血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞TIMP-1表达的作用
王磊,刘海林,上海第二医科大学附属第九人民医院消化科 上海市 200011
项目负责人:刘海林,200011, 上海市制造局路639号,上海第二医科大学附属第九人民医院消化科. liu_hailin@yahoo.com.cn
电话:021-63138341-5134 传真:021-63136856
收稿日期:2004-02-06 接受日期:2004-03-02
摘要
目的:研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对肝星状细胞组织基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的作用.
, http://www.100md.com
方法:体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6，分别加入不同浓度的AngⅡ(10-6-10-9mol/L)和AngⅡ10-6 moL/L+ Losartan10 -6 mol/L，作用48h后收集细胞，RT-PCR检测各组TIMP-1mRNA表达水平.
结果:10-6moL/L AngⅡ和10-7moL/LAngⅡ作用的HSC-T6细胞TIMP-1mRNA的表达分别为0.79±0.04和0.83±0.06，显著高于空白对照组0.62±0.08(P <0.05)，10-6AngⅡ+10-6 Losartan 组TIMP-1mRNA的表达为0.64±0.06，显著抑制10-6moL/L AngⅡ的作用(P<0.05).
, 百拇医药
结论:AngⅡ可通过AT1受体促进HSC-T6细胞TIMP-1的表达.
王磊,刘海林. 血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞TIMP-1表达的作用.世界华人消化杂志 2004;12(6):1455-1456
0 引言最近的研究发现，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种重要的促肝纤维化因子，AngⅡ可通过1型受体(AT1受体)介导促进肝星状细胞(HSC)增生、Ca2+内流和胶原合成[1].但在肝纤维化形成过程中AngⅡ对细胞外基质(ECM)的代谢是否发挥作用尚不十分清楚.组织基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)通过抑制ECM降解在肝纤维化过程中发挥重要作用.本研究观察了不同浓度AngⅡ和AT1受体拮抗剂对肝星状细胞株HSC-T6的TIMP-1表达的作用.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)，为美国加利福尼亚旧金山总医院肝病中心实验室Friedman教授建立，上海中医药大学肝病研究所徐列明教授惠赠;AngⅡ购自Calbiochem公司;AT1受体拮抗剂Losartan为默沙东公司产品;DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司; Trizol试剂盒，购自Sigma公司;Takara RT-PCR试剂盒为Takara公司产品;TIMP-1、b-actin引物由上海生工公司合成.
1.2 方法 HSC-T6细胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液制备为1×106/mL的单细胞悬液，接种于培养皿中，置含50mL/L CO2、37°C培养箱中培养24h，细胞贴壁后换含4mL/L胎牛血清的DMEM培养液，继续培养24h后，换含终浓度为10-6-10-9moL/LAngⅡ及AngⅡ10-6moL/L+Losartan10-6 moL/L的培养液，并设空白对照组，每组3盘细胞.作用48 h后，每盘细胞加1mL Trizol，将细胞收集至经DEPC水处理的Eppendorf管中，-80°C保存.按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，溶于20mL0.1 g/L DEPC水中，取溶解的RNA1 mL，用DEPC水稀释100倍，用紫外分光光度仪检测RNA纯度及浓度.逆转录反应体系:RNA 标本2 mg，逆转录酶1mL，dNTP混合物(10mmoL/L) 2 mL，10×PCR缓冲液2mL，MgCl2(25 mmoL/L) 4 mL，RNA酶抑制剂0.5mL，oligodt-Adaptor 引物1mL，其余为无RNA酶水，反应总体积共20mL.cDNA合成反应条件:30 °C，10min; 42 °C，60min; 99 °C，5min; 5 °C，5min. PCR反应体系:逆转录cDNA产物2mL，TIMP-1或b-actin上下游引物(表1)各1mL，Taq酶(5 U/ mL)0.25 mL，dNTP混合物(10mmoL/L) 0.5 mL、10×PCR缓冲液2mL、MgCl2(25 mmoL/L)1.2 mL、其余为无RNA酶水，反应总体积共20mL.PCR反应条件:94 °C预变性2 min; 之后94°C，30s; 56 °C，30s; 72 °C，1.5min; 共35个循环;最后72 °C 10 min，终止反应.PCR扩增产物加2mLDNA上样液混匀，经15g/L琼脂糖凝胶(含1g/L溴化乙啶)电泳后，经GIS-2800凝胶图像处理系统拍照，分析各产物条带平均灰度值，以b-actin产物条带灰度值为内参照计算mRNA相对表达量.
