食管癌细胞RNA致敏树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫
王健,苏安英, 柴锡庆,门金娥, 张向阳,郑海萍, 田珂,河北工程学院教务处 河北省邯郸市 056038
河北省科技研究与发展计划项目资助,No. 00276168D
项目负责人:王健, 056038, 河北省邯郸市,河北工程学院教务处.
收稿日期:2004-04-19 接受日期:2004-05-13
摘要
目的:观察人食管癌细胞株RNA致敏的树突状细胞(DC)所诱导的特异性抗肿瘤免疫效应，探讨肿瘤细胞RNA直接致敏DC进行食管癌生物治疗的可能性.
, 百拇医药
方法:食管癌细胞株T.Tn体外培养，提取RNA;正常人外周血，进行体外DC的培养扩增;食管癌RNA直接致敏DC，MTT法检测食管癌RNA活化DC所诱生的淋巴细胞对食管癌T.Tn、视网膜母细胞瘤SoRb-70的体外杀伤效应.
结果:正常人外周血来源的DC，经食管癌T.Tn细胞株RNA直接致敏后，成功诱导特异性抗肿瘤免疫反应，T.TnRNA组CTL在靶效比为20:1时对T.Tn，SoRb-70的杀伤率分别为85.8%、1.9%，而对照组对这两种细胞的杀伤率分别为1.0%和0.5%.
结论:肿瘤RNA致敏DC可以诱导特异性抗肿瘤免疫，是一种有前景的食管癌治疗手段，有进一步研究的价值.
, 百拇医药 王健,苏安英, 柴锡庆,门金娥, 张向阳,郑海萍, 田珂.食管癌细胞RNA致敏树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫.世界华人消化杂志 2004;12(8):1976-1978
0 引言食管癌的治疗手段包括手术、介入治疗、化疗、生物治疗等，尽管手术技巧不断提高，化疗药物不断更新，生物治疗也进行了积极的探索，但仍然无法彻底解决肿瘤复发与转移的问题.大量研究表明，通过骨髓、脐血、外周血等途径获取树突状细胞(dendriticcell，DC)，经体外培养、扩增、抗原负载及成熟，可以打破肿瘤免疫耐受，诱导强烈的特异性抗肿瘤免疫.由于食管癌具有异质性大、抗原性弱，缺乏特异性肿瘤抗原的特点，和多数肿瘤一样不能激发有效的免疫反应[1]，同时食管癌标本污染重，难以体外培养及保证无菌等，使得DC难以广泛用于食管癌的免疫治疗.近年来文献[2-3]报道肿瘤细胞RNA致敏DC可以诱导强烈的抗肿瘤免疫，但在人类食管癌方面尚无报道.我们研究了人食管癌细胞RNA致敏DC的免疫效应如下.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 人食管癌细胞株T.Tn，购自上海中科院细胞研究所;人视网膜母细胞瘤细胞株SoRb-70，购自湖南医科大学肿瘤研究所;二甲亚砜和MTT为Sigma产品;Trizol试剂盒为上海生工产品;rhGM-CSF，rhIL-4，rhIL-2，CD1a单抗为Immunotech产品;淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂.
