加值(若无记为0)，每一标本取平均A值.
统计学处理 应用SPSSI0.0for window统计软件分析，检测数据以表示，组间比较采用t检验. P
2 结果
2.1 一般情况及静脉压力 实验组大鼠腹壁血管、小肠系膜血管扩张较对照组明显;实验组大鼠有两只可见腹腔内有少量腹水生成，余大鼠及对照组未见明显腹水生成;实验组大鼠门静脉压力较对照组明显升高(20.90±3.27cm H2O vs 11.43±1.55 cm H2O，P<0.01).
2.2 NOS与ecNOS表达情况 iNOS与ecN0S表达阳性细胞为胞质内棕黄色颗粒，可见于黏膜上皮、肠腺腺腔、黏膜下层血管内皮，同时在黏膜表面及肌层也可见黄染产物.实验组iNOS及ecNOS的表达强度皆高于对照组(2.71±0.54vs 2.03±0.96，2.66±0.50vs 1.94±0.43，P<0.05).
2.3 ET-1表达情况 ET-1表达阳性为棕黄色颗粒，主要见于黏膜下层，黏膜表面，黏膜上皮.肌层可见少量黄染产物.实验组表达强度高于对照组(1.87±0.52vs 1.15±0.41，P<0.05).
, 百拇医药
2.4 VEGF表达情况 阳性细胞可见胞质内棕黄色颗粒或胞膜黄染，主要见于食管黏膜上皮、黏膜下层血管内皮，同时在黏膜及黏膜下层间质也可见黄染产物.VEGF的表达强度在两组中未见明显差异(0.60±0.11vs 0.57±0.21. P >0.05).
2.5 TNF-a表达情况 阳性表达于黏膜层可见黄染产物，阳性细胞为胞质内可见棕黄色颗粒;实验组表达较对照组增强(1.98±0.64vs 1.51±0.60，P<0.05).
3 讨论门脉高压症小肠黏膜病变发病机至今尚不清楚.随着对门静脉高压症胃黏膜病变认识的加深，血管活性因子等体液因子在PHE中的作用如何受到关注，但国内尚无相关报道.本研究中门静脉完全结扎2wk后，实验组大鼠门静脉压力较对照组明显升高，认为门脉高压大鼠模型制作成功.
, 百拇医药
内源性NO是一种强烈的血管舒张因子，由于NO稳定性差，半衰期甚短，直接测定十分困难，作为合成NO的惟一限速酶NOS成为研究NO的重要手段.本研究中. 空肠中iNOS及ecNOS的表达强度皆高于对照组.推翻其升高可能是由于升高的门脉压力使肠道血流回流受阻，肠道淤血、水肿，肠黏膜屏障受损，毒素物质移位、入血，同时由于回流受阻，高毒素血液在肠局部较长时间刺激血管内皮等，使NOS生成增加，也必然使NO生成增加.致血管扩张，加重淤血.Gusdlandi[3]尚认为NO使平滑肌舒张，调节胃肠动力，NO升高使肠运动功能减弱.延长了黏膜与损伤因素接触时间，从而加剧肠黏膜损伤.
ET-l通过其受体起多效性的生物作用.有研究认为门脉高压时大鼠肠系膜动脉ET-1表达升高，可使血管收缩，减少肠道充血;对于门脉高压症肠道黏膜中ET-1表达情况尚末见报道.本研究中，ET-1在实验组表达强度高于对照组.升高机制可能为扩血管物质升高后的代偿性增加，但由于ET-1尚可诱导黏膜损伤[4]，过量表达的ET-1必然会使肠道黏膜进一步受损.
, http://www.100md.com
本研究中TNF-a在实验组表达强度高于对照组，升高可能为肠道黏膜屏障受损，毒素物质移位，诱使肠道黏膜局部TNF-a生成增加.TNF-a不仅可激活ET-1基因[5]，也可激活NOS基因[6,7]，从而参与门脉高压症后黏膜病变过程；同时TNF-a尚可增加血管通透性[8]，其升高必然加重肠道病变.
VEGF既可促进新生血管形成，加快受损组织修复.也可增加直管通透性，使间质水肿，加重局部病变.但本研究中二组间无明显差异，可能在门脉高压症小肠黏膜病变中VEGF无特殊意义.
由此可见，门脉高压小肠黏膜病变是多因素共同作用的结果，其机制尚有待进一步阐明.
4 参考文献1 Viggiano TR, Gostout CJ. Portal hypertnsive intestinal vasulopathy:a review of the clinical, endosopic, ahd
, http://www.100md.com
histopathologic features. Am JGastroenterol 1992;87:944-954
2 Tanoue K, Kitano S, Hashizume M, Wada H, Sugimachi K. A rat modelof esophageal varices. Hepatlogy
1991;13:353-358
3 Gusdlandi M. Nitric oxide: an ubiquitous actor in thegastrointestinal tract. Dig Dis 1994;12:28-32
4 Lazaratos S, Kashimura H, Nakahara A, Fukutomi H, Osuga T,Urushidani T, Miyauchi T, Goto K. Gastric ulcer induced
, 百拇医药
by submucosal injection of ET-1:role orpotent vasoconstriction and intraluminal acid. Am J Physiol
1993;265(3 Pt 1):G491-G498
5 Marsden PA, Brenner BM. Transcriptional regulation of theendothelin-1 gene by TNF-alpha. Am J Physiol
1992;262(4 Pt 1):C854-C861
6 Lopez-Talavera JC, Cadelina G, Olchowski J, Merrill W, GroszmannRJ. Thalidomide inhibits tumor necrosis factor
, http://www.100md.com
alpha, decreases nitric oxide synthesis,and ameliorates the hyperdynamic circulatory syndrome in portal-hypertensive
rats. Hepatology 1999;23:1616-1621
7 Ohta M, Tarnawski AS, Itani R, Pai R, Tomikawa M, Sugimachi K,Sarfeh IJ. Tumor necrosis factor alpha regulates
nitric oxide synthase expression in portalhypertensive gastric mucosa of ratx. Hepatology 1998;27:906-913
8 Stephens KE, Ishizaka A, Larrick JW, Raffin TA.Tumor necrosisfactor causes increased pulmonary permeability and
edema. Comparison to septic acute lunginjury. Am Rev Respir Dis 1988;137:1364-1370, 百拇医药( 黄穰浪, 尹朝晖, 刘浔阳, 黄飞舟, 任树平)
