IkB激酶在肝脏缺血再灌注中的作用
王磊,中国人民解放军第五医院普外科 宁夏回族自治区银川市 750004
窦科峰,王江,中国人民解放军第四军医大学西京医院肝胆外科陕西省西安市 710032
于丽萍,宁夏医学院第二附属医院内分泌科 宁夏回族自治区银川市 750001
项目负责人:王磊, 750004, 宁夏回族自治区银川市胜利南街,中国人民解放军第五医院普外科. angley@fmmu.edu.cn
电话:0951-4091131
, http://www.100md.com
收稿日期:2004-02-03 接受日期:2004-02-21
摘要
目的: 探讨IkB激酶(IKK)在肝脏缺血再灌注(HIR)中的作用.
方法:Wister大鼠随机分为对照组、缺血再灌注组(HIR组)、PDTC保护组(HIR+PDT组).HIR组将肝左叶及肝中叶入肝血流阻断60min后再灌注.保护组先经阴茎背静脉注射PDTC120 mg/kg-1后立即依HIR组致伤，对照组仅显露肝中叶及肝左叶肝蒂，不阻断，自阴茎背静脉注射无菌生理盐水1mL. 分别采用原位杂交、EMSA、免疫组化及赖氏法检测再灌注后1、6、12h IkB激酶表达、NF-kB活性、TNF-a的表达及血浆中ALT含量.
, 百拇医药
结果:损伤后IkB激酶表达水平、NF-kB结合活性、TNF-a表达水平、血浆中ALT含量升高;HIR+PDTC组与HIR组相比较，IkB激酶表达水平、NF-kB活性、TNF-a表达水平、血浆ALT水平降低.
结论:HIR后肝内IkB激酶可促进NF-kB的高水平激活引起肝内TNF-a等炎症相关细胞因子表达增强，从而导致肝脏损伤.干预IKK-NF-kB通路可能是防止HIR后急性肝脏损伤发生、发展的一个有效途径.
王磊,窦科峰, 于丽萍,王江. IkB激酶在肝脏缺血再灌注中的作用.世界华人消化杂志 2004;12(8):1957-1959
0 引言肝脏缺血再灌注(hepaticischemia reperfusion，HIR)是肝脏疾病和创伤中常见的病理过程.IkB激酶(IKK)-b是活化核因子(NF)-kB关键的上游分子，是NF-kB发挥基因转录调节功能的前提.NF-kB是一种广泛存在的快反应转录因子，可上调炎症因子的基因转录而引发炎症瀑布反应，诱导肝脏损伤[1-3].本实验通过制备动物HIR模型，观察肝脏组织中IKK-b的表达、NF-kB的活化情况以及肝脏组织中NF-kB的下游因子肿瘤坏死因子(TNF)-b表达，探讨IKK-b在HIR继发急性肝损伤(ALI)的病理机制中的作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物:♂Wister大鼠54只，体质量250-300g，由第四军医大学实验动物中心提供.主要试剂: IkB激酶原位杂交试剂盒(武汉博士德);NF-kB的寡核苷酸结合序列(Promega):5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’; 3’-T CAACTCCGCTGAAAGGGTC CG-5’.
1.2 方法
1.2.1 动物模型制作 选择试验Wister大鼠，随机分为对照组、HIR组和HIR+PDTC组.每组18只.HIR组经阴茎背静脉注射无菌生理盐水1mL后用无损伤动脉夹阻断肝左叶及肝中叶入肝血流，缺血时间为1h; HIR+PDTC组经阴茎背静脉注射吡咯烷二硫代氨甲基甲酸盐(PDTC)120 mg/kg-1后立即依HIR组方法致伤;对照组仅显露肝中叶及肝左叶肝蒂，不阻断，阴茎背静脉注射无菌生理盐水1mL. 分别于再灌注后 1，6，12h 3个时间点处死动物，取材(每时间点6只).