1.2 方法 常规培养细胞，以Trizol试剂盒对培养的细胞进行RNA抽提，-20°C保存.部分用于测定260nm和280 nm吸光度A值，估计纯度并定量.部分进行RNA电泳，观察18S和28 S条带的完整性.自健康志愿者抽取外周血100mL，以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMNC)，在37°C和 50mL/L CO2饱和湿度条件下培养 4h，取贴壁细胞，加入完全培养基和细胞因子rhGM-CSF800 kU/L，rhIL-4500 kU/L在37 °C和50mL/L CO2饱和湿度条件下培养.倒置显微镜下观察细胞形态，第3，7，24d流式细胞仪检测CD1a阳性细胞比例.第7 d收获细胞作为DC用于RNA致敏.培养7 d的贴壁PBMNC分成2组，重悬于RPMI1640培养基中.实验组直接加入T.TnRNA10 pg/DC，对照组不加RNA.混匀后在50mL/L CO2、37°C、饱和湿度条件下培养4h，制备效应细胞，用于淋巴细胞的活化.RNA致敏的同时，取同一志愿者外周血100mL，同上方法制备PBMNC，贴壁4h后取非贴壁细胞，作为淋巴细胞来源.将T.Tn RNA致敏的DC和未经RNA致敏的DC，分别按1:100的比例加入自体非贴壁PBMNC，混匀后在37°C，50mL/L CO2 ，饱和湿度，rhGM-CSF800 kU/L、rhIL-4500 kU/L、rhIL-2100 kU/mL条件下共同培养3d，活化淋巴细胞，制备效应细胞.在96孔塑料培养板中每孔加入T.Tn细胞1×104，按照效应与靶细胞比例1:1，1:10，1:20，分别加入T.TnRNA致敏DC所活化的淋巴细胞和未经T.TnRNA致敏DC所活化的淋巴细胞.每种条件设3个复孔，并分别设立效应细胞和肿瘤细胞平行对照孔.孵育4 h后，各孔分别加入5g/L MTT溶液，再次孵育4h，离心沉淀，弃去上清，每孔加入0.2mL DMSO(二甲亚砜)，震荡溶解10min，用酶联免疫检测仪，波长570nm，测定各孔吸光度A值.计算杀伤率＝(靶细胞A十效应细胞A-效靶细胞杀伤反应后A)/靶细胞A×100%同样方法96孔培养板中加入SoRb-70细胞，按上法测定不同方法活化的非贴壁PBMNC细胞对SoRb-70细胞的体外杀伤效应，并计算杀伤率.
, 百拇医药
2 结果T.Tn细胞经Trizol试剂盒抽提的RNA，经电泳可见到完整的18S和28S条带，分光光度计检测A260/A280=1.84，>1.8.正常PBMNC贴壁后得到贴壁细胞.培养3 d后可见悬浮的细胞群落，有短的突起.7 d左右大部分悬浮细胞有大量毛刺，具有典型的DC形态.流式细胞仪检测CD1a阳性细胞随时间增加也相应增加，第3，7，24d CD1a阳性细胞率分别为6.5%、46.9%和65.3%.T.Tn RNA致敏DC活化非贴壁PBMNC时，可见淋巴细胞在DC周围呈花环样聚集，同样活化淋巴细胞对T.Tn细胞体外杀伤实验时，可见淋巴细胞在肿瘤细胞周围簇状聚集;而未经T.TnRNA致敏DC活化非贴壁PBMNC时，以及两组淋巴细胞对SoRb-70细胞体外杀伤实验时，均未见到明显的淋巴细胞聚集效应.T.Tn RNA致敏DC诱导的CTL对T.Tn有强大的杀伤作用，而未经T.TnRNA致敏DC诱导的T细胞对T.Tn无显著杀伤作用，与对无关肿瘤SoRb-70类似，二者相比有非常显著差异(P<0.01，表1).
, 百拇医药
表1 T.Tn RNA致敏DC所活化的淋巴细胞对不同肿瘤的杀伤率(%)
3 讨论肿瘤RNA被DC摄取，在DC内翻译成相应的蛋白质，经过抗原处理加工，被加工成抗原肽，被运送到DC表面，通过MHC限制性途径，激活T细胞，发挥特异性抗肿瘤效应[4].至今对肾癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤进行了这一方法的尝试，取得了良好的效果.在食管癌方面，国内还未见报道.我们采用常规方法培养扩增DC，将食管癌T.Tn细胞RNA在无血清培养体系中直接致敏DC在体外杀伤实验中，食管癌细胞T.TnRNA致敏DC所活化淋巴细胞，对食管癌细胞株T.Tn的杀伤率在效靶比为20:1时达到85.8%，而对无关肿瘤视网膜母细胞瘤SoRb-70细胞杀伤率很低;未经RNA致敏的DC所活化淋巴细胞，对T.Tn和SoRb-70的体外杀伤率都很低.表明这种抗肿瘤免疫具有肿瘤特异性，同时也说明从食管癌T.Tn细胞提取的RNA具有完整的功能，通过致敏可以实现肿瘤抗原的抗原加工递呈.
, http://www.100md.com
肿瘤RNA致敏DC治疗包括食管癌在内的恶性肿瘤，具有明显的优势，如RNA可以从少量肿瘤细胞中提取并体外扩增，解决抗原制备时肿瘤细胞来源有限的问题[5];其次无需知道肿瘤抗原的确切成分[6];另外也可轻易解决手术标本伴有细菌污染的问题等.对食管癌标本抽提RNA，直接致敏DC，我们也观察到相似的体外杀伤效果，整个培养体系末出现细菌污染(待发表).这一方法目前也存在一定的不足，如RNA致敏的最佳时机、剂量，是否需要载体以及使用何种载体还没有定论，RNA的稳定性问题也没有完全解决等.我们采用肿瘤RNA直接致敏培养7d的DC，剂量为10pg RNA/DC，取得良好的体外实验效果.
