高压氧加自由基拮抗剂对大鼠肝脏基质金属蛋白酶-2表达的影响
张爱凤,陈平圣, 李晓冰,刘东风,东南大学基础医学院病理学与病理生理学系 江苏省南京市 210009
张丽达,东南大学附属中大医院高压氧科 江苏省南京市 210009
张爱凤,女, 1972-04-16生,黑龙江虎林市人,讲师, 主要从事肝脏病理研究.
项目负责人:张爱凤,210009, 江苏省南京市,东南大学基础医学院病理学与病理生理学系. aifengzh@sina.com.cn
电话:025-3272507-1
收稿日期:2003-05-10 接受日期:2003-06-02
Effectsof hyperbaric oxygen with anti-free radicals on expression of matrixmetalloproteinase-2 in rat liver
Ai-FengZhang, Ping-Sheng Chen, Xiao-Bing Li, Li-Da Zhang, Dong-Feng Liu
Ai-FengZhang, Ping-Sheng Chen, Xiao-Bing Li, Dong-Feng Liu, Department ofPathology and Pathophysiology, College of Basic Medicine, SoutheastUniversity, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
Li-Da Zhang, Department of Hyperbaric Oxygen, the Affiliated Hospital,Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
Correspondence to: Ai-Feng Zhang, Department of Pathology andPathophysiology, College of Basic Medicine, Southeast University, Nanjing210009, Jiangsu Province, China. aifengzh@sina.com.cn
Received: 2003-05-10 Accepted:2003-06-02
AbstractAIM: To study the effects of hyperbaric oxygen combined with freeradical antagonists (HFr) on the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2) at the early stage of liver injury and fibrogenesis in rat.
METHODS:A liver fibrosis model was induced by carbon tetrachloride (CCl4)in Wistar rats, and the rats were exposed to hyperbaric oxygen, freeradical antagonists and both of them combined together respectively duringthe 2nd and 8th week. Serum hylaluronate (HA) level was detected byradioimmunoassay to explore extra cellular matrix changes. The content ofMMP-2 and TGF-b1,which was a kind of growth factor being able to regulate the expression ofMMP-2, were examined by immunohistochemical staining. A semi-quantitativeRT-PCR method was used to evaluate MMP-2 mRNA expression.
RESULTS:The hepatocytic injury including fatty degener-ation, hydropic changes andspotty necrosis in HFr group was lighter than that in model group at the2nd weekend, meanwhile, the MMP-2 protein expression and mRNA level, TGF-b1protein expression of the liver tissues were lower than those in the modelsignificantly (MMP-2:5.04±1.34vs 56.75±3.03,P <0.01; MMP-2 mRNA: 0.155 ±0. 005 vs 0.547±0.013,P <0.01; TGF-b1:3.28±0.33vs 4.96±0.28,P<0.01). The level of serum HA was also lower than that in themodel, but not significantly. At the 8th weekend, in the model, fibrousconnective tissue proliferated markedly in hepatic lobules, formingfibrous septa. Fatty degeneration, hydropic changes were observed in HFrgroup, in which the expression of MMP-2 protein and its mRNA, TGF-b1protein, serum HA were all lower significantly compared with the models(MMP-2: 12.53±2.51vs 160.57±5.54,P <0.01; MMP-2 mRNA: 0.506±0.013vs 0.685±0.014,P <0.01;TGF-b1:4.97±0.35vs 7.76±0.39,P <0.01; HA: 116.8±17.7mg/L-1vs 87.8±31.6mg/L-1P <0.01). In addition, the hepatocytic lesions in hyperbaricoxygen group, free radical antagonists group were similar to that inmodel, but somewhat mild. MMP-2 and TGF-b1proteins, MMP-2 mRNA expression in hyperbaric oxygen group were lower thanthat in the model.
CONCLUSION:Hyperbaric oxygen with free radical antagonists can decrease theexpression of MMP-2 in rat liver damaged by CCl4, delaying thedevelopment of liver fibrosis.
ZhangAF, Chen PS, Li XB, Zhang LD, Liu DF. Effects of hyperbaric oxygen withanti-free radicals on expression of matrix metalloproteinase-2 in ratliver. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003;11(12):1909-1914
摘要
目的:观察高压氧加自由基拮抗剂对大鼠肝脏损伤早期及肝纤维化形成过程中肝脏基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响
方法:用CCl4建立大鼠肝纤维化模型，在2wk和8 wk分别给予高压氧结合自由基拮抗剂、高压氧、自由基拮抗剂处理，放免法测定血清透明质酸(HA)的含量，以了解细胞外基质合成情况，免疫组化法检测肝组织MMP-2蛋白以及其调节相关的生长因子TGF-b1蛋白的表达;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MMP-2mRNA水平.