, 百拇医药
统计学处理 SAS统计软件包进行配对t检验.
表1 引物序列
, http://www.100md.com
2 结果10-6 moL/L AngⅡ组和10-7moL/LAngⅡ组作用的HSC-T6细胞TIMP-1mRNA的表达分别为0.79±0.04和0.83±0.06，显著高于空白对照组0.62±0.08(P <0.05)，10-6AngⅡ+10-6Losartan 组TIMP-1mRNA的表达为 0.64±0.06，显著抑制10-6mol/LAngⅡ的作用(P<0.05)(表2、图1).
表2 不同浓度AngⅡ和Losartan对HSC-T6细胞TIMP-1mRNA表达的作用 (mean±SD,n =3)
, http://www.100md.com
aP<0.05 vs 空白对照组,bP <0.05 vs 10-6 AngⅡ组.
图1 1: AngⅡ10-6moL/L; 2: AngⅡ10-7moL/L; 3:AngⅡ10-8 moL/L; 4: AngⅡ10-9 moL/L; 5: 空白对照;6: AngⅡ10-6moL/L+ Losartan 10-6 moL/L; M:标准DNA标记.AngⅡ对HSC-T6细胞TIMP-1mRNA表达的PCR电泳.
3 讨论近来研究报道，肝脏中也存在组织肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)[2]，作为RAAS的重要活性成分，AngⅡ在肝纤维化形成中的作用正逐渐引起广泛关注.动物实验表明大鼠分离培养的活化HSC和肝星状细胞株HSC-T6均可表达AT1受体，AT1受体拮抗剂和ACEI对实验性大鼠肝纤维化具有一定的治疗作用[3-4].人活化的HSC同样存在AT1受体表达，AngⅡ可以通过与其受体结合，促进HSC增生、胶原合成和Ca2+内流[1].TIMP-1是TIMP家族的重要成员，在肝纤维化过程中主要来源于活化的HSC，其通过抑制间质金属蛋白酶(MMP)的活性减少细胞外基质的降解，在肝纤维化的形成和发展中发挥十分重要的作用[5].而目前关于AngⅡ是否可以影响HSC的TIMP-1表达尚鲜有报道.
, http://www.100md.com
HSC-T6是通过转导SV40基因建立的SD大鼠HSC细胞株，具有稳定的活化HSC的生物学特性[6].我们在体外观察了不同浓度(10-6-10-9moL/L)的AngⅡ对HSC-T6细胞的作用.结果提示高浓度的AngⅡ可以促进HSC-T6细胞的TIMP-1mRNA的表达，而且该作用可以被AT1受体拮抗剂抑制，提示AngⅡ可以通过AT1受体的介导直接上调TIMP-1mRNA表达，从而通过抑制ECM降解促进肝纤维化的形成.同期国外亦有研究证明，不同浓度AngⅡ作用于培养的大鼠HSC后，TIMP-1的表达呈浓度和时间依赖性增加.而且此作用可被蛋白激酶C抑制剂所阻断，提示AngⅡ刺激TIMP-1生成的机制可能与蛋白激酶C介导的RNA从头合成途径有关[7].
因此，AngⅡ可通过上调HSC的TIMP-1参与抑制细胞外基质的降解，促进肝纤维化的形成，AngⅡ对其他肝纤维化相关MMP/TIMP的调节作用如何尚需要深入研究.