随着对DC的功能和RNA致敏机制的进一步认识，肿瘤RNA致敏DC治疗恶性肿瘤必将受到更多重视.今后发展方向主要是通过消减PCR差异或显示PCR获取并扩增肿瘤组织中差异表达的基因，以RNA的形式致敏DC既达到诱导强烈抗肿瘤免疫的目的，同时又可有效避免可能出现的严重自身免疫损害.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Chen LP. Immunological ignorance of silent antigens as anexplanation of tumor evasion. Immunol Today
1998;19:27-30
2 Mitchell DA, Nair S. RNA - transfected dendritic cells in cancerimmunotherapy. J Clin Invest 2000;106:1065-1069
3 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, Coleman DM, Dahm P, Vieweg J.Human dendritic cells transfected with renal tumor
, http://www.100md.com
RNA stimulate polyclonal T-cell responsesagainst antigens expressed by primary and metastatic tumors. Cancer Res
2001;61:3388-3393
4 Liu M. Transfected human dendritic cells as cancer vaccines. NatBiotechnol 1998;16:335-336
5 Boczkowski D, Nair SK, Nam JH, Lyerly HK, Gilboa E. Induction oftumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses
using dendritic cells transfected withmessenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res 2000;60:1028-1034
6 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, Wu NZ, Dahm P, Pruitt SK,Boczkowski D, Nair SK, Ballo MS, Gilboa E, Vieweg J.
Induction of polyclonal prostatecancer-specific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumorRNA. J
Immunol 2001;166:2953-2960, http://www.100md.com( 王 健, 苏安英, 柴锡庆, 门金娥, 张向阳, 郑海萍, 田 珂)
河北省科技研究与发展计划项目资助,No. 00276168D
项目负责人:王健, 056038, 河北省邯郸市,河北工程学院教务处.
收稿日期:2004-04-19 接受日期:2004-05-13
摘要
目的:观察人食管癌细胞株RNA致敏的树突状细胞(DC)所诱导的特异性抗肿瘤免疫效应，探讨肿瘤细胞RNA直接致敏DC进行食管癌生物治疗的可能性.
, 百拇医药
方法:食管癌细胞株T.Tn体外培养，提取RNA;正常人外周血，进行体外DC的培养扩增;食管癌RNA直接致敏DC，MTT法检测食管癌RNA活化DC所诱生的淋巴细胞对食管癌T.Tn、视网膜母细胞瘤SoRb-70的体外杀伤效应.
结果:正常人外周血来源的DC，经食管癌T.Tn细胞株RNA直接致敏后，成功诱导特异性抗肿瘤免疫反应，T.TnRNA组CTL在靶效比为20:1时对T.Tn，SoRb-70的杀伤率分别为85.8%、1.9%，而对照组对这两种细胞的杀伤率分别为1.0%和0.5%.
结论:肿瘤RNA致敏DC可以诱导特异性抗肿瘤免疫，是一种有前景的食管癌治疗手段，有进一步研究的价值.
, 百拇医药 王健,苏安英, 柴锡庆,门金娥, 张向阳,郑海萍, 田珂.食管癌细胞RNA致敏树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫.世界华人消化杂志 2004;12(8):1976-1978
0 引言食管癌的治疗手段包括手术、介入治疗、化疗、生物治疗等，尽管手术技巧不断提高，化疗药物不断更新，生物治疗也进行了积极的探索，但仍然无法彻底解决肿瘤复发与转移的问题.大量研究表明，通过骨髓、脐血、外周血等途径获取树突状细胞(dendriticcell，DC)，经体外培养、扩增、抗原负载及成熟，可以打破肿瘤免疫耐受，诱导强烈的特异性抗肿瘤免疫.由于食管癌具有异质性大、抗原性弱，缺乏特异性肿瘤抗原的特点，和多数肿瘤一样不能激发有效的免疫反应[1]，同时食管癌标本污染重，难以体外培养及保证无菌等，使得DC难以广泛用于食管癌的免疫治疗.近年来文献[2-3]报道肿瘤细胞RNA致敏DC可以诱导强烈的抗肿瘤免疫，但在人类食管癌方面尚无报道.我们研究了人食管癌细胞RNA致敏DC的免疫效应如下.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 人食管癌细胞株T.Tn，购自上海中科院细胞研究所;人视网膜母细胞瘤细胞株SoRb-70，购自湖南医科大学肿瘤研究所;二甲亚砜和MTT为Sigma产品;Trizol试剂盒为上海生工产品;rhGM-CSF，rhIL-4，rhIL-2，CD1a单抗为Immunotech产品;淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂.