结果:实验2 wk末模型组高压氧结合自由基拮抗剂组肝脂肪变性和水样变性及点状坏死与模型组相比明显减轻，MMP-2蛋白及mRNA，TGF-β1蛋白表达均低于模型组，差异显著(MMP-2:5.04±1.34vs 56.75±3.03，P<0.01;MMP-2 mRNA : 0.155±0. 005 vs 0.547±0.013，P<0.01; TGF-b1:3.28±0.33 vs 4.96±0.28，P<0.01). 血清HA虽低于模型组，但无显著差异(P>0.05). 实验8wk末模型组肝小叶内纤维结缔组织增生明显并形成粗细不等的纤维条索，高压氧结合自由基拮抗剂组以肝细胞脂变和细胞水肿为主，纤维结缔组织无明显增生，肝组织MMP-2蛋白及mRNA，TGF-b1蛋白表达和血清HA水平与模型组相比均明显为低(MMP-2:12.53±2.51 vs 160.57±5.54，P<0.01;MMP-2 mRNA :0.506±0.013 vs 0.685±0.014，P<0.01;TGF-b1:4.97±0.35 vs 7.76±0.39，P<0.01; HA: 116.8±17.7 mg/Lvs 87.8±31.6 mg/LP <0.01). 高压氧组、自由基拮抗剂组在2wk末和8 wk末肝损伤略轻于模型组，MMP-2蛋白和TGF-b1蛋白表达均低于模型组，且高压氧组MMP-2mRNA表达亦较模型组低.
结论:高压氧结合自由基拮抗剂可以降低CCl4损伤大鼠肝脏MMP-2表达，可以迟滞肝纤维化病变的发展.
张爱凤,陈平圣, 李晓冰,张丽达, 刘东风.高压氧加自由基拮抗剂对大鼠肝脏基质金属蛋白酶-2表达的影响.世界华人消化杂志 2003;11(12):1909-1914
0 引言肝纤维化是各种慢性肝病共有的病理改变[1-3]，在其发生发展过程中由于细胞外基质生成和降解失衡，大量细胞外基质在肝内沉积，使得肝窦毛细血管化，血管改建乃至纤维间隔形成等均可使肝组织常存在不同程度的缺氧[4].研究表明肝星状细胞(HSC)是氧敏感性细胞，其活化是肝纤维化发生发展的中心环节[5-7]，亦是肝脏内基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的主要来源;而MMP-2能降解HSC周围的IV胶原，改变该细胞的微环境，促进其活化，活化的HSC发生增生、表型改变，促进ECM形成，各种细胞因子[8,9]及基质降解酶的释放.高压氧改善肝硬化患者的肝功能储备和治疗病毒性肝炎及肝内胆汁淤积性黄疸，效果较好[10-13]，但用高压氧改善肝组织缺氧后，对肝纤维化发生发展有何影响特别是对HSCMMP-2表达有无调节作用，尚无报道.我们用高压氧来处理CCl4肝损伤大鼠同时加用自由基拮抗剂消除高压氧可能导致的自由基产生增多的副作用，观察其对大鼠肝损伤组织的保护作用以及对肝脏基质金属蛋白酶-2表达的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar♂大鼠60只，体质量150±10g，由河南医科大学动物中心提供，随机分成5组，每组12只，分笼饲养，按昼夜时程，在室温及稳定温度条件下，用平衡饲料饲养.(1)模型组 以500mL/L CCl4 (上海试剂一厂生产，精制花生油配置)皮下注射，3mL/kg，首次给予75%，2次/wk，共8wk; (2)高压氧组诱导肝损伤同模型组，实验后2wk和8 wk给予高压氧.(995 mL/L氧气冲舱5min，10 min升压至2个kPa，维持1h后，减压15min，持续1wk). (3)自由基拮抗剂组 自由基拮抗剂VitC针剂(扬子江制药股份有限公司)、VitE胶囊(南京制药三厂)茶多酚(福建天宝生物化工厂)各100mg/kg，1次/d，诱导肝损伤同模型组，实验2 wk和8wk开始给予灌胃，持续1wk. (4)高压氧结合自由基拮抗剂组 诱导肝损伤同模型组，在给予高压氧的同时给与自由基拮抗剂，时间和剂量不变;(5)对照组正常饲养，于2wk和8 wk开始给予生理盐水灌胃，持续1wk. 各组均于实验2wk末和8 wk末处死6只动物，自下腔静脉取血，分离血清备用，取相同肝叶肝组织，分别置于中性缓冲甲醛溶液固定、经液氮速冻后置于-70°C备用.
1.2方法
1.2.1 肝脏组织病理学和血清透明质酸(HA)检测 常规HE染色，光学显微镜下观察.按试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明，用放射免疫法检测血清透明质酸的含量.
1.2.2 肝组织TGF-_/bb_1、MMP-2的表达 石蜡切片，免疫组织化学SP法.TGF-b1(mAb，SantaCruz产品，购自北京中山生物技术有限公司)工作液浓度为1:200，MMP-2(mAb，Calbiochem产品)工作液浓度为1:100.TGF-b1阳性结果判断:每张切片选择左、中、右各2个高倍视野，根据染色强度赋值为A:淡黄1，黄色2，棕黄色3;染色部位为B:着色在中央静脉和汇管区分别计1分，染色范围计为C:阳性染色向肝小叶内延伸在1/3内为1分，1/3-2/3为2分，超过2/3者计3分，计算总阳性指数为B*A+C*A，计算每例标本阳性指数(每例6个视野阳性染色之和/6).MMP-2阳性结果判断:每张切片选择左、中、右各2个高倍视野，计算阳性细胞数，并对每个阳性细胞胞质染色强度赋值(淡黄1，黄色2，棕黄色3)计算每例标本阳性指数(每例6个视野阳性细胞赋值之和/6).
