NOD2基因3020insC移码突变与中国湖北汉族炎症性肠病的相关性
瞿艳,郭秋莎, 夏冰,武汉大学中南医院综合医疗科 湖北省武汉市 430071
国家自然科学基金资助课题,No. 30370638
项目负责人:夏冰,430071, 湖北省武汉市,武汉大学中南医院综合医疗科.bingxia@public.wh.hb.cn
电话:027-67812885
收稿日期:2003-12-10 接受日期:2004-02-01
摘要
目的:研究我国湖北汉族人NOD2基因3020insC移码突变频率与炎症性肠病(IBD)的相关性.
, http://www.100md.com
方法:采用特异性等位基因PCR方法对74例溃疡性结肠炎(UC)、15例克罗恩病(CD)患者以及172例正常对照者NOD2基因3020insC多态性进行检测.
结果:正常对照者、UC以及CD患者NOD2基因3020等位基因频率分别为0.29%，1.35%及3.33%，均无显著性差异.但CD对比健康对照组的P=11.828，95%CI=0.7 205-194.17，提示NOD2基因3020insC移码突变是CD的危险因素.
结论:NOD2基因3020insC移码突变与中国湖北汉族CD与UC患者无显著相关性.
瞿艳,郭秋莎, 夏冰.NOD2基因3020insC移码突变与中国湖北汉族炎症性肠病的相关性.世界华人消化杂志 2004;12(5):1208-1210
, 百拇医药
0 引言炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)两种临床类型，其免疫和遗传因素在发病机制中起重要作用.至今，NOD2基因是所发现的CD的第一个易感基因[1-2].在大多数西方人群已被证实，然而，未被日本和香港人所证实[3-4].NOD2是参与细胞调亡调控的NOD1/APAF-1家族的成员，表达于外周血单核细胞和回肠黏膜，通过NF-kB信号转导通路激活一系列炎性细胞因子的转录与表达，在肠黏膜的炎性损伤中起重要作用[5].目前，鲜见NOD2基因多态性在中国汉族人群中的分布及与IBD患者相关性的报道.本研究旨在探讨我国湖北汉族人中NOD2基因移码突变的频率及其与IBD的相关性.
1 材料和方法
1.1 材料 收集2001/2003在武汉大学中南医院以及武汉市其他大型综合医院就诊的湖北汉族无亲缘关系的IBD患者89例(74例UC，15例CD)以及健康对照者172例.UC及CD诊断标准参照中华医学会消化病学分会2001“对炎症性肠病诊断治疗规范的建议”[6].健康对照者来自正常体检者.
, 百拇医药
1.2 方法 基因组DNA提取:采血5 mL，EDTA抗凝，常规蛋白酶K消化，苯酚-氯仿提取.提取的DNA溶解于TE液中，-25°C保存. NOD2基因3020insC移码突变检测:采用特异性等位基因PCR(allele specific PCR)方法，检测NOD2基因3020insC移码突变.在25 mL的反应体系中加入特异性引物(表1)，引物设计参照文献[2].94 °C预变性5min. 变性94 °C，45 s;退火59°C，45s;延伸72°C，45 s; 共35次循环.最后彻底延伸于72°C，7 min.PCR产物于20g/L琼脂糖电泳，溴乙锭染色，在紫外分析仪下分析鉴定.PCR产生533 bp的非特异性产物及319bp片段(野生型)和/或214bp片段 (3020insC突变型).3020insC突变型DNA参考标本由荷兰阿姆斯特丹自由大学惠赠.
表1 NOD2基因3020insC突变特异性等位基因PCR引物
, 百拇医药
统计学处理 通过SPSS11.5软件包，采用x2检验，P<0.05认为有统计学意义.
