肝病患者血清酸性a-醋酸萘酯酶及其同工酶的变化
肖芸,戴志敏, 廖若男,贵阳医学院附院血液检验科 贵州省贵阳市 550001
王燕,贵阳医学院附院消化内科 贵州省贵阳市 550001
张维,贵阳医学院附院血液内科 贵州省贵阳市 550001
项目负责人:肖芸, 550001, 贵州省贵阳市,贵阳医学院附院血液检验科.
电话:0851-6855119-3145
收稿日期:2004-02-28 接受日期:2004-04-05
, 百拇医药
摘要
目的:探讨肝病患者血清酸性a-醋酸萘酯酶(acidalpha naphthyl aetate esterase，a-ANAE)及其同工酶的临床应用价值.
方法:通过比色法测定血清ANAE总活性.ANAE同工酶的检测采用琼脂糖凝胶电泳法及聚丙烯酰胺凝胶电泳法.
结果:肝病患者包括肝炎、肝硬化及肝癌血清ANAE含量均低于对照组，肝硬化组及肝癌组明显低于肝炎组.通过琼脂糖凝胶电泳法可以在肝病患者血清中检出两种ANAE同工酶异常谱形.聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出更多ANAE同工酶谱带.
结论:血清ANAE含量测定可作为评价肝细胞变性坏死、肝脏合成功能异常的一项血清学指标.肝病患者血清中检出的异常ANAE同工酶谱带性质、组成及在临床应用上的价值还有待于进一步探讨.
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肖芸,王燕, 戴志敏,张维, 廖若男.肝病患者血清酸性a-醋酸萘酯酶及其同工酶的变化.世界华人消化杂志 2004;12(8):1932-1933
0 引言酸性a-醋酸萘酯酶(acidalpha naphthyl aetate esterase，a-ANAEEC3.1.1.1 )是一种细胞溶酶体酶，主要作用于短链脂肪酸使其发生水解.ANAE主要分布于肝、胰、肾、小肠、单核巨噬细胞及组织细胞内.血清ANAE主要来源于肝脏内B酯酶.由于对血清ANAE的研究报告较少，人们对血清ANAE在肝病患者中的变化了解得也很少，因此我们参考文献方法[1]，对86例肝病患者血清ANAE含量进行检测，并采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法检测ANAE同工酶，初步观察血清ANAE含量及其同工酶在肝病中的变化规律，探讨其临床运用价值.
1 材料和方法1.1 材料 我院2003-10/12住院肝病患者86例，其中肝炎20例，肝硬化35例，肝癌31例;男45例，女41例，平均年龄54(27-76岁).肝炎及肝硬化诊断标准符合中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案[2]，肝癌诊断标准符合原发性肝癌的临床诊断与分期标准[3].正常对照为健康体检者53名，男27名，女26名，平均年龄35(28-43岁).静脉取血2 mL，分离血清，于4°C保存，1wk内检测.底物液: 2 moL/La-醋酸萘酯(上海振兴化工厂).终止液: 1.75moL/L冰醋酸. 显色液:1 mmoL/L固蓝B盐(上海化学试剂站进口分装).标准液: 2mmoL/L a-萘酚(湘中化学试剂开发中心).聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂:3 mL/L THB(pH8.9)，0.5moL/L THB(pH6.7)，360g/L Acr-10 g/L Bis(Sigma)，100g/L Acr-25 g/L，50g/L TeMed(AmresCo)，12.5g/L APS，20×甘氨酸-Tris电极缓冲液.721分光光度计(上海申化仪器自控公司)、DYY-Ⅲ型水平电泳槽、DYCZ-24D型垂直电泳槽(北京市六一仪器厂)、凝胶成像系统:UVP公司.