1.2.3 RT-PCR检测MMP-2的表达 参照说明书用Trizol试剂从大鼠肝脏组织中抽提RNA，真空干燥后，溶解于无RNase水中，-70°C保存备用.使用前取上述RNA溶液稀释，测定A260/A280值，计算RNA浓度.取总RNA 2 mg进行逆转录，再以逆转录反应液4mL作为模板，加入相应引物(上海申能博采生物有限公司合成)进行PCR扩增.MMP-2引物[14]:正义: 5’-ACCATC GCC CAT CAT CAA GT -3’反义5’-CGAGCA AAA GCA TCA TCC AC-3’位于563-582和891-910处，扩增片段产物长度328bp. b-actin作为内参照，正义:5’-CCC TGG ACT TCG AGC AAG AGA T -3’反义5’-GTTTTC TGC GCA AGT TAG G-3’扩增片段产物长度531bp. 总反应体积25mL，首先94°C变性2min，以后94 °C 1 min→62 °C 30 s →72 °C 1 min，进行32个循环.72 °C 10 min终止反应.PCR产物经18g/L琼脂糖凝胶(含0.5mg/L溴化乙锭)电泳，拍照，密度扫描，得到各扩增带峰面积.用 b-actin校正后用其表达量和b-actin表达量比值进行比较.
统计学处理 结果以表示，组间比较采用t或t’检验P<0.05为差异显著.
2 结果
2.1肝脏病理学改变和血清HA 实验2wk末，正常对照组肝小叶结构清晰，肝细胞无变性坏死、炎细胞浸润和纤维结缔组织增生.模型组肝细胞广泛脂肪变性和水样变性及点状坏死，汇管区有较多的炎细胞浸润.高压氧组、自由基拮抗剂组以及高压氧结合自由基拮抗剂组与模型组相比肝细胞损伤程度和范围均有所减轻，以高压氧结合自由基拮抗剂组最为明显，仅仅在肝小叶中央区肝细胞呈轻度脂肪变性，汇管区无炎细胞浸润.实验8 wk末，模型组可见纤维结缔组织增生形成粗细不等的纤维条索穿插于肝小叶内，肝小叶内尚有散在分布的不同程度脂肪变性的肝细胞及再生的肝细胞，汇管区明显增宽伴大量炎细胞浸润.高压氧组、自由基拮抗剂组与模型组相比，肝组织内纤维结缔组织增生程度及炎细胞浸润均减轻，高压氧结合自由基拮抗剂组仅表现为肝细胞脂变和细胞水肿为主，在汇管区有少许纤维结缔组织增生，见图1-4.
图1 模型组(2wk末)肝细胞广泛脂肪变性细胞水肿及点状坏死HE×100.
图2高压氧结合自由基拮抗剂组(2wk末)肝细胞损伤明显减轻小叶中央区轻度脂变HE×100.
图3模型组(8周末)纤维结缔组织增生形成粗细不等的纤维条索穿插于肝小叶内HE×100.
模型组和各实验组大鼠血清HA的水平均较正常对照组升高，实验2wk末高压氧组和自由基拮抗剂组及高压氧结合自由基拮抗剂组HA水平较低，但与模型组相比，无显著差异(P>0.05); 实验8wk末，模型组与对照组相比HA水平较高，高压氧组和高压氧结合自由基拮抗剂组与模型组相比，血清HA较低，以高压氧结合自由基拮抗剂组HA水平最低(P<0.01，见表1).
图4 高压氧结合自由基拮抗剂组(8wk末)肝细胞脂变及细胞水肿无纤维结缔组织增生HE×100.
表1 大鼠血清HA水平的变化(mg/L, ,n=6)
bP<0.01, vs正常对照组;dP <0.01, cP <0.05, vs模型组.
表2 大鼠肝脏MMP-2和TGF-b1蛋白表达积分(分 ,n=6)
bP<0.01，vs正常对照组; dP<0.01，cP<0.05，vs模型组
2.2肝组织MMP-2 ，TGF-_/bb_1的表达 正常对照组可见MMP-2阳性细胞呈星状散在分布于肝窦周细胞(主要为星状细胞)、血管内皮细胞，着色较淡，2wk末、8 wk末模型组MMP-2明显高于对照组(P<0.01)，且8wk末在纤维间隔和增宽的汇管区纤维母细胞亦有表达.高压氧组、自由基拮抗剂组或二者联用组，MMP-2蛋白均较模型组低，高压氧结合自由基拮抗剂组MMP-2蛋白表达最弱(P<0.01，见表2，图5-8).
正常对照组可见TGF-β1阳性表达，但仅见于中央静脉内皮细胞、汇管区血管内皮细胞及纤维细胞.2 wk末，模型组与正常对照组相比，阳性积分高(P<0.01)，在肝窦周细胞表达较多，8wk末模型组小叶间隔和增宽的汇管区、中央静脉表达强阳性，各治疗组与同期模型组相比TGF-b1阳性表达均低，差异有显著性，但以高压氧结合自由基拮抗剂组蛋白表达积分最低(见表2，图9-12).