, 百拇医药
4 参考文献1 Bataller R, Gines P, Nicolas JM, Gorbig MN, Garcia-Ramallo E,Gasull X, Bosch J, Arroyo V, Rodes J. Angiotensin II induces
contraction and proliferation of humanhepatic stellate cells. Gastroenterology 2000;118:1149-1156
2 张晶, 宗春华,李定国, 周仁建,杜学亮, 周馨,徐芹芳, 陆汉明.肝内肾素-血管紧张素-醛固酮系统与大鼠肝纤维化的关系.世
界华人消化杂志 2002;10:397-400
3 Yoshiji H, Kuriyama S, Yoshii J, Ikenaka Y, Noguchi R, Nakatani T,Tsujinoue H, Fukui H. Angiotensin-II type 1 receptor
, http://www.100md.com
interaction is a major regulator for liverfibrosis development in rats. Hepatology 2001;34(4 Pt 1):745-750
4 李乾, 张桂英,李新华, 徐美华.卡托普利对肝纤维化模型鼠MMP-2,3 TIMP-2, 3 表达的影响.世界华人消化杂志
2003;11:1168-1171
5 刘海林,李宣海, 杨少平,王丹艺. 金属蛋白酶组织抑制因子-1与肝纤维化.中华消化杂志 2000;20:127-128
6 Vogel S, Piantedosi R, Frank J, Lalazar A, Rockey DC, Friedman SL,Blaner WS. An immortalized rat liver stellate cell line
, 百拇医药
(HSC-T6): a new cell model for the study ofretinoid metabolism in vitro. J Lipid Res 2000;41:882-893
7 Yoshiji H, Kuriyama S, Yoshii J, Ikenaka Y, Noguchi R, Yanase K,Namisaki T, Yamazaki M, Tsujinoue H, Imazu H, Fukui H.
Angiotensin-II induces the tissue inhibitorof metalloproteinases-1 through the protein kinase-Csignaling pathway inrat
liver fibrosis development. Hepatol Res 2003;27:51-56, http://www.100md.com( 王 磊, 刘海林)
项目负责人:刘海林,200011, 上海市制造局路639号,上海第二医科大学附属第九人民医院消化科. liu_hailin@yahoo.com.cn
电话:021-63138341-5134 传真:021-63136856
收稿日期:2004-02-06 接受日期:2004-03-02
摘要
目的:研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对肝星状细胞组织基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的作用.
, http://www.100md.com
方法:体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6，分别加入不同浓度的AngⅡ(10-6-10-9mol/L)和AngⅡ10-6 moL/L+ Losartan10 -6 mol/L，作用48h后收集细胞，RT-PCR检测各组TIMP-1mRNA表达水平.
结果:10-6moL/L AngⅡ和10-7moL/LAngⅡ作用的HSC-T6细胞TIMP-1mRNA的表达分别为0.79±0.04和0.83±0.06，显著高于空白对照组0.62±0.08(P <0.05)，10-6AngⅡ+10-6 Losartan 组TIMP-1mRNA的表达为0.64±0.06，显著抑制10-6moL/L AngⅡ的作用(P<0.05).
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结论:AngⅡ可通过AT1受体促进HSC-T6细胞TIMP-1的表达.
王磊,刘海林. 血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞TIMP-1表达的作用.世界华人消化杂志 2004;12(6):1455-1456
0 引言最近的研究发现，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种重要的促肝纤维化因子，AngⅡ可通过1型受体(AT1受体)介导促进肝星状细胞(HSC)增生、Ca2+内流和胶原合成[1].但在肝纤维化形成过程中AngⅡ对细胞外基质(ECM)的代谢是否发挥作用尚不十分清楚.组织基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)通过抑制ECM降解在肝纤维化过程中发挥重要作用.本研究观察了不同浓度AngⅡ和AT1受体拮抗剂对肝星状细胞株HSC-T6的TIMP-1表达的作用.
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1 材料和方法
1.1 材料 大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)，为美国加利福尼亚旧金山总医院肝病中心实验室Friedman教授建立，上海中医药大学肝病研究所徐列明教授惠赠;AngⅡ购自Calbiochem公司;AT1受体拮抗剂Losartan为默沙东公司产品;DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司; Trizol试剂盒，购自Sigma公司;Takara RT-PCR试剂盒为Takara公司产品;TIMP-1、b-actin引物由上海生工公司合成.