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1.2 方法 比色法测定血清酸性a-醋酸萘酯含量参照文献[1]进行.显色反应后用721分光光度计，520nm波长，以空白管调零后读取测定管和标准管吸光度，根据标准管吸光度及含量换算受检标本血清ANAE含量.单位定义: 每升血清在37°C酶反应1s产生1 mmoLa-萘酚为一个mKat/L.琼脂糖凝胶电泳法检测ANAE同工酶参照黄志华方法[4]，略有改进.电泳槽及载体缓冲液采用巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，m=0.06).于10 g/L琼脂糖-PVP凝胶板上加样后，胶面朝上置于电泳槽上，两侧用三层纱布搭桥，电泳槽两侧加入同等量电泳缓冲液.电流2 mA/cm，电压80V，稳定通电50min. 取下凝胶，加入显色液(称取a-醋酸萘酯5mg溶于0.2 mL丙酮中，加0.1moL/L pH6.2磷酸盐缓冲液10mL，固蓝B盐10mg振摇过滤，再加0.04mL吐湿20). 置37°C水浴显色20min，再用30mL/L冰醋酸漂洗，待漂洗的胶面清晰后观察并照相保存.聚丙烯酰胺凝胶电泳采用75g/L聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，分别配制分离胶和浓缩胶.首先将分离胶灌入电泳槽中，小心在胶面上叠加1mm厚水层，在灯光下聚合30min后，倾去水层，再灌入浓缩胶，装好样品梳，继续聚合2h. 取出样品梳，每孔加样血清10mL，电泳槽中加入1×电极缓冲液后开始电泳，电压160V，电泳40 min后，取下胶板显色、固定(同琼脂糖凝胶电泳).
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2 结果2.1 血清ANAE含量正常参考值(n=53)为28.0±5.8mKat/L(mean±1.96 SD). 在肝细胞受损时，包括肝炎、肝硬化和肝癌，患者血清ANAE含量均明显下降，经t检验，与对照组相比有极显著差异.肝硬化组与肝癌组比较无显著性差异，二者与肝炎组比较有差异(表1).各肝病组患者血清ANAE阳性率分别为肝炎55.0%(11/20)，肝硬化85.7%(30/35)，肝癌90.3%(28/31).经x2检验，肝炎组与肝硬化组、肝癌组之间比较有显著性差异(P<0.05).
表1 不同类型肝病患者血清ANAE含量
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采用t检验: bP<0.01vs对照组;cP <0.05, dP <0.01vs肝炎组;采用x2检验:eP <0.05vs肝炎组.
图1(PDF)ANAE同工酶检测-10g/L琼脂糖凝胶电泳.1: 正常对照;2-5: 肝病患者.
图2(PDF)ANAE同工酶检测-75g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳,160 V, 50 min.1: 正常对照;2-10: 肝病患者.
2.2 ANAE同工酶琼脂糖凝胶电泳检测按IUPAC/IUB建议从正极到负极分别用E1.2……表示相对电泳位置在位置，E1:Alb/a1，E2在a2位置，E3在a2/B位置.血清a-ANE同工酶区带从阳极到阴极分别为E1，E2，E3，色强度为E3>E1>E2，E1与E2几乎合并.正常对照可见较明显的E1，E3带，E2带着色浅，有的不易见(图1-带1).受检的几组肝病中出现三种谱形(图1):一种与对照相同(图1-带2，3);一种出现异常谱带(慢带)，靠近阳极端(图1-带4)，检出率为肝癌22.6%(7/31)，肝硬化20.0%(4/20)，肝炎5.0%(1/20);还有一种谱形为E2色度增强(图1-带5)，仅在肝癌组中检出，检出率为9.7%(3/31).聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ANAE同工酶采用75g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，经160V 50 min电泳，对照可分离出5条谱带(图2-1泳道).肝病组的变化主要表现在中间区带，表现为谱带色度减弱或出现异常谱带.
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3 讨论血清ANAE主要来源于肝脏内B酯酶.当肝细胞变性、坏死和纤维化后，血清中ANAE的活性下降[1].我们发现三组肝病患者血清ANAE含量均低于正常对照组，且肝硬化和肝癌组又明显低于肝炎组.但后二者比较无明显差异，阳性率也较为接近(85.7%，90.3%).由于ANAE可作为T淋巴细胞的一个表面标志，因此常用T淋巴细胞的ANAE活性来反映机体免疫功能.动物实验和临床研究证明，肿瘤患者的血清、癌组织匀浆上清液、腹水对T细胞的免疫反应有抑制作用.当切除肿瘤而又无远处转移时，可解除这种免疫抑制作用.这可以解释本实验中肝癌组与肝硬化组比较无显著差异的原因，且肝癌组并非所有患者血清ANAE含量都呈减低的表现.为了检测ANAE同工酶，我们采用琼脂糖凝胶电泳和75g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分别进行检测.正常人群的血清酸性a-ANE同工酶的谱形基本是恒定的，肝病患者中除正常谱带外，可检出两种异常谱带:一是在阴极侧出现慢带，另一异常是E2色度增强.黄志华etal [4]研究肝癌时也检出了第一种异常谱带，认为是E5带，而同样也属于慢带的E4带不出现在肝癌中，可在Ⅰ型重症糖尿病患者血清中检出.本研究中出现此慢带异常的以肝癌组检出最多(22.6%)，其次为肝硬化组(20.0%)、肝炎组(5.0%).另一异常谱带为E2色度增强，仅出现在肝癌血清中，检出率为9.7%.应用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ANAE同工酶，我们发现肝病组的变化主要表现在中间区带，表现为谱带色度减弱或出现异常谱带.有关ANAE同工酶的研究报道较少，ANAE同工酶及异常谱带的结构、组成及与疾病的关系还有待于进一步研究.