图5 模型组(2wk末)肝窦周细胞、血管内皮细胞MMP-2蛋白表达强阳性免疫组化sp法×200.
图6 高压氧结合自由基拮抗剂组(2wk末)MMP-2蛋白明显减弱 免疫组化sp法×200.
图7 模型组(8wk末)肝窦周细胞纤维间隔和汇管区纤维母细胞MMP-2蛋白表达强阳性免疫组化sp法×200.
图8 高压氧结合自由基拮抗剂组(8wk末)MMP-2蛋白明显减弱.免疫组化sp法×200.
图9 模型组(2wk末)中央静脉内皮细胞和小叶内肝窦周细胞TGF-b1蛋白表达强阳性免疫组化sp法×200.
图10高压氧结合自由基拮抗剂组(2wk末)仅中央静脉内皮细胞TGF-b1蛋白表达弱阳性 免疫组化sp法×200.
图11模型组(8wk末)纤维间隔和汇管区纤维母细胞TGF-b1蛋白表达强阳性免疫组化sp法×200.
图12高压氧结合自由基拮抗剂组(8wk末)仅中央静脉内皮细胞有TGF-b1蛋白表达 免疫组化sp法×200.
2.3大鼠MMP-2 mRNA水平的变化2 wk末模型组(M)肝组织MMP-2mRNA比值为0.547±0.013，高压氧组(H)和高压氧结合自由基拮抗剂组(HFr)2wk末MMP-2 mRNA水较同期模型组为低(P <0.01)分别为0.200±0.009和0.155±0.005，8wk末模型组(M)肝组织MMP-2mRNA比值为0.685±0.014，高压氧组(H)和高压氧结合自由基拮抗剂组(HFr)亦较同期模型组低(P <0.01)，分别为0.595±0.012和0.506±0.013，见图13.
图13(PDF)M: 模型组;H: 高压氧组;HFr: 高压氧结合自由基拮抗剂组.
3 讨论在体外培养的肝星状细胞在缺氧的情况下，MMP-2表达增加，而MMP-2活性下降;在高浓度氧的情况下，MMP-2表达亦增加，活性显著增强[15-17].提示氧对体外培养的HSCMMP-2表达及活性有调节作用.但至今尚未见在体内高浓度氧对MMP-2表达的研究的相关报道.尽管在临床上用高压氧作为辅助措施治疗病毒性肝炎和肝硬化屡有报道[10-12].而且人们发现用高压氧可以改善肝硬化患者的肝功能，提高血清白蛋白含量，减少血中内毒素，增强了肝脏的解毒功能，并改善门静脉高压[11, 12]; 用高压氧改善肝组织缺氧状况后，细胞因子生成和释放明显减少[18].由于各种病因导致的肝损伤发生肝纤维化病理改变过程中肝组织都会发生不同程度的缺氧，用高压氧改善肝组织缺氧后，对肝纤维化的发展是否有延缓作用，以及其内在的治疗机制是什么同样缺乏报道.
本结果显示在CCl4所致的肝损伤早期到肝纤维化开始形成，大鼠肝脏MMP-2蛋白和mRNA水平表达亦显著增加，并且是逐步增加.与Takahara etal [19]通过NorthernBlot法发现CCl4诱导的大鼠肝纤维化和人肝纤维化MMP-2基因表达是增加的相一致.高压氧能下调肝组织MMP-2mRNA水平并抑制MMP-2的蛋白表达，特别是高压氧与VitC、Vit E、茶多酚组成的自由基拮抗剂联用抑制效果更加明显[20]，不论在CCl4所致的大鼠肝脏损伤早期阶段还是在肝纤维化形成阶段，均有显著地作用.本研究还发现高压氧、自由基拮抗剂均有减轻CCl4所致的大鼠早期肝脏损伤和纤维组织增生的趋势，降低反映肝纤维化程度的血清学指标透明质酸的水平，而高压氧和自由基拮抗剂联用，效果更佳，能明显减轻CCl4诱导的肝损伤及延缓肝纤维化的形成.至于高压氧抑制MMP-2表达可能与以下几种因素有关:高压氧的应用，迅速改变机体摄取和利用氧的方式，增加血气溶解系数、加大血氧张力，提高了动脉血氧分压和氧的弥散度，增加肝脏坏死区细胞的氧的供应，使受损的肝组织能得到足够的氧，加速病变细胞的恢复，增强肝细胞的有氧代谢，使ATP生成增加.同时，肝组织炎症减轻，炎细胞及肝细胞释放的促有丝分裂因子如PDGF，胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)内皮素(ET-1)[4]等大大减少，与HSC毗邻的枯否细胞Kupffer细胞释放的细胞因子TNF-a、TGF-b1等减少，减轻了对HSC的活化[21]，进而使MMP-2合成和表达下降.同时自由基拮抗剂[22-25]清除已有的肝细胞内自由基活性，保护肝细胞膜及细胞器膜上多不饱和脂肪酸免受过氧化损伤和拮抗了高压氧可能引起的活性氧的增多，进一步改善了肝组织的新陈代谢，有效的抑制了HSC的活化，使得MMP-2表达下降，这与体外培养的HSC在高浓度氧的条件下促进MMP-2表达不一致[17]，可能是体外培养HSC缺乏肝细胞及其他细胞的共同作用有关.