1.2 方法 HSC-T6细胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液制备为1×106/mL的单细胞悬液，接种于培养皿中，置含50mL/L CO2、37°C培养箱中培养24h，细胞贴壁后换含4mL/L胎牛血清的DMEM培养液，继续培养24h后，换含终浓度为10-6-10-9moL/LAngⅡ及AngⅡ10-6moL/L+Losartan10-6 moL/L的培养液，并设空白对照组，每组3盘细胞.作用48 h后，每盘细胞加1mL Trizol，将细胞收集至经DEPC水处理的Eppendorf管中，-80°C保存.按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，溶于20mL0.1 g/L DEPC水中，取溶解的RNA1 mL，用DEPC水稀释100倍，用紫外分光光度仪检测RNA纯度及浓度.逆转录反应体系:RNA 标本2 mg，逆转录酶1mL，dNTP混合物(10mmoL/L) 2 mL，10×PCR缓冲液2mL，MgCl2(25 mmoL/L) 4 mL，RNA酶抑制剂0.5mL，oligodt-Adaptor 引物1mL，其余为无RNA酶水，反应总体积共20mL.cDNA合成反应条件:30 °C，10min; 42 °C，60min; 99 °C，5min; 5 °C，5min. PCR反应体系:逆转录cDNA产物2mL，TIMP-1或b-actin上下游引物(表1)各1mL，Taq酶(5 U/ mL)0.25 mL，dNTP混合物(10mmoL/L) 0.5 mL、10×PCR缓冲液2mL、MgCl2(25 mmoL/L)1.2 mL、其余为无RNA酶水，反应总体积共20mL.PCR反应条件:94 °C预变性2 min; 之后94°C，30s; 56 °C，30s; 72 °C，1.5min; 共35个循环;最后72 °C 10 min，终止反应.PCR扩增产物加2mLDNA上样液混匀，经15g/L琼脂糖凝胶(含1g/L溴化乙啶)电泳后，经GIS-2800凝胶图像处理系统拍照，分析各产物条带平均灰度值，以b-actin产物条带灰度值为内参照计算mRNA相对表达量.
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统计学处理 SAS统计软件包进行配对t检验.
表1 引物序列
| 引物 | 序列 | 扩增长度(bp) | 位点 |
| TIMP-1 | 顺义 5’-GACCTGGTCATAAGGGCTAAA-3’ | 219 | 118-138 |
| 反义 5’-GCCCGTGATGAGAAACTCTTCACT-3' | 313-336 | ||
| b-actin | 顺义 5’-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3’ | 540 | 25-45 |
| 反义 5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’ | 541-564 |
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2 结果10-6 moL/L AngⅡ组和10-7moL/LAngⅡ组作用的HSC-T6细胞TIMP-1mRNA的表达分别为0.79±0.04和0.83±0.06，显著高于空白对照组0.62±0.08(P <0.05)，10-6AngⅡ+10-6Losartan 组TIMP-1mRNA的表达为 0.64±0.06，显著抑制10-6mol/LAngⅡ的作用(P<0.05)(表2、图1).
表2 不同浓度AngⅡ和Losartan对HSC-T6细胞TIMP-1mRNA表达的作用 (mean±SD,n =3)
| 分组(mol/L) | TIMP-1 | mRNA |
| 10-6 AngⅡ | 0.79±0.04a | P =3.29 |
| 10-7 AngⅡ | 0.83±0.06a | P =3.64 |
| 10-8 AngⅡ | 0.59±0.05 | P =0.55 |
| 10-9 AngⅡ | 0.61±0.06 | P =0.17 |
| 空白对照组 | 0.62±0.08 | |
| 10-6 AngⅡ+10-6Losartan | 0.64±0.06b | P =3.60 |
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aP<0.05 vs 空白对照组,bP <0.05 vs 10-6 AngⅡ组.
图1 1: AngⅡ10-6moL/L; 2: AngⅡ10-7moL/L; 3:AngⅡ10-8 moL/L; 4: AngⅡ10-9 moL/L; 5: 空白对照;6: AngⅡ10-6moL/L+ Losartan 10-6 moL/L; M:标准DNA标记.AngⅡ对HSC-T6细胞TIMP-1mRNA表达的PCR电泳.
