实时荧光定量PCR检测血清中HCV-RNA
张淑云,刘伟, 杜博,常曼丽,哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 黑龙江省哈尔滨市 150086
谷鸿喜,哈尔滨医科大学微生物学教研室 黑龙江省哈尔滨市 150086
项目负责人:张淑云,150086, 黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路247号,哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心. dongguanglu@0451.com
电话:0451-86605743
收稿日期:2004-03-05 接受日期:2004-03-16
, http://www.100md.com
摘要
目的:通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)与逆转录PCR(RT-PCR)两种方法检测血清HCV-RNA的结果比较，评价FQ-PCR法的临床应用价值.
方法:样本为经ELISA法筛选抗HCV阳性血清401份，其中221份采用实时荧光定量PCR法检测，180份采用RT-PCR法检测.
结果:FQ-PCR法检测HCV-RNA，阳性率(≥102拷贝/mL)68.3%(151/221)，定量范围在102-107拷贝/mL之间，但≤106拷贝/ml占98.1%(148/151);RT-PCR法检测阳性率为30%(54/180).
, 百拇医药
结论:FQ-PCR检测HCV-RNA较RT-PCR是一种省时、简便、敏感、特异和防污染的体外基因扩增与定量检测方法，其结果对临床诊断和疗效观察有重要的指导意义.
张淑云,刘伟, 谷鸿喜,杜博, 常曼丽.实时荧光定量PCR检测血清中HCV-RNA.世界华人消化杂志 2004;12(6):1464-1465
0 引言实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是近几年发展起来的一种核酸定量检测技术.FQ-PCR以其快速简便、定量和防污染等优点很快被临床应用[1]，但其检测结果的临床应用价值尚需进一步认识.为了探讨其在检测丙型肝炎病毒核酸(HCV-RNA)中的意义，我们对180例采用逆转录PCR(RT-PCR)和221例采用FQ-PCR进行HCV-RNA检测的结果进行了分析和比较，现报告如下.
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1 材料和方法
1.1 材料 1999-12/2003-05来我院门诊就诊，并经ELISA法筛选抗-HCV阳性患者的血清401份;RT-PCR法是使用北京人民医院肝病研究所提供的HCVRNA检测试剂盒和美国PE公司基因扩增仪(PE480);FQ-PCR是采用深圳匹基生物工程股份有限公司HCVRNA荧光定量检测试剂盒(一步法)和罗氏公司荧光定量PCR仪.
1.2 方法 按就诊时间分两组，前180份标本采用了RT-PCR法检测，后221份采用的是FQ-PCR法检测.实验操作和结果分析均严格按说明书进行.
统计学处理 采用SPSS10.0系统分析软件进行数据处理，两组率的比较采用x2检验.
, 百拇医药
2 结果
2.1 RT-PCR扩增结果 RT-PCR扩增产物经20g/L琼脂糖 凝胶电泳，于180bp处出现特异性核酸条带为HCVRNA阳性(图1).
2.2 FQ-PCR结果
2.2.1 FQ-PCR阳性标准曲线 HCV定量阳性标准品(HCV-RNA质粒)经FQ-PCR测定，以起始浓度的对数值为横坐标，以PCR扩增的循环域值(CT)为纵坐标，可以得到一条直线型标准曲线(图2)，相关系数r=-0.998，斜率为-3.558.
图1(PDF)RT-PCR扩增HCVRNA电泳. 1, 8为MpUC19DNA/Msp相对分子质量标准;2为阴性对照;3, 4, 5, 6为阳性标本.
, 百拇医药
图2(PDF)HCV-RNA的FQ-PCR定量标准曲线.
2.2.2 HCV-RNA的定量及其范围 FQ-PCR法检测221份血清，HCV-RNA≥102拷贝/mL占68.3%(151/221)，定量范围在102-107拷贝/mL之间;阳性分布主要在106拷贝/mL及其以下,占98.1%(148/151)(表1).
2.2.3 FQ-PCR与RT-PCR结果比较 FQ-PCR法检测血清中HCV-RNA阳性率为68.3%，而常规RT-PCR法阳性率为30%，二者差异显著(x2=58.3，P<0.01，表2);FQ-PCR法操作时间(3-4h)短于RT-PCR法(5-6h).
表1 FQ-PCR法检测221份血清中HCV-RNA的含量分布
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表2 两种不同方法检测血清中HCV-RNA结果比较
x2=58.3, P <0.01.