2 结果对89例IBD患者(74例UC，15例CD)以及172例健康对照者的DNA样本进行检测，发现4例3020insC移码突变杂合子，其中正常对照者1例、UC2例、CD 1例.正常对照者、UC以及CD患者NOD2基因3020等位基因频率分别为0.29%，1.35%及3.33%，均无显著性差异(表2).但CD对比健康对照组的P=11.828，95% CI=0.7 205-194.17，提示NOD2基因3020insC移码突变是CD的危险因素.
表2 健康对照者、UC和CD患者NOD2基因3020insC突变基因型和等位基因频率
, http://www.100md.com
3 讨论NOD2基因位于16q12，是近2a发现的人类CD的第一个易感基因.1996年Hugot etal [7]通过对IBD患者家系的连锁分析，发现第16条染色体着丝点附近的CD易感位点，称位IBD1.2001年，Hugot etal [1]在IBD1区域，对含有D16S3136微卫星标记的细菌人造染色体克隆进行测序，发现在该序列上，R702W，G908R，1007fs单核苷酸多态性(分别以SNP8，12，13表示)，与CD有显著相关性.在与人类白细胞cDNA库相比后，发现了人类的第一个CD易感基因NOD2，现命名为CARD15基因.NOD2蛋白质是调节细胞凋亡的超家族CED4/APAf1的成员，由1013个氨基酸组成，包括两个N末端caspase补充区域(N-terminalcaspase recruitment domains，CARD)，一个核苷酸结合区域(anucleotide-binding domain，NBD)，一个由多个C末端富含亮氨酸的重复组成的区域(multipleC-terminal leucine rich repeats，LRR区域).NOD2在单核细胞表达，在细胞质中对来源于细菌的致病成分起作用.LRR区域具有结合细菌LPS的活性，激活NF-kB信号通道.NOD2基因LRR区域的3020insC移码突变，使NOD2蛋白LRR区域发生Leu1007Pro氨基酸互换，终止密码子提前，最后33个氨基酸丢失，导致NF-kB活性减弱.由于NOD2的缺失导致CD患者对细菌产物的先天性免疫反应减弱，从而过度激活特异性继发性免疫反应，导致CD发生[8].CD患者小肠黏膜和潘氏细胞可检测到NOD2的表达，支持NOD2与CD相关的结论[9-10].Ogura et al [2]同时发现这三个基因多态性与CD呈显著性相关，以3020insC移码突变与CD的相关性最为密切，而且在功能上证实是CD的易感基因.一些在英国和德国人等的研究[11]证实NOD2的3020insC移码突变与CD相关，但Yamazakiet al [3]以及Leonget al [4]对日本人和中国香港人CD患者、UC患者以及健康对照者的研究，未发现NOD2基因的突变.NOD2的3020insC移码突变在不同人群中频率不同，可能与种族差异有关.
, http://www.100md.com
本研究采用特异性等位基因PCR方法，检测中国湖北汉族74例UC、15例CD以及172例正常对照者NOD2基因的3020insC突变频率，未发现正常对照组3020insC移码突变频率与UC及CD患者有显著性差异，提示在中国湖北汉族人中NOD2基因3020insC移码突变与UC及CD无显著相关性，不可能是CD的易感基因，与日本人[3]及中国香港人[4]的结果一致.但CD对比健康对照组的P=11.828，95%CI=0.7 205-194.17，提示NOD2基因3020insC移码突变是CD的危险因素.由于本组CD患者病例较少，有待进一步证实.
NOD2作为所发现的人类第一个CD易感基因，将CD的遗传易感性、机体的先天性免疫与细菌作用有机的联系起来，在治疗CD的策略上重视细菌的作用.目前，尚未在亚洲人群中发现NOD2的基因突变与CD之间存在显著相关性的报道，提示IBD，特别是CD涉及多基因的遗传模式，在不同地区和人群具有明显的种族差异性.
, 百拇医药
4 参考文献1 Hugot JP, Chamaillard M , Zouali H, Lesage S, Cezard JP, BelaicheJ, Almer S, Tysk C, O’MorainCA, Gassull M, Binder V,Finkel Y, Cortot A, Modigliani R, Laurent-puigP, Gower-Rousseau C, Macry J, Colombel JF, Sahbatou M, Thomas G.