1.2 方法 常规培养细胞，以Trizol试剂盒对培养的细胞进行RNA抽提，-20°C保存.部分用于测定260nm和280 nm吸光度A值，估计纯度并定量.部分进行RNA电泳，观察18S和28 S条带的完整性.自健康志愿者抽取外周血100mL，以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMNC)，在37°C和 50mL/L CO2饱和湿度条件下培养 4h，取贴壁细胞，加入完全培养基和细胞因子rhGM-CSF800 kU/L，rhIL-4500 kU/L在37 °C和50mL/L CO2饱和湿度条件下培养.倒置显微镜下观察细胞形态，第3，7，24d流式细胞仪检测CD1a阳性细胞比例.第7 d收获细胞作为DC用于RNA致敏.培养7 d的贴壁PBMNC分成2组，重悬于RPMI1640培养基中.实验组直接加入T.TnRNA10 pg/DC，对照组不加RNA.混匀后在50mL/L CO2、37°C、饱和湿度条件下培养4h，制备效应细胞，用于淋巴细胞的活化.RNA致敏的同时，取同一志愿者外周血100mL，同上方法制备PBMNC，贴壁4h后取非贴壁细胞，作为淋巴细胞来源.将T.Tn RNA致敏的DC和未经RNA致敏的DC，分别按1:100的比例加入自体非贴壁PBMNC，混匀后在37°C，50mL/L CO2 ，饱和湿度，rhGM-CSF800 kU/L、rhIL-4500 kU/L、rhIL-2100 kU/mL条件下共同培养3d，活化淋巴细胞，制备效应细胞.在96孔塑料培养板中每孔加入T.Tn细胞1×104，按照效应与靶细胞比例1:1，1:10，1:20，分别加入T.TnRNA致敏DC所活化的淋巴细胞和未经T.TnRNA致敏DC所活化的淋巴细胞.每种条件设3个复孔，并分别设立效应细胞和肿瘤细胞平行对照孔.孵育4 h后，各孔分别加入5g/L MTT溶液，再次孵育4h，离心沉淀，弃去上清，每孔加入0.2mL DMSO(二甲亚砜)，震荡溶解10min，用酶联免疫检测仪，波长570nm，测定各孔吸光度A值.计算杀伤率＝(靶细胞A十效应细胞A-效靶细胞杀伤反应后A)/靶细胞A×100%同样方法96孔培养板中加入SoRb-70细胞，按上法测定不同方法活化的非贴壁PBMNC细胞对SoRb-70细胞的体外杀伤效应，并计算杀伤率.
, 百拇医药
2 结果T.Tn细胞经Trizol试剂盒抽提的RNA，经电泳可见到完整的18S和28S条带，分光光度计检测A260/A280=1.84，>1.8.正常PBMNC贴壁后得到贴壁细胞.培养3 d后可见悬浮的细胞群落，有短的突起.7 d左右大部分悬浮细胞有大量毛刺，具有典型的DC形态.流式细胞仪检测CD1a阳性细胞随时间增加也相应增加，第3，7，24d CD1a阳性细胞率分别为6.5%、46.9%和65.3%.T.Tn RNA致敏DC活化非贴壁PBMNC时，可见淋巴细胞在DC周围呈花环样聚集，同样活化淋巴细胞对T.Tn细胞体外杀伤实验时，可见淋巴细胞在肿瘤细胞周围簇状聚集;而未经T.TnRNA致敏DC活化非贴壁PBMNC时，以及两组淋巴细胞对SoRb-70细胞体外杀伤实验时，均未见到明显的淋巴细胞聚集效应.T.Tn RNA致敏DC诱导的CTL对T.Tn有强大的杀伤作用，而未经T.TnRNA致敏DC诱导的T细胞对T.Tn无显著杀伤作用，与对无关肿瘤SoRb-70类似，二者相比有非常显著差异(P<0.01，表1).