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AbstractAIM: To study the effects of hyperbaric oxygen combined with freeradical antagonists (HFr) on the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2) at the early stage of liver injury and fibrogenesis in rat.
METHODS:A liver fibrosis model was induced by carbon tetrachloride (CCl4)in Wistar rats, and the rats were exposed to hyperbaric oxygen, freeradical antagonists and both of them combined together respectively duringthe 2nd and 8th week. Serum hylaluronate (HA) level was detected byradioimmunoassay to explore extra cellular matrix changes. The content ofMMP-2 and TGF-b1,which was a kind of growth factor being able to regulate the expression ofMMP-2, were examined by immunohistochemical staining. A semi-quantitativeRT-PCR method was used to evaluate MMP-2 mRNA expression.
RESULTS:The hepatocytic injury including fatty degener-ation, hydropic changes andspotty necrosis in HFr group was lighter than that in model group at the2nd weekend, meanwhile, the MMP-2 protein expression and mRNA level, TGF-b1protein expression of the liver tissues were lower than those in the modelsignificantly (MMP-2:5.04±1.34vs 56.75±3.03,P <0.01; MMP-2 mRNA: 0.155 ±0. 005 vs 0.547±0.013,P <0.01; TGF-b1:3.28±0.33vs 4.96±0.28,P<0.01). The level of serum HA was also lower than that in themodel, but not significantly. At the 8th weekend, in the model, fibrousconnective tissue proliferated markedly in hepatic lobules, formingfibrous septa. Fatty degeneration, hydropic changes were observed in HFrgroup, in which the expression of MMP-2 protein and its mRNA, TGF-b1protein, serum HA were all lower significantly compared with the models(MMP-2: 12.53±2.51vs 160.57±5.54,P <0.01; MMP-2 mRNA: 0.506±0.013vs 0.685±0.014,P <0.01;TGF-b1:4.97±0.35vs 7.76±0.39,P <0.01; HA: 116.8±17.7mg/L-1vs 87.8±31.6mg/L-1P <0.01). In addition, the hepatocytic lesions in hyperbaricoxygen group, free radical antagonists group were similar to that inmodel, but somewhat mild. MMP-2 and TGF-b1proteins, MMP-2 mRNA expression in hyperbaric oxygen group were lower thanthat in the model.
CONCLUSION:Hyperbaric oxygen with free radical antagonists can decrease theexpression of MMP-2 in rat liver damaged by CCl4, delaying thedevelopment of liver fibrosis.
ZhangAF, Chen PS, Li XB, Zhang LD, Liu DF. Effects of hyperbaric oxygen withanti-free radicals on expression of matrix metalloproteinase-2 in ratliver. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003;11(12):1909-1914
摘要
目的:观察高压氧加自由基拮抗剂对大鼠肝脏损伤早期及肝纤维化形成过程中肝脏基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响
方法:用CCl4建立大鼠肝纤维化模型，在2wk和8 wk分别给予高压氧结合自由基拮抗剂、高压氧、自由基拮抗剂处理，放免法测定血清透明质酸(HA)的含量，以了解细胞外基质合成情况，免疫组化法检测肝组织MMP-2蛋白以及其调节相关的生长因子TGF-b1蛋白的表达;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MMP-2mRNA水平.
结果:实验2 wk末模型组高压氧结合自由基拮抗剂组肝脂肪变性和水样变性及点状坏死与模型组相比明显减轻，MMP-2蛋白及mRNA，TGF-β1蛋白表达均低于模型组，差异显著(MMP-2:5.04±1.34vs 56.75±3.03，P<0.01;MMP-2 mRNA : 0.155±0. 005 vs 0.547±0.013，P<0.01; TGF-b1:3.28±0.33 vs 4.96±0.28，P<0.01). 血清HA虽低于模型组，但无显著差异(P>0.05). 实验8wk末模型组肝小叶内纤维结缔组织增生明显并形成粗细不等的纤维条索，高压氧结合自由基拮抗剂组以肝细胞脂变和细胞水肿为主，纤维结缔组织无明显增生，肝组织MMP-2蛋白及mRNA，TGF-b1蛋白表达和血清HA水平与模型组相比均明显为低(MMP-2:12.53±2.51 vs 160.57±5.54，P<0.01;MMP-2 mRNA :0.506±0.013 vs 0.685±0.014，P<0.01;TGF-b1:4.97±0.35 vs 7.76±0.39，P<0.01; HA: 116.8±17.7 mg/Lvs 87.8±31.6 mg/LP <0.01). 高压氧组、自由基拮抗剂组在2wk末和8 wk末肝损伤略轻于模型组，MMP-2蛋白和TGF-b1蛋白表达均低于模型组，且高压氧组MMP-2mRNA表达亦较模型组低.
结论:高压氧结合自由基拮抗剂可以降低CCl4损伤大鼠肝脏MMP-2表达，可以迟滞肝纤维化病变的发展.