Association of NOD2 leucine-rich repeatvariants with susceptibility to Crohn’sdisease. Nature 2001;411:599-603
2 Ogura Y, Bonen DK, Inohara N, Nicolae DL, Chen FF, Ramos R, BrittonH, Moran T, Karaliuskas R, Duerr RH, Achkar JP,Brant SR,Bayless TM, Kirschner BS, Hanauer SB, Nunez G, Cho JH. A frameshiftmutation in NOD2 associated with
, http://www.100md.com
susceptibilityto Crohn’sdisease. Nature 2001;411:603-606
3 Yamazaki K, Takazoe M, Tanaka T, Kazumori T, Nakamura Y. Absence ofmutation in the NOD2/CARD15 gene among 483
Japanesepatients with Crohn’sdisease. J Hum Genet 2002;47:469-472
4 Leong RW, Armuzzi A, Ahmad T, Wong ML, Tse P, Jewell DP, Sung JJ.NOD2/CARD15 gene polymorphisms and Crohn’s
diseasein the Chinese population. Aliment Pharmacol Ther 2003;17:1465-1470
, http://www.100md.com
5 Ogura Y, Inohara N, Benito A, Chen FF, Yamaoka S, Nunez G. Nod2, aNod1/Apaf-1 family member that is restricted to
monocytesand activates NF-kB.J Biol Chem 2001;276:4812-4818
6 中华医学会消化病学分会.对炎症性肠病诊断治疗规范的建议.中华消化杂志 2001;21:236-239
7 Hugot JP,Laurent-puig P, Gower-Rousseau C, Olson JM, Lee JC, Beaugerie L, Naom I,Dupas JL, Van Gossum A, Groupe
d'EtudeTherapeutique des Affections Inflammatolres Digestives, Orholm M,Bonaiti-pellie C, Weissenbach J, Mathew CG,Lennard-JonesJE, Cortot A, Colombel JF, Thomas G. Mapping of a susceptibility locus forCrohn’sdisease on chromosome
, 百拇医药
16. Nature 1996;379:821-823
8 夏冰, 邓长生,Pena AS. 克罗恩病的第一个易感基因,NOD2(CARD15). 中华消化杂志 2002;22:307-308
9 Berrebi D, Maudinas R, Hugot JP, Chamaillard M, Chareyre F, DeLagausie P, Yang C, Desreumaux P, Giovannini M,Cezard JP, Zouali H, Emilie D, Peuchmaur M.Card15 gene overexpression in mononuclear and epithelial cells of the
inflamed Crohn’sdisease colon. Gut 2003;52:840-846
, 百拇医药
10 Lala S, Ogura Y, Osborne C, Hor SY, Bromfield A, Davies S, OgunbiyiO, Nunez G, Keshav S. Crohn’sdisease and the
NOD2 gene: a role for paneth cells.Gastroenterology 2003;125:47-57
11 Hampe J, Cuthbert A, Croucher PJ, Mirza MM, Mascheretti S, FisherS, Frenzel H, King K, Hasselmeyer A, Macpherson AJ,Bridger S, Van Deventer S, Forbes A,Nikolaus S, Lennard-Jones JE, Foelsch UR, Krawczak M, Lewis C, SchreiberS,Mathew CG. Association between insertionmutation in NOD2 gene and Crohn’sdisease in German and British populations.
Lancet 2001;357:1925-1928, 百拇医药( 瞿 艳, 郭秋莎, 夏 冰)
国家自然科学基金资助课题,No. 30370638
项目负责人:夏冰,430071, 湖北省武汉市,武汉大学中南医院综合医疗科.bingxia@public.wh.hb.cn
电话:027-67812885
收稿日期:2003-12-10 接受日期:2004-02-01
摘要
目的:研究我国湖北汉族人NOD2基因3020insC移码突变频率与炎症性肠病(IBD)的相关性.