, 百拇医药
1.2.2 肝脏组织中IKK-b及TNF-a的表达 原位杂交及免疫组化法行IKK-b、TNF-a检测.
1.2.3 肝脏组织中NF-kB的蛋白结合活性测定 提取核蛋白并用凝胶迁移电泳(EMSA)法测定NF-kB活性[4].
1.2.4 血浆中ALT含量的测定 各时相动物活杀并于下腔静脉穿刺抽取血标本2mL，采用赖氏法行血浆ALT检测.
用LeicaQ 500Mc图像分析仪进行半定量分析，以吸光度(A)来表示IKK-b、TNF-a表达水平和NF-kB相对活性高低.采用SPSS统计分析软件进行统计学分析.半定量资料比较采用单因素方差分析，以P<0.05为显著性标准.
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 肝脏组织中IKK-b表达 HIR损伤后IKK-bmRNA表达较对照组明显增加，可于再灌注后6h达到高峰，应用PDTC预处理组IKK-bmRNA表达水平降低(表1).
表1 各组动物肝组织IKK-bmRNA表达的变化(A,mean±SD)
, http://www.100md.com
bP<0.01, aP <0.05 vs 对照组;dP <0.01 vs HIR组.
2.2 肝脏组织细胞中NF-kB的活性 HIR损伤后NF-kB活性较对照组明显增加，可于再灌注后6h达到高峰，应用PDTC预处理组NF-kB活性明显减弱(表2).
表2 HIR后肝组织NF-kB活性改变(A,mean±SD)
, 百拇医药
bP<0.001 vs 对照组;aP <0.05 vs HIR组.
2.3 肝脏组织中TNF-a的表达 HIR损伤后TNF-a基因表达明显高于对照组，于再灌注后6h达到高峰，应用PDTC预处理能明显降低(表3).
2.4 血浆中ALT含量的变化 损伤后血浆中ALT含量较对照组明显增加，并于再灌注后1h达到高峰，PDTC预处理组血浆中ALT含量较HIR损伤组降低(表4).
表3 HIR后肝脏TNF-a的表达(A,mean±SD)
, http://www.100md.com
bP<0.001 vs 对照组;aP <0.05 vs HIR组.
表4 肝脏缺血再灌HIR后血浆中ALT含量变化(IU/L,mean±SD)
, http://www.100md.com
bP<0.001vs 对照组;aP <0.05vs HIR组.
2.5 组织形态学变化 光镜下与对照组比较，HIR组肝脏缺血明显，肝细胞不同程度肿胀变性和空泡样变性，部分可见点状坏死及局灶性片状坏死，PDTC处理组组织变性及坏死减轻.
3 讨论HIR损伤仍然是肝脏部分切除及肝移植的严重制约之一，进一步探讨HIR损伤机制对肝移植及肝部分切除术后肝脏功能的保护具有特别重要意义.Omoya et al [5]进行的肝细胞在经历氧化环境下NF-kB活性研究表明氧自由基可使IkB减少，核内NF-kB活性增强.Yoshidomeet al [6]对大鼠部分肝缺血再灌注后肝内NF-kB的活性变化进行研究表明，损伤后NF-kB核转移并激活，于4h达到高峰，IL-10可抑制NF-kB激活，从而减轻肝损伤.
, 百拇医药
我们制备大鼠HIR模型，检测HIR后肝脏组织中IKK-bmRNA的表达及细胞核中NF-kB的蛋白结合活性.结果显示HIR组动物肝脏组织中IKK-bmRNA的表达、NF-kB的活性以及中TNF-a的表达均明显增加，并与肝脏组织损害程度、ALT增高程度相关;IKK-bmRNA的表达和NF-kB的活化在HIR后1h即达较高水平，6h达到峰值，TNF-a的释放高峰在6h，并同时伴有严重的肝脏组织炎症反应.提示机体受到HIR刺激后，可增加IKK的表达，促进NF-kB的活化和核移位，与DNA特异部位结合，调控基因转录活化，诱导细胞合成各种生物大分子[7-8]，从而上调TNF-a的基因转录.TNF-a作为细胞因子网络的启动因子，进一步诱发ALI.说明IKK-b是HIR继发急性肝脏损伤的关键环节;TNF-a在炎症瀑布反应的启动中发挥重要作用.