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总之，我们认为血清酸性a-醋酸萘酯酶活性在一定程度上可以反映肝功能损坏程度，不同肝病时期该酶活性可能与机体免疫功能有关，血清酸性a-醋酸萘酯酶含量测定可作为评价肝细胞变性坏死、肝脏合成功能异常的一项血清学指标.琼脂糖凝胶电泳检测酸性a-醋酸萘酯酶同工酶，在肝病患者血清中可以检出一些异常谱形.有关各谱带的性质、组成及在临床上的参考价值还有待于进一步探讨.
4 参考文献1 周玉贵,王传芳, 陆晓云,金勇, 刘昌元.血清酸性a-醋酸萘酯酶的比色测定及初步临床应用.临床检验
杂志 2003;21:211-213
2 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志 2000;8:324-329
3 中国抗癌协会肝癌专业委员会.原发性肝癌的临床诊断与分期标准.中华肝脏病杂志 2001;9:324
4 黄志华,周玉贵, 刘昌元.血清a-醋酸萘酯酶同工酶琼脂糖凝胶电泳及临床应用.临床检验杂志 1998;16:155-157, 百拇医药( 肖 芸, 王 燕, 戴志敏, 张 维, 廖若男)
王燕,贵阳医学院附院消化内科 贵州省贵阳市 550001
张维,贵阳医学院附院血液内科 贵州省贵阳市 550001
项目负责人:肖芸, 550001, 贵州省贵阳市,贵阳医学院附院血液检验科.
电话:0851-6855119-3145
收稿日期:2004-02-28 接受日期:2004-04-05
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摘要
目的:探讨肝病患者血清酸性a-醋酸萘酯酶(acidalpha naphthyl aetate esterase，a-ANAE)及其同工酶的临床应用价值.
方法:通过比色法测定血清ANAE总活性.ANAE同工酶的检测采用琼脂糖凝胶电泳法及聚丙烯酰胺凝胶电泳法.
结果:肝病患者包括肝炎、肝硬化及肝癌血清ANAE含量均低于对照组，肝硬化组及肝癌组明显低于肝炎组.通过琼脂糖凝胶电泳法可以在肝病患者血清中检出两种ANAE同工酶异常谱形.聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出更多ANAE同工酶谱带.
结论:血清ANAE含量测定可作为评价肝细胞变性坏死、肝脏合成功能异常的一项血清学指标.肝病患者血清中检出的异常ANAE同工酶谱带性质、组成及在临床应用上的价值还有待于进一步探讨.
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肖芸,王燕, 戴志敏,张维, 廖若男.肝病患者血清酸性a-醋酸萘酯酶及其同工酶的变化.世界华人消化杂志 2004;12(8):1932-1933
0 引言酸性a-醋酸萘酯酶(acidalpha naphthyl aetate esterase，a-ANAEEC3.1.1.1 )是一种细胞溶酶体酶，主要作用于短链脂肪酸使其发生水解.ANAE主要分布于肝、胰、肾、小肠、单核巨噬细胞及组织细胞内.血清ANAE主要来源于肝脏内B酯酶.由于对血清ANAE的研究报告较少，人们对血清ANAE在肝病患者中的变化了解得也很少，因此我们参考文献方法[1]，对86例肝病患者血清ANAE含量进行检测，并采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法检测ANAE同工酶，初步观察血清ANAE含量及其同工酶在肝病中的变化规律，探讨其临床运用价值.