, http://www.100md.com
方法:采用特异性等位基因PCR方法对74例溃疡性结肠炎(UC)、15例克罗恩病(CD)患者以及172例正常对照者NOD2基因3020insC多态性进行检测.
结果:正常对照者、UC以及CD患者NOD2基因3020等位基因频率分别为0.29%，1.35%及3.33%，均无显著性差异.但CD对比健康对照组的P=11.828，95%CI=0.7 205-194.17，提示NOD2基因3020insC移码突变是CD的危险因素.
结论:NOD2基因3020insC移码突变与中国湖北汉族CD与UC患者无显著相关性.
瞿艳,郭秋莎, 夏冰.NOD2基因3020insC移码突变与中国湖北汉族炎症性肠病的相关性.世界华人消化杂志 2004;12(5):1208-1210
, 百拇医药
0 引言炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)两种临床类型，其免疫和遗传因素在发病机制中起重要作用.至今，NOD2基因是所发现的CD的第一个易感基因[1-2].在大多数西方人群已被证实，然而，未被日本和香港人所证实[3-4].NOD2是参与细胞调亡调控的NOD1/APAF-1家族的成员，表达于外周血单核细胞和回肠黏膜，通过NF-kB信号转导通路激活一系列炎性细胞因子的转录与表达，在肠黏膜的炎性损伤中起重要作用[5].目前，鲜见NOD2基因多态性在中国汉族人群中的分布及与IBD患者相关性的报道.本研究旨在探讨我国湖北汉族人中NOD2基因移码突变的频率及其与IBD的相关性.
1 材料和方法
1.1 材料 收集2001/2003在武汉大学中南医院以及武汉市其他大型综合医院就诊的湖北汉族无亲缘关系的IBD患者89例(74例UC，15例CD)以及健康对照者172例.UC及CD诊断标准参照中华医学会消化病学分会2001“对炎症性肠病诊断治疗规范的建议”[6].健康对照者来自正常体检者.
, 百拇医药
1.2 方法 基因组DNA提取:采血5 mL，EDTA抗凝，常规蛋白酶K消化，苯酚-氯仿提取.提取的DNA溶解于TE液中，-25°C保存. NOD2基因3020insC移码突变检测:采用特异性等位基因PCR(allele specific PCR)方法，检测NOD2基因3020insC移码突变.在25 mL的反应体系中加入特异性引物(表1)，引物设计参照文献[2].94 °C预变性5min. 变性94 °C，45 s;退火59°C，45s;延伸72°C，45 s; 共35次循环.最后彻底延伸于72°C，7 min.PCR产物于20g/L琼脂糖电泳，溴乙锭染色，在紫外分析仪下分析鉴定.PCR产生533 bp的非特异性产物及319bp片段(野生型)和/或214bp片段 (3020insC突变型).3020insC突变型DNA参考标本由荷兰阿姆斯特丹自由大学惠赠.
表1 NOD2基因3020insC突变特异性等位基因PCR引物
| 引物 | 序列 |
| 顺式引物 | 5’-CTGAGCCTTTGTTGATGAGC-3’ |
| 反式引物 | 5’-TCTTCAACCACATCCCCATT-3’ |
| 野生型顺式引物 | 5’-CAGAAGCCCTCCTGCAGGCCCT-3’ |
| 3020insC反式引物 | 5’-CGCGTGTCATTCCTTTCATGGGGC-3’ |
, 百拇医药
统计学处理 通过SPSS11.5软件包，采用x2检验，P<0.05认为有统计学意义.