PDTC可明显缓解治疗组动物肝脏的炎症反应，同时明显降低肝脏组织IKK-bmRNA的表达、NF-kB的活化以及肝脏组织中TNF-a表达水平.说明PDTC的抗炎作用机制可能是通过减少IKK-b的表达，下调IKK-NF-kB通路，在基因转录水平降低细胞因子的合成和释放，遏制炎症瀑布反应，从而减轻组织损伤.提示干预IKK-NF-kB通路可能是防止HIR后急性肝脏损伤发生、发展的一个有效途径，PDTC对预防和治疗HIR后急性肝脏损伤有重要意义.
, 百拇医药
4 参考文献1 Kellum JA, Song M, Venkataraman R. Hemoadsorption removes tumornecrosis factor, interleukin-6, and interleukin-10,reduces nuclear factor-kappaB DNA binding,and improves short-term survival in lethal endotoxemia. Crit Care Med
2004;32:801-805
2 Gu XP, Jiang Y, Xu FT, Qiu YD, Ding YT. Effect of cold-ischemiatime on nuclear factor-kappaB activation and
inflammatory response in graft afterorthotopic liver transplantation in rats. World J Gastroenterol 2004;10:1000-1004
, 百拇医药
3 於亮亮,于皆平, 罗和生,于红刚. 核因子-kB与细胞凋亡关系的研究进展.世界华人消化杂志 2003;11:1628-1631
4 徐明清，薛兰，龚建平.缺血再灌注肝脏Kupffer细胞NF-kB激活及其意义.世界华人消化杂志 2001;9:1250-1253
5 Omoya T, Shimizu I, Zhou Y, Okamura Y, Inoue H, Lu G, Itonaga M,Honda H, Nomura M, Ito S. Effects of idoxifene and
estradiol on NF-kBactivation in cultured rat hepatocytes undergoing oxidative stress. Liver 2001;21:183-191
, http://www.100md.com 6 Yoshidome H, Kato A, Edwards MJ, Lentsch AB. Interleukin-10suppresses hepatic ischemia/reperfusion injury in mice:
Implications of a central role for nuclearfactor-kB.Hepatology 1999; 30:203-211
7 Prosch S, Wuttke R, Kruger DH, Volk HD. NF-kappaB-a potentialtherapeutic target for inhibition of human
cytomegalovirus (re)activation. Biol Chem 2002;383:1601-1609
8 Hentze H, Latta M, Kunstle G, Dhakshinamoorthy S, Ng PY, Porter AG,Wendel A. Topoisomerase inhibitor camptothecin
sensitizes mouse hepatocytes in vitro andin vivo to TNF-mediated apoptosis. Hepatology 2004;39:1311-1320, 百拇医药( 王 磊, 窦科峰, 于丽萍, 王 江)
窦科峰,王江,中国人民解放军第四军医大学西京医院肝胆外科陕西省西安市 710032
于丽萍,宁夏医学院第二附属医院内分泌科 宁夏回族自治区银川市 750001
项目负责人:王磊, 750004, 宁夏回族自治区银川市胜利南街,中国人民解放军第五医院普外科. angley@fmmu.edu.cn
电话:0951-4091131
, http://www.100md.com
收稿日期:2004-02-03 接受日期:2004-02-21
摘要
目的: 探讨IkB激酶(IKK)在肝脏缺血再灌注(HIR)中的作用.