, 百拇医药
表1 T.Tn RNA致敏DC所活化的淋巴细胞对不同肿瘤的杀伤率(%)
| T.Tn RNA致敏组/效靶比 | 未经T.Tn RNA致敏组/效靶比 | |||||
| 1:1 | 10:1 | 20:1 | 1:1 | 10:1 | 20:1 | |
| T.Tn | 58.8±8.6 | 72.4±8.8 | 85.8±9.6 | 2.4±1.9 | 1.8±1.2 | 2.0±1.7 |
| SoRb-70 | 1.1±1.0 | 1.3±1.1 | 1.1±1.0 | 0.4±0.2 | 0.6±0.3 | 0.5±0.2 |
3 讨论肿瘤RNA被DC摄取，在DC内翻译成相应的蛋白质，经过抗原处理加工，被加工成抗原肽，被运送到DC表面，通过MHC限制性途径，激活T细胞，发挥特异性抗肿瘤效应[4].至今对肾癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤进行了这一方法的尝试，取得了良好的效果.在食管癌方面，国内还未见报道.我们采用常规方法培养扩增DC，将食管癌T.Tn细胞RNA在无血清培养体系中直接致敏DC在体外杀伤实验中，食管癌细胞T.TnRNA致敏DC所活化淋巴细胞，对食管癌细胞株T.Tn的杀伤率在效靶比为20:1时达到85.8%，而对无关肿瘤视网膜母细胞瘤SoRb-70细胞杀伤率很低;未经RNA致敏的DC所活化淋巴细胞，对T.Tn和SoRb-70的体外杀伤率都很低.表明这种抗肿瘤免疫具有肿瘤特异性，同时也说明从食管癌T.Tn细胞提取的RNA具有完整的功能，通过致敏可以实现肿瘤抗原的抗原加工递呈.
, http://www.100md.com
肿瘤RNA致敏DC治疗包括食管癌在内的恶性肿瘤，具有明显的优势，如RNA可以从少量肿瘤细胞中提取并体外扩增，解决抗原制备时肿瘤细胞来源有限的问题[5];其次无需知道肿瘤抗原的确切成分[6];另外也可轻易解决手术标本伴有细菌污染的问题等.对食管癌标本抽提RNA，直接致敏DC，我们也观察到相似的体外杀伤效果，整个培养体系末出现细菌污染(待发表).这一方法目前也存在一定的不足，如RNA致敏的最佳时机、剂量，是否需要载体以及使用何种载体还没有定论，RNA的稳定性问题也没有完全解决等.我们采用肿瘤RNA直接致敏培养7d的DC，剂量为10pg RNA/DC，取得良好的体外实验效果.
随着对DC的功能和RNA致敏机制的进一步认识，肿瘤RNA致敏DC治疗恶性肿瘤必将受到更多重视.今后发展方向主要是通过消减PCR差异或显示PCR获取并扩增肿瘤组织中差异表达的基因，以RNA的形式致敏DC既达到诱导强烈抗肿瘤免疫的目的，同时又可有效避免可能出现的严重自身免疫损害.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Chen LP. Immunological ignorance of silent antigens as anexplanation of tumor evasion. Immunol Today
1998;19:27-30
2 Mitchell DA, Nair S. RNA - transfected dendritic cells in cancerimmunotherapy. J Clin Invest 2000;106:1065-1069
3 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, Coleman DM, Dahm P, Vieweg J.Human dendritic cells transfected with renal tumor
, http://www.100md.com
RNA stimulate polyclonal T-cell responsesagainst antigens expressed by primary and metastatic tumors. Cancer Res
2001;61:3388-3393
4 Liu M. Transfected human dendritic cells as cancer vaccines. NatBiotechnol 1998;16:335-336
5 Boczkowski D, Nair SK, Nam JH, Lyerly HK, Gilboa E. Induction oftumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses
using dendritic cells transfected withmessenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res 2000;60:1028-1034
6 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, Wu NZ, Dahm P, Pruitt SK,Boczkowski D, Nair SK, Ballo MS, Gilboa E, Vieweg J.
Induction of polyclonal prostatecancer-specific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumorRNA. J
Immunol 2001;166:2953-2960, http://www.100md.com( 王 健, 苏安英, 柴锡庆, 门金娥, 张向阳, 郑海萍, 田 珂)