2 结果对89例IBD患者(74例UC，15例CD)以及172例健康对照者的DNA样本进行检测，发现4例3020insC移码突变杂合子，其中正常对照者1例、UC2例、CD 1例.正常对照者、UC以及CD患者NOD2基因3020等位基因频率分别为0.29%，1.35%及3.33%，均无显著性差异(表2).但CD对比健康对照组的P=11.828，95% CI=0.7 205-194.17，提示NOD2基因3020insC移码突变是CD的危险因素.
表2 健康对照者、UC和CD患者NOD2基因3020insC突变基因型和等位基因频率
| 基因型 | 健康对照者 | UC | CD |
| n | 172 | 74 | 15 |
| 野生型 | 171 | 72 | 14 |
| 3020insC突变杂合子 | 1 | 2 | 1 |
| 3020insC突变纯合子 | 0 | 0 | 0 |
| 3020insC等位基因频率 | 0.29 | 1.35 | 3.33 |
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3 讨论NOD2基因位于16q12，是近2a发现的人类CD的第一个易感基因.1996年Hugot etal [7]通过对IBD患者家系的连锁分析，发现第16条染色体着丝点附近的CD易感位点，称位IBD1.2001年，Hugot etal [1]在IBD1区域，对含有D16S3136微卫星标记的细菌人造染色体克隆进行测序，发现在该序列上，R702W，G908R，1007fs单核苷酸多态性(分别以SNP8，12，13表示)，与CD有显著相关性.在与人类白细胞cDNA库相比后，发现了人类的第一个CD易感基因NOD2，现命名为CARD15基因.NOD2蛋白质是调节细胞凋亡的超家族CED4/APAf1的成员，由1013个氨基酸组成，包括两个N末端caspase补充区域(N-terminalcaspase recruitment domains，CARD)，一个核苷酸结合区域(anucleotide-binding domain，NBD)，一个由多个C末端富含亮氨酸的重复组成的区域(multipleC-terminal leucine rich repeats，LRR区域).NOD2在单核细胞表达，在细胞质中对来源于细菌的致病成分起作用.LRR区域具有结合细菌LPS的活性，激活NF-kB信号通道.NOD2基因LRR区域的3020insC移码突变，使NOD2蛋白LRR区域发生Leu1007Pro氨基酸互换，终止密码子提前，最后33个氨基酸丢失，导致NF-kB活性减弱.由于NOD2的缺失导致CD患者对细菌产物的先天性免疫反应减弱，从而过度激活特异性继发性免疫反应，导致CD发生[8].CD患者小肠黏膜和潘氏细胞可检测到NOD2的表达，支持NOD2与CD相关的结论[9-10].Ogura et al [2]同时发现这三个基因多态性与CD呈显著性相关，以3020insC移码突变与CD的相关性最为密切，而且在功能上证实是CD的易感基因.一些在英国和德国人等的研究[11]证实NOD2的3020insC移码突变与CD相关，但Yamazakiet al [3]以及Leonget al [4]对日本人和中国香港人CD患者、UC患者以及健康对照者的研究，未发现NOD2基因的突变.NOD2的3020insC移码突变在不同人群中频率不同，可能与种族差异有关.
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本研究采用特异性等位基因PCR方法，检测中国湖北汉族74例UC、15例CD以及172例正常对照者NOD2基因的3020insC突变频率，未发现正常对照组3020insC移码突变频率与UC及CD患者有显著性差异，提示在中国湖北汉族人中NOD2基因3020insC移码突变与UC及CD无显著相关性，不可能是CD的易感基因，与日本人[3]及中国香港人[4]的结果一致.但CD对比健康对照组的P=11.828，95%CI=0.7 205-194.17，提示NOD2基因3020insC移码突变是CD的危险因素.由于本组CD患者病例较少，有待进一步证实.
NOD2作为所发现的人类第一个CD易感基因，将CD的遗传易感性、机体的先天性免疫与细菌作用有机的联系起来，在治疗CD的策略上重视细菌的作用.目前，尚未在亚洲人群中发现NOD2的基因突变与CD之间存在显著相关性的报道，提示IBD，特别是CD涉及多基因的遗传模式，在不同地区和人群具有明显的种族差异性.