张爱凤,陈平圣, 李晓冰,张丽达, 刘东风.高压氧加自由基拮抗剂对大鼠肝脏基质金属蛋白酶-2表达的影响.世界华人消化杂志 2003;11(12):1909-1914
0 引言肝纤维化是各种慢性肝病共有的病理改变[1-3]，在其发生发展过程中由于细胞外基质生成和降解失衡，大量细胞外基质在肝内沉积，使得肝窦毛细血管化，血管改建乃至纤维间隔形成等均可使肝组织常存在不同程度的缺氧[4].研究表明肝星状细胞(HSC)是氧敏感性细胞，其活化是肝纤维化发生发展的中心环节[5-7]，亦是肝脏内基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的主要来源;而MMP-2能降解HSC周围的IV胶原，改变该细胞的微环境，促进其活化，活化的HSC发生增生、表型改变，促进ECM形成，各种细胞因子[8,9]及基质降解酶的释放.高压氧改善肝硬化患者的肝功能储备和治疗病毒性肝炎及肝内胆汁淤积性黄疸，效果较好[10-13]，但用高压氧改善肝组织缺氧后，对肝纤维化发生发展有何影响特别是对HSCMMP-2表达有无调节作用，尚无报道.我们用高压氧来处理CCl4肝损伤大鼠同时加用自由基拮抗剂消除高压氧可能导致的自由基产生增多的副作用，观察其对大鼠肝损伤组织的保护作用以及对肝脏基质金属蛋白酶-2表达的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar♂大鼠60只，体质量150±10g，由河南医科大学动物中心提供，随机分成5组，每组12只，分笼饲养，按昼夜时程，在室温及稳定温度条件下，用平衡饲料饲养.(1)模型组 以500mL/L CCl4 (上海试剂一厂生产，精制花生油配置)皮下注射，3mL/kg，首次给予75%，2次/wk，共8wk; (2)高压氧组诱导肝损伤同模型组，实验后2wk和8 wk给予高压氧.(995 mL/L氧气冲舱5min，10 min升压至2个kPa，维持1h后，减压15min，持续1wk). (3)自由基拮抗剂组 自由基拮抗剂VitC针剂(扬子江制药股份有限公司)、VitE胶囊(南京制药三厂)茶多酚(福建天宝生物化工厂)各100mg/kg，1次/d，诱导肝损伤同模型组，实验2 wk和8wk开始给予灌胃，持续1wk. (4)高压氧结合自由基拮抗剂组 诱导肝损伤同模型组，在给予高压氧的同时给与自由基拮抗剂，时间和剂量不变;(5)对照组正常饲养，于2wk和8 wk开始给予生理盐水灌胃，持续1wk. 各组均于实验2wk末和8 wk末处死6只动物，自下腔静脉取血，分离血清备用，取相同肝叶肝组织，分别置于中性缓冲甲醛溶液固定、经液氮速冻后置于-70°C备用.
1.2方法
1.2.1 肝脏组织病理学和血清透明质酸(HA)检测 常规HE染色，光学显微镜下观察.按试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明，用放射免疫法检测血清透明质酸的含量.
1.2.2 肝组织TGF-_/bb_1、MMP-2的表达 石蜡切片，免疫组织化学SP法.TGF-b1(mAb，SantaCruz产品，购自北京中山生物技术有限公司)工作液浓度为1:200，MMP-2(mAb，Calbiochem产品)工作液浓度为1:100.TGF-b1阳性结果判断:每张切片选择左、中、右各2个高倍视野，根据染色强度赋值为A:淡黄1，黄色2，棕黄色3;染色部位为B:着色在中央静脉和汇管区分别计1分，染色范围计为C:阳性染色向肝小叶内延伸在1/3内为1分，1/3-2/3为2分，超过2/3者计3分，计算总阳性指数为B*A+C*A，计算每例标本阳性指数(每例6个视野阳性染色之和/6).MMP-2阳性结果判断:每张切片选择左、中、右各2个高倍视野，计算阳性细胞数，并对每个阳性细胞胞质染色强度赋值(淡黄1，黄色2，棕黄色3)计算每例标本阳性指数(每例6个视野阳性细胞赋值之和/6).
1.2.3 RT-PCR检测MMP-2的表达 参照说明书用Trizol试剂从大鼠肝脏组织中抽提RNA，真空干燥后，溶解于无RNase水中，-70°C保存备用.使用前取上述RNA溶液稀释，测定A260/A280值，计算RNA浓度.取总RNA 2 mg进行逆转录，再以逆转录反应液4mL作为模板，加入相应引物(上海申能博采生物有限公司合成)进行PCR扩增.MMP-2引物[14]:正义: 5’-ACCATC GCC CAT CAT CAA GT -3’反义5’-CGAGCA AAA GCA TCA TCC AC-3’位于563-582和891-910处，扩增片段产物长度328bp. b-actin作为内参照，正义:5’-CCC TGG ACT TCG AGC AAG AGA T -3’反义5’-GTTTTC TGC GCA AGT TAG G-3’扩增片段产物长度531bp. 总反应体积25mL，首先94°C变性2min，以后94 °C 1 min→62 °C 30 s →72 °C 1 min，进行32个循环.72 °C 10 min终止反应.PCR产物经18g/L琼脂糖凝胶(含0.5mg/L溴化乙锭)电泳，拍照，密度扫描，得到各扩增带峰面积.用 b-actin校正后用其表达量和b-actin表达量比值进行比较.