1 材料和方法1.1 材料 我院2003-10/12住院肝病患者86例，其中肝炎20例，肝硬化35例，肝癌31例;男45例，女41例，平均年龄54(27-76岁).肝炎及肝硬化诊断标准符合中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案[2]，肝癌诊断标准符合原发性肝癌的临床诊断与分期标准[3].正常对照为健康体检者53名，男27名，女26名，平均年龄35(28-43岁).静脉取血2 mL，分离血清，于4°C保存，1wk内检测.底物液: 2 moL/La-醋酸萘酯(上海振兴化工厂).终止液: 1.75moL/L冰醋酸. 显色液:1 mmoL/L固蓝B盐(上海化学试剂站进口分装).标准液: 2mmoL/L a-萘酚(湘中化学试剂开发中心).聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂:3 mL/L THB(pH8.9)，0.5moL/L THB(pH6.7)，360g/L Acr-10 g/L Bis(Sigma)，100g/L Acr-25 g/L，50g/L TeMed(AmresCo)，12.5g/L APS，20×甘氨酸-Tris电极缓冲液.721分光光度计(上海申化仪器自控公司)、DYY-Ⅲ型水平电泳槽、DYCZ-24D型垂直电泳槽(北京市六一仪器厂)、凝胶成像系统:UVP公司.
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1.2 方法 比色法测定血清酸性a-醋酸萘酯含量参照文献[1]进行.显色反应后用721分光光度计，520nm波长，以空白管调零后读取测定管和标准管吸光度，根据标准管吸光度及含量换算受检标本血清ANAE含量.单位定义: 每升血清在37°C酶反应1s产生1 mmoLa-萘酚为一个mKat/L.琼脂糖凝胶电泳法检测ANAE同工酶参照黄志华方法[4]，略有改进.电泳槽及载体缓冲液采用巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，m=0.06).于10 g/L琼脂糖-PVP凝胶板上加样后，胶面朝上置于电泳槽上，两侧用三层纱布搭桥，电泳槽两侧加入同等量电泳缓冲液.电流2 mA/cm，电压80V，稳定通电50min. 取下凝胶，加入显色液(称取a-醋酸萘酯5mg溶于0.2 mL丙酮中，加0.1moL/L pH6.2磷酸盐缓冲液10mL，固蓝B盐10mg振摇过滤，再加0.04mL吐湿20). 置37°C水浴显色20min，再用30mL/L冰醋酸漂洗，待漂洗的胶面清晰后观察并照相保存.聚丙烯酰胺凝胶电泳采用75g/L聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，分别配制分离胶和浓缩胶.首先将分离胶灌入电泳槽中，小心在胶面上叠加1mm厚水层，在灯光下聚合30min后，倾去水层，再灌入浓缩胶，装好样品梳，继续聚合2h. 取出样品梳，每孔加样血清10mL，电泳槽中加入1×电极缓冲液后开始电泳，电压160V，电泳40 min后，取下胶板显色、固定(同琼脂糖凝胶电泳).
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2 结果2.1 血清ANAE含量正常参考值(n=53)为28.0±5.8mKat/L(mean±1.96 SD). 在肝细胞受损时，包括肝炎、肝硬化和肝癌，患者血清ANAE含量均明显下降，经t检验，与对照组相比有极显著差异.肝硬化组与肝癌组比较无显著性差异，二者与肝炎组比较有差异(表1).各肝病组患者血清ANAE阳性率分别为肝炎55.0%(11/20)，肝硬化85.7%(30/35)，肝癌90.3%(28/31).经x2检验，肝炎组与肝硬化组、肝癌组之间比较有显著性差异(P<0.05).
表1 不同类型肝病患者血清ANAE含量
| 分组 | n | 血清ANAE(mKat/L)mean±SD | 阳性率(%) |
| 对照组 | 53 | 28.0±2.9 | - |
| 肝炎组 | 20 | 20.6±5.4b | 55.0 |
| 肝硬化组 | 35 | 14.6±7.4bd | 85.7e |
| 肝癌组 | 31 | 15.3±6.0bc | 90.3e |
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采用t检验: bP<0.01vs对照组;cP <0.05, dP <0.01vs肝炎组;采用x2检验:eP <0.05vs肝炎组.
图1(PDF)ANAE同工酶检测-10g/L琼脂糖凝胶电泳.1: 正常对照;2-5: 肝病患者.