3 讨论近来研究报道，肝脏中也存在组织肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)[2]，作为RAAS的重要活性成分，AngⅡ在肝纤维化形成中的作用正逐渐引起广泛关注.动物实验表明大鼠分离培养的活化HSC和肝星状细胞株HSC-T6均可表达AT1受体，AT1受体拮抗剂和ACEI对实验性大鼠肝纤维化具有一定的治疗作用[3-4].人活化的HSC同样存在AT1受体表达，AngⅡ可以通过与其受体结合，促进HSC增生、胶原合成和Ca2+内流[1].TIMP-1是TIMP家族的重要成员，在肝纤维化过程中主要来源于活化的HSC，其通过抑制间质金属蛋白酶(MMP)的活性减少细胞外基质的降解，在肝纤维化的形成和发展中发挥十分重要的作用[5].而目前关于AngⅡ是否可以影响HSC的TIMP-1表达尚鲜有报道.
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HSC-T6是通过转导SV40基因建立的SD大鼠HSC细胞株，具有稳定的活化HSC的生物学特性[6].我们在体外观察了不同浓度(10-6-10-9moL/L)的AngⅡ对HSC-T6细胞的作用.结果提示高浓度的AngⅡ可以促进HSC-T6细胞的TIMP-1mRNA的表达，而且该作用可以被AT1受体拮抗剂抑制，提示AngⅡ可以通过AT1受体的介导直接上调TIMP-1mRNA表达，从而通过抑制ECM降解促进肝纤维化的形成.同期国外亦有研究证明，不同浓度AngⅡ作用于培养的大鼠HSC后，TIMP-1的表达呈浓度和时间依赖性增加.而且此作用可被蛋白激酶C抑制剂所阻断，提示AngⅡ刺激TIMP-1生成的机制可能与蛋白激酶C介导的RNA从头合成途径有关[7].
因此，AngⅡ可通过上调HSC的TIMP-1参与抑制细胞外基质的降解，促进肝纤维化的形成，AngⅡ对其他肝纤维化相关MMP/TIMP的调节作用如何尚需要深入研究.
, 百拇医药
4 参考文献1 Bataller R, Gines P, Nicolas JM, Gorbig MN, Garcia-Ramallo E,Gasull X, Bosch J, Arroyo V, Rodes J. Angiotensin II induces
contraction and proliferation of humanhepatic stellate cells. Gastroenterology 2000;118:1149-1156
2 张晶, 宗春华,李定国, 周仁建,杜学亮, 周馨,徐芹芳, 陆汉明.肝内肾素-血管紧张素-醛固酮系统与大鼠肝纤维化的关系.世
界华人消化杂志 2002;10:397-400
3 Yoshiji H, Kuriyama S, Yoshii J, Ikenaka Y, Noguchi R, Nakatani T,Tsujinoue H, Fukui H. Angiotensin-II type 1 receptor
, http://www.100md.com
interaction is a major regulator for liverfibrosis development in rats. Hepatology 2001;34(4 Pt 1):745-750
4 李乾, 张桂英,李新华, 徐美华.卡托普利对肝纤维化模型鼠MMP-2,3 TIMP-2, 3 表达的影响.世界华人消化杂志
2003;11:1168-1171
5 刘海林,李宣海, 杨少平,王丹艺. 金属蛋白酶组织抑制因子-1与肝纤维化.中华消化杂志 2000;20:127-128
6 Vogel S, Piantedosi R, Frank J, Lalazar A, Rockey DC, Friedman SL,Blaner WS. An immortalized rat liver stellate cell line
, 百拇医药
(HSC-T6): a new cell model for the study ofretinoid metabolism in vitro. J Lipid Res 2000;41:882-893
7 Yoshiji H, Kuriyama S, Yoshii J, Ikenaka Y, Noguchi R, Yanase K,Namisaki T, Yamazaki M, Tsujinoue H, Imazu H, Fukui H.
Angiotensin-II induces the tissue inhibitorof metalloproteinases-1 through the protein kinase-Csignaling pathway inrat
liver fibrosis development. Hepatol Res 2003;27:51-56, http://www.100md.com( 王 磊, 刘海林)