3 讨论目前抗HCV仍然是临床诊断HCV感染的主要手段，但存在多方面的局限性[2-3].常规RT-PCR及其他许多PCR法虽能反映体内病毒存在，也提高了HCV检测的灵敏度和特异性，但不能准确定量及动态观察病毒水平的变化，并有PCR产物污染的可能[4-6].
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FQ-PCR技术是在PCR过程中引入了特异性荧光探针杂交和光学检测技术，不仅提高了PCR扩增的特异性和检测的灵敏度，而且通过荧光共振能量迁移(FRET)原理、循环域值(CT值)的设定和CT-浓度标准曲线，实现了PCR起始模板的准确定量和在线监测PCR全过程.
本研究用FQ-PCR法检测了血清中HCV-RNA的含量，定量可低至102和高达107拷贝/mL，阳性率68.3%，显著高于RT-PCR法(30%)，与文献[7-8]报道基本一致，反映了该方法可定量和敏感的特点.测定的HCV-RNA水平98.1%在106拷贝/mL或以下，与乙肝病毒(HBV)在体内的高含量(106-108拷贝/mL)相比相对较低[9]，进一步证实了文献报道的HCV在体内的复制水平相对较低的特点[10-11].
, http://www.100md.com 本检测和程刚etal [3]的报道均显示FQ-PCR法检测HCV-RNA的定量范围较宽，HCV-RNA:102-107拷贝/mL，因而在用药前后及用药过程中采集多份标本进行检测，即动态观察HCV-RNA水平的变化，可以很好地反映药物的疗效.
另外，在FQ-PCR操作中，只需一次加样即可完成HCV-RNA的逆转录、扩增和定量，一次检测只需3-4h，与RT-PCR相比，具有方便、省时、快捷，有效解决PCR污染问题和自动化程度高等特点.
总之，FQ-PCR法检测HCV-RNA较RT-PCR法敏感，且能定量，能动态观察HCV-RNA水平的变化，可为了解丙型肝炎病毒体内复制情况及诊断、选择治疗方案和评估药物疗效等提供较可靠的依据.但FQ-PCR法也存在所需仪器昂贵、检测费用高等缺点，有待进一步改进.
4 参考文献1 卢圣栋. 生物技术与疾病诊断-兼论人类基因治疗.第1版.北京:化学工业出版社, 2002:88-98
, http://www.100md.com
2 赵继义,刘雪梅, 郭薇媛,高磊, 钟照华,谷鸿喜. RT套式PCR检测血浆HCVRNA及与抗HCV检测的比较.微生物学
杂志 2001;21:37-38
3 程刚,何蕴韶, 周新宇,李虎. 丙型肝炎病毒(HCV)荧光PCR(F-PCR)试剂盒的研制及与免疫学方法的比较.中国免疫学
杂志 2002;18:464-468
4 宋燕斌,崔晓红, 潘卫,王锦红, 戚中田.RT-PCR检测HCVRNA假阳性结果分析.第二军医大学学报 1996;17:391-392
5 汤伟, 杜绍财,陶其敏, 朱凌.抗污染RT-PCR检测HCVRNA的研究. 新消化病学杂志 1997;5:638-639
, http://www.100md.com
6 杨才生,卢桥生. 血清HCVRNA定量检测方法的研究进展.国外医学病毒学分册 1998;5:57-59
7 李伯安,马洪滨, 薛净,乔小红, 程云.定量聚合酶链反应在检测丙型肝炎病毒感染血清中的应用.中华传染病
杂志 1998;16:35-36
8 潘宁,张建琼, 李丽,单祥年. 应用荧光定量PCR检测血清中HCVRNA. 东南大学学报(医学版) 2003;22:16-18
9 张淑云,杜博, 刘伟,范业君, 谷鸿喜.实时荧光定量PCR检测HBV-DNA临床意义的研究.中华临床医药 2002;3:9-11
10 Mayerat C, Burgisser P, Lavanchy D, Mantegani A, Frei PC.Comparison of a competitive combined reverse
, 百拇医药
transcription-PCR assay with a branched-DNAassay for hepatitis C virus RNA quantitation. J Clin Microbiol
1996;34:2702-2706
11 Gerken G, Rothaar T, Rumi MG, Soffredini R, Trippler M, Blunk MJ,Butcher A, Soviero S, Colucci G. Performance of the
COBAS AMPLYCOR HCV MONITOR test, version2.0, an automated reverse transcription-PCR quantitative system for
hepatitis C virus load determination. JClin Microbiol 2000;38:2210-2214, 百拇医药( 张淑云, 刘 伟, 谷鸿喜, 杜 博, 常曼丽)
谷鸿喜,哈尔滨医科大学微生物学教研室 黑龙江省哈尔滨市 150086
项目负责人:张淑云,150086, 黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路247号,哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心. dongguanglu@0451.com
电话:0451-86605743
收稿日期:2004-03-05 接受日期:2004-03-16
, http://www.100md.com
摘要
目的:通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)与逆转录PCR(RT-PCR)两种方法检测血清HCV-RNA的结果比较，评价FQ-PCR法的临床应用价值.