方法:Wister大鼠随机分为对照组、缺血再灌注组(HIR组)、PDTC保护组(HIR+PDT组).HIR组将肝左叶及肝中叶入肝血流阻断60min后再灌注.保护组先经阴茎背静脉注射PDTC120 mg/kg-1后立即依HIR组致伤，对照组仅显露肝中叶及肝左叶肝蒂，不阻断，自阴茎背静脉注射无菌生理盐水1mL. 分别采用原位杂交、EMSA、免疫组化及赖氏法检测再灌注后1、6、12h IkB激酶表达、NF-kB活性、TNF-a的表达及血浆中ALT含量.
, 百拇医药
结果:损伤后IkB激酶表达水平、NF-kB结合活性、TNF-a表达水平、血浆中ALT含量升高;HIR+PDTC组与HIR组相比较，IkB激酶表达水平、NF-kB活性、TNF-a表达水平、血浆ALT水平降低.
结论:HIR后肝内IkB激酶可促进NF-kB的高水平激活引起肝内TNF-a等炎症相关细胞因子表达增强，从而导致肝脏损伤.干预IKK-NF-kB通路可能是防止HIR后急性肝脏损伤发生、发展的一个有效途径.
王磊,窦科峰, 于丽萍,王江. IkB激酶在肝脏缺血再灌注中的作用.世界华人消化杂志 2004;12(8):1957-1959
0 引言肝脏缺血再灌注(hepaticischemia reperfusion，HIR)是肝脏疾病和创伤中常见的病理过程.IkB激酶(IKK)-b是活化核因子(NF)-kB关键的上游分子，是NF-kB发挥基因转录调节功能的前提.NF-kB是一种广泛存在的快反应转录因子，可上调炎症因子的基因转录而引发炎症瀑布反应，诱导肝脏损伤[1-3].本实验通过制备动物HIR模型，观察肝脏组织中IKK-b的表达、NF-kB的活化情况以及肝脏组织中NF-kB的下游因子肿瘤坏死因子(TNF)-b表达，探讨IKK-b在HIR继发急性肝损伤(ALI)的病理机制中的作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物:♂Wister大鼠54只，体质量250-300g，由第四军医大学实验动物中心提供.主要试剂: IkB激酶原位杂交试剂盒(武汉博士德);NF-kB的寡核苷酸结合序列(Promega):5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’; 3’-T CAACTCCGCTGAAAGGGTC CG-5’.
1.2 方法
1.2.1 动物模型制作 选择试验Wister大鼠，随机分为对照组、HIR组和HIR+PDTC组.每组18只.HIR组经阴茎背静脉注射无菌生理盐水1mL后用无损伤动脉夹阻断肝左叶及肝中叶入肝血流，缺血时间为1h; HIR+PDTC组经阴茎背静脉注射吡咯烷二硫代氨甲基甲酸盐(PDTC)120 mg/kg-1后立即依HIR组方法致伤;对照组仅显露肝中叶及肝左叶肝蒂，不阻断，阴茎背静脉注射无菌生理盐水1mL. 分别于再灌注后 1，6，12h 3个时间点处死动物，取材(每时间点6只).
, 百拇医药
1.2.2 肝脏组织中IKK-b及TNF-a的表达 原位杂交及免疫组化法行IKK-b、TNF-a检测.
1.2.3 肝脏组织中NF-kB的蛋白结合活性测定 提取核蛋白并用凝胶迁移电泳(EMSA)法测定NF-kB活性[4].
1.2.4 血浆中ALT含量的测定 各时相动物活杀并于下腔静脉穿刺抽取血标本2mL，采用赖氏法行血浆ALT检测.
用LeicaQ 500Mc图像分析仪进行半定量分析，以吸光度(A)来表示IKK-b、TNF-a表达水平和NF-kB相对活性高低.采用SPSS统计分析软件进行统计学分析.半定量资料比较采用单因素方差分析，以P<0.05为显著性标准.