图2(PDF)ANAE同工酶检测-75g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳,160 V, 50 min.1: 正常对照;2-10: 肝病患者.
2.2 ANAE同工酶琼脂糖凝胶电泳检测按IUPAC/IUB建议从正极到负极分别用E1.2……表示相对电泳位置在位置，E1:Alb/a1，E2在a2位置，E3在a2/B位置.血清a-ANE同工酶区带从阳极到阴极分别为E1，E2，E3，色强度为E3>E1>E2，E1与E2几乎合并.正常对照可见较明显的E1，E3带，E2带着色浅，有的不易见(图1-带1).受检的几组肝病中出现三种谱形(图1):一种与对照相同(图1-带2，3);一种出现异常谱带(慢带)，靠近阳极端(图1-带4)，检出率为肝癌22.6%(7/31)，肝硬化20.0%(4/20)，肝炎5.0%(1/20);还有一种谱形为E2色度增强(图1-带5)，仅在肝癌组中检出，检出率为9.7%(3/31).聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ANAE同工酶采用75g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，经160V 50 min电泳，对照可分离出5条谱带(图2-1泳道).肝病组的变化主要表现在中间区带，表现为谱带色度减弱或出现异常谱带.
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3 讨论血清ANAE主要来源于肝脏内B酯酶.当肝细胞变性、坏死和纤维化后，血清中ANAE的活性下降[1].我们发现三组肝病患者血清ANAE含量均低于正常对照组，且肝硬化和肝癌组又明显低于肝炎组.但后二者比较无明显差异，阳性率也较为接近(85.7%，90.3%).由于ANAE可作为T淋巴细胞的一个表面标志，因此常用T淋巴细胞的ANAE活性来反映机体免疫功能.动物实验和临床研究证明，肿瘤患者的血清、癌组织匀浆上清液、腹水对T细胞的免疫反应有抑制作用.当切除肿瘤而又无远处转移时，可解除这种免疫抑制作用.这可以解释本实验中肝癌组与肝硬化组比较无显著差异的原因，且肝癌组并非所有患者血清ANAE含量都呈减低的表现.为了检测ANAE同工酶，我们采用琼脂糖凝胶电泳和75g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分别进行检测.正常人群的血清酸性a-ANE同工酶的谱形基本是恒定的，肝病患者中除正常谱带外，可检出两种异常谱带:一是在阴极侧出现慢带，另一异常是E2色度增强.黄志华etal [4]研究肝癌时也检出了第一种异常谱带，认为是E5带，而同样也属于慢带的E4带不出现在肝癌中，可在Ⅰ型重症糖尿病患者血清中检出.本研究中出现此慢带异常的以肝癌组检出最多(22.6%)，其次为肝硬化组(20.0%)、肝炎组(5.0%).另一异常谱带为E2色度增强，仅出现在肝癌血清中，检出率为9.7%.应用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ANAE同工酶，我们发现肝病组的变化主要表现在中间区带，表现为谱带色度减弱或出现异常谱带.有关ANAE同工酶的研究报道较少，ANAE同工酶及异常谱带的结构、组成及与疾病的关系还有待于进一步研究.
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总之，我们认为血清酸性a-醋酸萘酯酶活性在一定程度上可以反映肝功能损坏程度，不同肝病时期该酶活性可能与机体免疫功能有关，血清酸性a-醋酸萘酯酶含量测定可作为评价肝细胞变性坏死、肝脏合成功能异常的一项血清学指标.琼脂糖凝胶电泳检测酸性a-醋酸萘酯酶同工酶，在肝病患者血清中可以检出一些异常谱形.有关各谱带的性质、组成及在临床上的参考价值还有待于进一步探讨.
4 参考文献1 周玉贵,王传芳, 陆晓云,金勇, 刘昌元.血清酸性a-醋酸萘酯酶的比色测定及初步临床应用.临床检验
杂志 2003;21:211-213
2 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志 2000;8:324-329
3 中国抗癌协会肝癌专业委员会.原发性肝癌的临床诊断与分期标准.中华肝脏病杂志 2001;9:324
4 黄志华,周玉贵, 刘昌元.血清a-醋酸萘酯酶同工酶琼脂糖凝胶电泳及临床应用.临床检验杂志 1998;16:155-157, 百拇医药( 肖 芸, 王 燕, 戴志敏, 张 维, 廖若男)