方法:样本为经ELISA法筛选抗HCV阳性血清401份，其中221份采用实时荧光定量PCR法检测，180份采用RT-PCR法检测.
结果:FQ-PCR法检测HCV-RNA，阳性率(≥102拷贝/mL)68.3%(151/221)，定量范围在102-107拷贝/mL之间，但≤106拷贝/ml占98.1%(148/151);RT-PCR法检测阳性率为30%(54/180).
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结论:FQ-PCR检测HCV-RNA较RT-PCR是一种省时、简便、敏感、特异和防污染的体外基因扩增与定量检测方法，其结果对临床诊断和疗效观察有重要的指导意义.
张淑云,刘伟, 谷鸿喜,杜博, 常曼丽.实时荧光定量PCR检测血清中HCV-RNA.世界华人消化杂志 2004;12(6):1464-1465
0 引言实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是近几年发展起来的一种核酸定量检测技术.FQ-PCR以其快速简便、定量和防污染等优点很快被临床应用[1]，但其检测结果的临床应用价值尚需进一步认识.为了探讨其在检测丙型肝炎病毒核酸(HCV-RNA)中的意义，我们对180例采用逆转录PCR(RT-PCR)和221例采用FQ-PCR进行HCV-RNA检测的结果进行了分析和比较，现报告如下.
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1 材料和方法
1.1 材料 1999-12/2003-05来我院门诊就诊，并经ELISA法筛选抗-HCV阳性患者的血清401份;RT-PCR法是使用北京人民医院肝病研究所提供的HCVRNA检测试剂盒和美国PE公司基因扩增仪(PE480);FQ-PCR是采用深圳匹基生物工程股份有限公司HCVRNA荧光定量检测试剂盒(一步法)和罗氏公司荧光定量PCR仪.
1.2 方法 按就诊时间分两组，前180份标本采用了RT-PCR法检测，后221份采用的是FQ-PCR法检测.实验操作和结果分析均严格按说明书进行.
统计学处理 采用SPSS10.0系统分析软件进行数据处理，两组率的比较采用x2检验.
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2 结果
2.1 RT-PCR扩增结果 RT-PCR扩增产物经20g/L琼脂糖 凝胶电泳，于180bp处出现特异性核酸条带为HCVRNA阳性(图1).
2.2 FQ-PCR结果
2.2.1 FQ-PCR阳性标准曲线 HCV定量阳性标准品(HCV-RNA质粒)经FQ-PCR测定，以起始浓度的对数值为横坐标，以PCR扩增的循环域值(CT)为纵坐标，可以得到一条直线型标准曲线(图2)，相关系数r=-0.998，斜率为-3.558.
图1(PDF)RT-PCR扩增HCVRNA电泳. 1, 8为MpUC19DNA/Msp相对分子质量标准;2为阴性对照;3, 4, 5, 6为阳性标本.
, 百拇医药
图2(PDF)HCV-RNA的FQ-PCR定量标准曲线.
2.2.2 HCV-RNA的定量及其范围 FQ-PCR法检测221份血清，HCV-RNA≥102拷贝/mL占68.3%(151/221)，定量范围在102-107拷贝/mL之间;阳性分布主要在106拷贝/mL及其以下,占98.1%(148/151)(表1).
2.2.3 FQ-PCR与RT-PCR结果比较 FQ-PCR法检测血清中HCV-RNA阳性率为68.3%，而常规RT-PCR法阳性率为30%，二者差异显著(x2=58.3，P<0.01，表2);FQ-PCR法操作时间(3-4h)短于RT-PCR法(5-6h).
表1 FQ-PCR法检测221份血清中HCV-RNA的含量分布
| HCV-RNA的含量 | n | 百分率(%) |
| <102 | 70 | 31.7 |
| 102- | 21 | 9.5 |
| 103- | 37 | 16.7 |
| 104- | 26 | 11.8 |
| 105- | 40 | 18.1 |
| 106- | 24 | 10.8 |
| 107- | 3 | 1.4 |
| 合计 | 221 | 100 |
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表2 两种不同方法检测血清中HCV-RNA结果比较
| 方法 | n | 阳性份数 | 阳性率(%) |
| FQ-PCR | 221 | 151 | 68.3 |
| RT-PCR | 180 | 54 | 30 |
x2=58.3, P <0.01.