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 肝脏组织中IKK-b表达 HIR损伤后IKK-bmRNA表达较对照组明显增加，可于再灌注后6h达到高峰，应用PDTC预处理组IKK-bmRNA表达水平降低(表1).
表1 各组动物肝组织IKK-bmRNA表达的变化(A,mean±SD)
| 组别 | n | 1 h | 6 h | 12 h |
| 对照组 | 6 | 0.023±0.003 | 0.026±0.003 | 0.029±0.005 |
| HIR组 | 6 | 0.152±0.016b | 0.200±0.019b | 0.077±0.010b |
| HIR+PDTC组 | 6 | 0.118±0.010bd | 0.145±0.011bd | 0.050±0.008cd |
, http://www.100md.com
bP<0.01, aP <0.05 vs 对照组;dP <0.01 vs HIR组.
2.2 肝脏组织细胞中NF-kB的活性 HIR损伤后NF-kB活性较对照组明显增加，可于再灌注后6h达到高峰，应用PDTC预处理组NF-kB活性明显减弱(表2).
表2 HIR后肝组织NF-kB活性改变(A,mean±SD)
| 组别 | n | 1 h | 6 h | 12 h |
| 对照组 | 6 | 0.08±0.03 | 0.04±0.02 | 0.06±0.02 |
| HIR组 | 6 | 10.60±2.59b | 11.52±2.01b | 6.83±1.96b |
| HIR+PDTC组 | 6 | 3.49±0.96a | 7.15±3.37a | 2.52±0.64a |
, 百拇医药
bP<0.001 vs 对照组;aP <0.05 vs HIR组.
2.3 肝脏组织中TNF-a的表达 HIR损伤后TNF-a基因表达明显高于对照组，于再灌注后6h达到高峰，应用PDTC预处理能明显降低(表3).
2.4 血浆中ALT含量的变化 损伤后血浆中ALT含量较对照组明显增加，并于再灌注后1h达到高峰，PDTC预处理组血浆中ALT含量较HIR损伤组降低(表4).
表3 HIR后肝脏TNF-a的表达(A,mean±SD)
| 组别 | n | 1 h | 6 h | 12 h |
| 对照组 | 6 | 2.13±1.24 | 2.42±0.84 | 1.73±1.41 |
| HIR组 | 6 | 17.8±1.77b | 20.87±3.4b | 16.10±2.58b |
| HIR+PDTC组 | 6 | 13.02±3.24a | 15.44±1.91a | 14.63±1.32 |
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bP<0.001 vs 对照组;aP <0.05 vs HIR组.
表4 肝脏缺血再灌HIR后血浆中ALT含量变化(IU/L,mean±SD)
| 组别 | n | 1 h | 6 h | 12 h |
| 对照组 | 6 | 47.00±7.60 | 52.02±4.96 | 48.56±13.07 |
| HIR组 | 6 | 256.13±26.66b | 244.25±30.14b | 205.98±69.96b |
| HIR+PDTC组 | 6 | 241.53±20.72 | 163.45±10.18a | 129.45±13.87a |
, http://www.100md.com
bP<0.001vs 对照组;aP <0.05vs HIR组.
2.5 组织形态学变化 光镜下与对照组比较，HIR组肝脏缺血明显，肝细胞不同程度肿胀变性和空泡样变性，部分可见点状坏死及局灶性片状坏死，PDTC处理组组织变性及坏死减轻.
3 讨论HIR损伤仍然是肝脏部分切除及肝移植的严重制约之一，进一步探讨HIR损伤机制对肝移植及肝部分切除术后肝脏功能的保护具有特别重要意义.Omoya et al [5]进行的肝细胞在经历氧化环境下NF-kB活性研究表明氧自由基可使IkB减少，核内NF-kB活性增强.Yoshidomeet al [6]对大鼠部分肝缺血再灌注后肝内NF-kB的活性变化进行研究表明，损伤后NF-kB核转移并激活，于4h达到高峰，IL-10可抑制NF-kB激活，从而减轻肝损伤.