统计学处理 结果以表示，组间比较采用t或t’检验P<0.05为差异显著.
2 结果
2.1肝脏病理学改变和血清HA 实验2wk末，正常对照组肝小叶结构清晰，肝细胞无变性坏死、炎细胞浸润和纤维结缔组织增生.模型组肝细胞广泛脂肪变性和水样变性及点状坏死，汇管区有较多的炎细胞浸润.高压氧组、自由基拮抗剂组以及高压氧结合自由基拮抗剂组与模型组相比肝细胞损伤程度和范围均有所减轻，以高压氧结合自由基拮抗剂组最为明显，仅仅在肝小叶中央区肝细胞呈轻度脂肪变性，汇管区无炎细胞浸润.实验8 wk末，模型组可见纤维结缔组织增生形成粗细不等的纤维条索穿插于肝小叶内，肝小叶内尚有散在分布的不同程度脂肪变性的肝细胞及再生的肝细胞，汇管区明显增宽伴大量炎细胞浸润.高压氧组、自由基拮抗剂组与模型组相比，肝组织内纤维结缔组织增生程度及炎细胞浸润均减轻，高压氧结合自由基拮抗剂组仅表现为肝细胞脂变和细胞水肿为主，在汇管区有少许纤维结缔组织增生，见图1-4.
图1 模型组(2wk末)肝细胞广泛脂肪变性细胞水肿及点状坏死HE×100.
图2高压氧结合自由基拮抗剂组(2wk末)肝细胞损伤明显减轻小叶中央区轻度脂变HE×100.
图3模型组(8周末)纤维结缔组织增生形成粗细不等的纤维条索穿插于肝小叶内HE×100.
模型组和各实验组大鼠血清HA的水平均较正常对照组升高，实验2wk末高压氧组和自由基拮抗剂组及高压氧结合自由基拮抗剂组HA水平较低，但与模型组相比，无显著差异(P>0.05); 实验8wk末，模型组与对照组相比HA水平较高，高压氧组和高压氧结合自由基拮抗剂组与模型组相比，血清HA较低，以高压氧结合自由基拮抗剂组HA水平最低(P<0.01，见表1).
图4 高压氧结合自由基拮抗剂组(8wk末)肝细胞脂变及细胞水肿无纤维结缔组织增生HE×100.
表1 大鼠血清HA水平的变化(mg/L, ,n=6)
| 组别 | 实验2wk末 | 实验8wk末 |
| 正常对照组(C) | 90.4±30.6 | 95.76±32.22 |
| 模型组(M) | 137.2±31.6b | 187.81±31.57b |
| 高压氧组(H) | 115.4±30.9 | 149.50±20.50c |
| 自由基拮抗剂组(Fr) | 110.6±28.6 | 162.43±25.58 |
| 高压氧+自由基拮抗剂组(HFr) | 111.2±31.0 | 116.83±17.73d |
bP<0.01, vs正常对照组;dP <0.01, cP <0.05, vs模型组.
表2 大鼠肝脏MMP-2和TGF-b1蛋白表达积分(分 ,n=6)
| 分组 | 实验2wk末 | 实验8wk末 | ||
| MMP-2 | TGF-b1 | MMP-2 | TGF-b1 | |
| 正常对照组(C) | 2.25±0.32 | 1.86±0.17 | 2.33±0.45 | 1.92±0.12 |
| 模型组(M) | 56.75±3.03b | 4.96±0.28b | 160.57±5.54b | 7.76±0.39b |
| 高压氧组(H) | 14.34±2.24d | 3.97±0.25d | 25.42±1.68d | 5.29±0.28d |
| 自由基拮抗剂组(Fr) | 17.30±2.74d | 4.58±0.30c | 47.05±5.25d | 5.58±0.32d |
| 高压氧组+自由基拮抗剂组(HFr) | 5.40±1.34d | 3.28±0.33d | 12.53±2.51d | 4.97±0.35d |
bP<0.01，vs正常对照组; dP<0.01，cP<0.05，vs模型组
2.2肝组织MMP-2 ，TGF-_/bb_1的表达 正常对照组可见MMP-2阳性细胞呈星状散在分布于肝窦周细胞(主要为星状细胞)、血管内皮细胞，着色较淡，2wk末、8 wk末模型组MMP-2明显高于对照组(P<0.01)，且8wk末在纤维间隔和增宽的汇管区纤维母细胞亦有表达.高压氧组、自由基拮抗剂组或二者联用组，MMP-2蛋白均较模型组低，高压氧结合自由基拮抗剂组MMP-2蛋白表达最弱(P<0.01，见表2，图5-8).
正常对照组可见TGF-β1阳性表达，但仅见于中央静脉内皮细胞、汇管区血管内皮细胞及纤维细胞.2 wk末，模型组与正常对照组相比，阳性积分高(P<0.01)，在肝窦周细胞表达较多，8wk末模型组小叶间隔和增宽的汇管区、中央静脉表达强阳性，各治疗组与同期模型组相比TGF-b1阳性表达均低，差异有显著性，但以高压氧结合自由基拮抗剂组蛋白表达积分最低(见表2，图9-12).
图5 模型组(2wk末)肝窦周细胞、血管内皮细胞MMP-2蛋白表达强阳性免疫组化sp法×200.