3 讨论目前抗HCV仍然是临床诊断HCV感染的主要手段，但存在多方面的局限性[2-3].常规RT-PCR及其他许多PCR法虽能反映体内病毒存在，也提高了HCV检测的灵敏度和特异性，但不能准确定量及动态观察病毒水平的变化，并有PCR产物污染的可能[4-6].
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FQ-PCR技术是在PCR过程中引入了特异性荧光探针杂交和光学检测技术，不仅提高了PCR扩增的特异性和检测的灵敏度，而且通过荧光共振能量迁移(FRET)原理、循环域值(CT值)的设定和CT-浓度标准曲线，实现了PCR起始模板的准确定量和在线监测PCR全过程.
本研究用FQ-PCR法检测了血清中HCV-RNA的含量，定量可低至102和高达107拷贝/mL，阳性率68.3%，显著高于RT-PCR法(30%)，与文献[7-8]报道基本一致，反映了该方法可定量和敏感的特点.测定的HCV-RNA水平98.1%在106拷贝/mL或以下，与乙肝病毒(HBV)在体内的高含量(106-108拷贝/mL)相比相对较低[9]，进一步证实了文献报道的HCV在体内的复制水平相对较低的特点[10-11].
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另外，在FQ-PCR操作中，只需一次加样即可完成HCV-RNA的逆转录、扩增和定量，一次检测只需3-4h，与RT-PCR相比，具有方便、省时、快捷，有效解决PCR污染问题和自动化程度高等特点.
总之，FQ-PCR法检测HCV-RNA较RT-PCR法敏感，且能定量，能动态观察HCV-RNA水平的变化，可为了解丙型肝炎病毒体内复制情况及诊断、选择治疗方案和评估药物疗效等提供较可靠的依据.但FQ-PCR法也存在所需仪器昂贵、检测费用高等缺点，有待进一步改进.
4 参考文献1 卢圣栋. 生物技术与疾病诊断-兼论人类基因治疗.第1版.北京:化学工业出版社, 2002:88-98
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2 赵继义,刘雪梅, 郭薇媛,高磊, 钟照华,谷鸿喜. RT套式PCR检测血浆HCVRNA及与抗HCV检测的比较.微生物学
杂志 2001;21:37-38
3 程刚,何蕴韶, 周新宇,李虎. 丙型肝炎病毒(HCV)荧光PCR(F-PCR)试剂盒的研制及与免疫学方法的比较.中国免疫学
杂志 2002;18:464-468
4 宋燕斌,崔晓红, 潘卫,王锦红, 戚中田.RT-PCR检测HCVRNA假阳性结果分析.第二军医大学学报 1996;17:391-392
5 汤伟, 杜绍财,陶其敏, 朱凌.抗污染RT-PCR检测HCVRNA的研究. 新消化病学杂志 1997;5:638-639
, http://www.100md.com
6 杨才生,卢桥生. 血清HCVRNA定量检测方法的研究进展.国外医学病毒学分册 1998;5:57-59
7 李伯安,马洪滨, 薛净,乔小红, 程云.定量聚合酶链反应在检测丙型肝炎病毒感染血清中的应用.中华传染病
杂志 1998;16:35-36
8 潘宁,张建琼, 李丽,单祥年. 应用荧光定量PCR检测血清中HCVRNA. 东南大学学报(医学版) 2003;22:16-18
9 张淑云,杜博, 刘伟,范业君, 谷鸿喜.实时荧光定量PCR检测HBV-DNA临床意义的研究.中华临床医药 2002;3:9-11
10 Mayerat C, Burgisser P, Lavanchy D, Mantegani A, Frei PC.Comparison of a competitive combined reverse
, 百拇医药
transcription-PCR assay with a branched-DNAassay for hepatitis C virus RNA quantitation. J Clin Microbiol
1996;34:2702-2706
11 Gerken G, Rothaar T, Rumi MG, Soffredini R, Trippler M, Blunk MJ,Butcher A, Soviero S, Colucci G. Performance of the
COBAS AMPLYCOR HCV MONITOR test, version2.0, an automated reverse transcription-PCR quantitative system for
hepatitis C virus load determination. JClin Microbiol 2000;38:2210-2214, 百拇医药( 张淑云, 刘 伟, 谷鸿喜, 杜 博, 常曼丽)