, 百拇医药
我们制备大鼠HIR模型，检测HIR后肝脏组织中IKK-bmRNA的表达及细胞核中NF-kB的蛋白结合活性.结果显示HIR组动物肝脏组织中IKK-bmRNA的表达、NF-kB的活性以及中TNF-a的表达均明显增加，并与肝脏组织损害程度、ALT增高程度相关;IKK-bmRNA的表达和NF-kB的活化在HIR后1h即达较高水平，6h达到峰值，TNF-a的释放高峰在6h，并同时伴有严重的肝脏组织炎症反应.提示机体受到HIR刺激后，可增加IKK的表达，促进NF-kB的活化和核移位，与DNA特异部位结合，调控基因转录活化，诱导细胞合成各种生物大分子[7-8]，从而上调TNF-a的基因转录.TNF-a作为细胞因子网络的启动因子，进一步诱发ALI.说明IKK-b是HIR继发急性肝脏损伤的关键环节;TNF-a在炎症瀑布反应的启动中发挥重要作用.
PDTC可明显缓解治疗组动物肝脏的炎症反应，同时明显降低肝脏组织IKK-bmRNA的表达、NF-kB的活化以及肝脏组织中TNF-a表达水平.说明PDTC的抗炎作用机制可能是通过减少IKK-b的表达，下调IKK-NF-kB通路，在基因转录水平降低细胞因子的合成和释放，遏制炎症瀑布反应，从而减轻组织损伤.提示干预IKK-NF-kB通路可能是防止HIR后急性肝脏损伤发生、发展的一个有效途径，PDTC对预防和治疗HIR后急性肝脏损伤有重要意义.
, 百拇医药
4 参考文献1 Kellum JA, Song M, Venkataraman R. Hemoadsorption removes tumornecrosis factor, interleukin-6, and interleukin-10,reduces nuclear factor-kappaB DNA binding,and improves short-term survival in lethal endotoxemia. Crit Care Med
2004;32:801-805
2 Gu XP, Jiang Y, Xu FT, Qiu YD, Ding YT. Effect of cold-ischemiatime on nuclear factor-kappaB activation and
inflammatory response in graft afterorthotopic liver transplantation in rats. World J Gastroenterol 2004;10:1000-1004
, 百拇医药
3 於亮亮,于皆平, 罗和生,于红刚. 核因子-kB与细胞凋亡关系的研究进展.世界华人消化杂志 2003;11:1628-1631
4 徐明清，薛兰，龚建平.缺血再灌注肝脏Kupffer细胞NF-kB激活及其意义.世界华人消化杂志 2001;9:1250-1253
5 Omoya T, Shimizu I, Zhou Y, Okamura Y, Inoue H, Lu G, Itonaga M,Honda H, Nomura M, Ito S. Effects of idoxifene and
estradiol on NF-kBactivation in cultured rat hepatocytes undergoing oxidative stress. Liver 2001;21:183-191
, http://www.100md.com 6 Yoshidome H, Kato A, Edwards MJ, Lentsch AB. Interleukin-10suppresses hepatic ischemia/reperfusion injury in mice:
Implications of a central role for nuclearfactor-kB.Hepatology 1999; 30:203-211
7 Prosch S, Wuttke R, Kruger DH, Volk HD. NF-kappaB-a potentialtherapeutic target for inhibition of human
cytomegalovirus (re)activation. Biol Chem 2002;383:1601-1609
8 Hentze H, Latta M, Kunstle G, Dhakshinamoorthy S, Ng PY, Porter AG,Wendel A. Topoisomerase inhibitor camptothecin
sensitizes mouse hepatocytes in vitro andin vivo to TNF-mediated apoptosis. Hepatology 2004;39:1311-1320, 百拇医药( 王 磊, 窦科峰, 于丽萍, 王 江)