图6 高压氧结合自由基拮抗剂组(2wk末)MMP-2蛋白明显减弱 免疫组化sp法×200.
图7 模型组(8wk末)肝窦周细胞纤维间隔和汇管区纤维母细胞MMP-2蛋白表达强阳性免疫组化sp法×200.
图8 高压氧结合自由基拮抗剂组(8wk末)MMP-2蛋白明显减弱.免疫组化sp法×200.
图9 模型组(2wk末)中央静脉内皮细胞和小叶内肝窦周细胞TGF-b1蛋白表达强阳性免疫组化sp法×200.
图10高压氧结合自由基拮抗剂组(2wk末)仅中央静脉内皮细胞TGF-b1蛋白表达弱阳性 免疫组化sp法×200.
图11模型组(8wk末)纤维间隔和汇管区纤维母细胞TGF-b1蛋白表达强阳性免疫组化sp法×200.
图12高压氧结合自由基拮抗剂组(8wk末)仅中央静脉内皮细胞有TGF-b1蛋白表达 免疫组化sp法×200.
2.3大鼠MMP-2 mRNA水平的变化2 wk末模型组(M)肝组织MMP-2mRNA比值为0.547±0.013，高压氧组(H)和高压氧结合自由基拮抗剂组(HFr)2wk末MMP-2 mRNA水较同期模型组为低(P <0.01)分别为0.200±0.009和0.155±0.005，8wk末模型组(M)肝组织MMP-2mRNA比值为0.685±0.014，高压氧组(H)和高压氧结合自由基拮抗剂组(HFr)亦较同期模型组低(P <0.01)，分别为0.595±0.012和0.506±0.013，见图13.
图13(PDF)M: 模型组;H: 高压氧组;HFr: 高压氧结合自由基拮抗剂组.
3 讨论在体外培养的肝星状细胞在缺氧的情况下，MMP-2表达增加，而MMP-2活性下降;在高浓度氧的情况下，MMP-2表达亦增加，活性显著增强[15-17].提示氧对体外培养的HSCMMP-2表达及活性有调节作用.但至今尚未见在体内高浓度氧对MMP-2表达的研究的相关报道.尽管在临床上用高压氧作为辅助措施治疗病毒性肝炎和肝硬化屡有报道[10-12].而且人们发现用高压氧可以改善肝硬化患者的肝功能，提高血清白蛋白含量，减少血中内毒素，增强了肝脏的解毒功能，并改善门静脉高压[11, 12]; 用高压氧改善肝组织缺氧状况后，细胞因子生成和释放明显减少[18].由于各种病因导致的肝损伤发生肝纤维化病理改变过程中肝组织都会发生不同程度的缺氧，用高压氧改善肝组织缺氧后，对肝纤维化的发展是否有延缓作用，以及其内在的治疗机制是什么同样缺乏报道.
本结果显示在CCl4所致的肝损伤早期到肝纤维化开始形成，大鼠肝脏MMP-2蛋白和mRNA水平表达亦显著增加，并且是逐步增加.与Takahara etal [19]通过NorthernBlot法发现CCl4诱导的大鼠肝纤维化和人肝纤维化MMP-2基因表达是增加的相一致.高压氧能下调肝组织MMP-2mRNA水平并抑制MMP-2的蛋白表达，特别是高压氧与VitC、Vit E、茶多酚组成的自由基拮抗剂联用抑制效果更加明显[20]，不论在CCl4所致的大鼠肝脏损伤早期阶段还是在肝纤维化形成阶段，均有显著地作用.本研究还发现高压氧、自由基拮抗剂均有减轻CCl4所致的大鼠早期肝脏损伤和纤维组织增生的趋势，降低反映肝纤维化程度的血清学指标透明质酸的水平，而高压氧和自由基拮抗剂联用，效果更佳，能明显减轻CCl4诱导的肝损伤及延缓肝纤维化的形成.至于高压氧抑制MMP-2表达可能与以下几种因素有关:高压氧的应用，迅速改变机体摄取和利用氧的方式，增加血气溶解系数、加大血氧张力，提高了动脉血氧分压和氧的弥散度，增加肝脏坏死区细胞的氧的供应，使受损的肝组织能得到足够的氧，加速病变细胞的恢复，增强肝细胞的有氧代谢，使ATP生成增加.同时，肝组织炎症减轻，炎细胞及肝细胞释放的促有丝分裂因子如PDGF，胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)内皮素(ET-1)[4]等大大减少，与HSC毗邻的枯否细胞Kupffer细胞释放的细胞因子TNF-a、TGF-b1等减少，减轻了对HSC的活化[21]，进而使MMP-2合成和表达下降.同时自由基拮抗剂[22-25]清除已有的肝细胞内自由基活性，保护肝细胞膜及细胞器膜上多不饱和脂肪酸免受过氧化损伤和拮抗了高压氧可能引起的活性氧的增多，进一步改善了肝组织的新陈代谢，有效的抑制了HSC的活化，使得MMP-2表达下降，这与体外培养的HSC在高浓度氧的条件下促进MMP-2表达不一致[17]，可能是体外培养HSC缺乏肝细胞及其他细胞的共同作用有关.
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