, 百拇医药
4 参考文献1 Hugot JP, Chamaillard M , Zouali H, Lesage S, Cezard JP, BelaicheJ, Almer S, Tysk C, O’MorainCA, Gassull M, Binder V,Finkel Y, Cortot A, Modigliani R, Laurent-puigP, Gower-Rousseau C, Macry J, Colombel JF, Sahbatou M, Thomas G.
Association of NOD2 leucine-rich repeatvariants with susceptibility to Crohn’sdisease. Nature 2001;411:599-603
2 Ogura Y, Bonen DK, Inohara N, Nicolae DL, Chen FF, Ramos R, BrittonH, Moran T, Karaliuskas R, Duerr RH, Achkar JP,Brant SR,Bayless TM, Kirschner BS, Hanauer SB, Nunez G, Cho JH. A frameshiftmutation in NOD2 associated with
, http://www.100md.com
susceptibilityto Crohn’sdisease. Nature 2001;411:603-606
3 Yamazaki K, Takazoe M, Tanaka T, Kazumori T, Nakamura Y. Absence ofmutation in the NOD2/CARD15 gene among 483
Japanesepatients with Crohn’sdisease. J Hum Genet 2002;47:469-472
4 Leong RW, Armuzzi A, Ahmad T, Wong ML, Tse P, Jewell DP, Sung JJ.NOD2/CARD15 gene polymorphisms and Crohn’s
diseasein the Chinese population. Aliment Pharmacol Ther 2003;17:1465-1470
, http://www.100md.com
5 Ogura Y, Inohara N, Benito A, Chen FF, Yamaoka S, Nunez G. Nod2, aNod1/Apaf-1 family member that is restricted to
monocytesand activates NF-kB.J Biol Chem 2001;276:4812-4818
6 中华医学会消化病学分会.对炎症性肠病诊断治疗规范的建议.中华消化杂志 2001;21:236-239
7 Hugot JP,Laurent-puig P, Gower-Rousseau C, Olson JM, Lee JC, Beaugerie L, Naom I,Dupas JL, Van Gossum A, Groupe
d'EtudeTherapeutique des Affections Inflammatolres Digestives, Orholm M,Bonaiti-pellie C, Weissenbach J, Mathew CG,Lennard-JonesJE, Cortot A, Colombel JF, Thomas G. Mapping of a susceptibility locus forCrohn’sdisease on chromosome
, 百拇医药
16. Nature 1996;379:821-823
8 夏冰, 邓长生,Pena AS. 克罗恩病的第一个易感基因,NOD2(CARD15). 中华消化杂志 2002;22:307-308
9 Berrebi D, Maudinas R, Hugot JP, Chamaillard M, Chareyre F, DeLagausie P, Yang C, Desreumaux P, Giovannini M,Cezard JP, Zouali H, Emilie D, Peuchmaur M.Card15 gene overexpression in mononuclear and epithelial cells of the
inflamed Crohn’sdisease colon. Gut 2003;52:840-846
, 百拇医药
10 Lala S, Ogura Y, Osborne C, Hor SY, Bromfield A, Davies S, OgunbiyiO, Nunez G, Keshav S. Crohn’sdisease and the
NOD2 gene: a role for paneth cells.Gastroenterology 2003;125:47-57
11 Hampe J, Cuthbert A, Croucher PJ, Mirza MM, Mascheretti S, FisherS, Frenzel H, King K, Hasselmeyer A, Macpherson AJ,Bridger S, Van Deventer S, Forbes A,Nikolaus S, Lennard-Jones JE, Foelsch UR, Krawczak M, Lewis C, SchreiberS,Mathew CG. Association between insertionmutation in NOD2 gene and Crohn’sdisease in German and British populations.
Lancet 2001;357:1925-1928, 百拇医药( 瞿 艳, 郭秋莎, 夏 冰)
