诱导型一氧化氮合酶基因启动子-969G→C多态性的功能
程元桥,王文琦,广东省东莞市人民医院感染科 广东省东莞市 523018
林菊生,廖家智,华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科湖北省武汉市 430030
姜晓丹,冯玮, 熊平,华中科技大学同济医学院免疫研究所湖北省武汉市 430030
项目负责人:林菊生,430030, 湖北省武汉市汉口解放大道2239号,华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所. linjusheng2002@yahoo.com.cn
, http://www.100md.com
电话:027-83662688-3595
收稿日期:2004-03-05 接受日期:2004-04-29
摘要
目的:探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子-969G→C多态性的功能意义.
方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增已知的iNOS基因启动子-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子DNA序列，再采用基因重组技术将获得的启动子与PGVB-2-E荧光素酶载体质粒连接，构建新的重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt，并进行酶切图谱分析和测序分析.然后将重组质粒分别在脂质体的介导下转染HepG2细胞，检测荧光素酶的表达水平，分析不同基因型启动子的活性差异.
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结果:成功构建iNOS基因-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子荧光素酶载体重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt，发现iNOSmt启动子的活性比对照启动子的活性显著升高，升高132.1%，差异有显著性(P<0.05)，iNOSwt启动子的活性比对照启动子的活性升高14.3%，差异无显著性(P>0.05). iNOSmt启动子活性升高的百分率是iNOSwt启动子的9倍.
结论:iNOS基因启动子-969G→C的多态性改变导致该启动子的活性增强.
程元桥,林菊生, 王文琦,廖家智, 姜晓丹,冯玮, 熊平.诱导型一氧化氮合酶基因启动子-969G→C多态性的功能.世界华人消化杂志 2004;12(9):2219-2222
0 引言诱导型一氧化氮合酶(inducednitric oxide synthase，iNOS)基因启动子是已知最大最复杂的启动子之一，他的表达受精密复杂的调控.遗传易感性对基因的功能影响可表现在几个方面，其中基因启动子突变后可直接影响他的功能活性，表现为功能增强或减弱，所表达的蛋白水平也可发生改变.基础研究发现iNOS基因启动子-969处有G→C的多态性.然而，这一多态性的功能意义尚不清楚.我们构建iNOS基因启动子-969G→C多态性的不同基因型启动子的荧光素酶报道重组质粒，瞬时转染HepG2细胞，分别测定荧光素酶的活性，以研究iNOS基因启动子-969G→C多态性的功能.
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1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌DH5a菌株和HepG2细胞株由武汉同济医院肝病研究所细胞室保存;荧光素酶报道基因质粒PGV-B2(4818 bp)及PGV-B2-E质粒(6391 bp)由日本熊本大学医学院心血管系HirofumiYasue 教授惠赠;限制性内切酶KpnI，Xho I，T4DNA连接酶(Promega);高保真TaqDNA聚合酶(Pfu);LB培养基(Gibco);质粒提取试剂盒，低溶点琼脂糖，脂质体Lipofectin(Promega)，b-肌动蛋白驱动b-半乳糖苷酶报道质粒(PanVera Corp); 荧光素酶检测试剂盒，b半乳糖苷酶检测试剂盒(Promega);PCR仪(PerkinEmer)，恒温水浴箱，低温高速离心机，恒温震荡培养摇床;CO2细胞培养箱(德国Heraeus)，超净工作台，倒置显微镜(日本Nikon)，细胞计数器，荧光分光光度计F-4500(日本Hitachi)等.
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1.2 方法 从GenBank下载人iNOS基因全部序列(GenBankaccession，L09210)，设计启动子引物时，在两端分别接上KpnI酶切序列GGTACC，XhoI酶切序列CTCGAG.上游序列为S:5’-GACGGTACCGAAGGAAATGAGTGGACAGTGG-3’(7 086-7 107)，下游序列为AS:5’-GACCTCGAGAACAGTCAAACCAGGAAGAGACC-3’(8 453-8 431). 由上海生工公司合成.
1.2.1 重组质粒的构建筛选与鉴定 模板DNA来自iNOS基因启动子-969G→C多态性GG和GC基因型患者DNA.PCR反应预变性94°C 4 min，主循环变性94°C 50 s，退火41°C 1 min，延伸72°C 1 min 30 s，23循环.最后72 °C延伸5min. 2%琼脂糖(含EB)电泳鉴定片段大小.用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收纯化PCR产物，得到iNOSwt和iNOSmt启动子片段.常规法制备感受态DH5a细菌，转化PGV-B2-E质粒后大量制备质粒.再将PCR获得的启动子片段和PGV-B2-E载体质粒分别用XhoI和Kpn I酶切，回收纯化.最后将不同的启动子片段分别与PGV-B2-E质粒载体片段在T4DNA连接酶的作用下连接，得到构建的含启动子荧光素酶重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt.将重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt分别转化感受态细菌DH5a，阴性对照以TE替代连接产物.阳性对照以PGV-B2-E质粒替代连接产物.挑选中等大小的Amp抗性菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中振摇培养过夜.用质粒小量制备试剂盒抽提质粒，行PCR鉴定及酶切分析鉴定.获得阳性克隆.将iNOS基因启动子PCR扩增产物及选择经酶切和PCR鉴定阳性的重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt，送上海生物工程公司测序分析，以证实构建成功.
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1.2.2 脂质体介导的质粒转染细胞 选择已鉴定的重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt阳性菌落，细菌扩增后大量制备转染质粒，溶于TE50 uL，-20 °C保存.采用脂质体Lipofectin介导的转染技术，将重组质粒转染HepG2细胞，并与b-肌动蛋白驱动b-半乳糖苷酶报道质粒220ng共转染，作为内对照，以控制转染效率.室温下放置30min，以便形成DNA-脂质体复合物.阳性对照组加PGV-B2-E质粒.阴性对照组加PGV-B2质粒. 将转染质粒的细胞培养28h检测. 转染的细胞经3次冻融裂解(-80°C 30 min，室温10min)后，裂解的细胞液转移至离心管，离心.取上清，按荧光素酶检测说明书加样.用荧光分光光度计测定20s内的光输出量.b-半乳糖苷酶的检测按说明书执行，用分光光度计在410nm处测定A值.
统计学处理 所获的数据用均值±标准差表示.荧光素酶活性用裂解细胞提取物中每克蛋白荧光素光亮强度lightu/g 表示. 启动子活性用标准化相对光单位(NRLU)代表.标准化相对光单位/A410=同一细胞提取物测得的平均荧光素酶活性/b-半乳糖苷酶活性.采用Bonferroni方法进行统计处理，P<0.05则有统计学意义.
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2 结果
2.1 PCR扩增目的片段的结果 应用PCR技术扩增iNOS基因启动子的全长达1385 bp，分别获得含iNOS基因野生和突变的启动子目的片段.由于扩增的目的片段较长，在PCR过程中易出现碱基错配，所以采用了高保真TaqDNA聚合酶(Pfu).在实验初期，PCR扩增经历了多次的失败.经查阅文献和回顾设计引物的过程及改进实验程序，终于扩增出所需的目的基因片段(图1).
图1(PDF)iNOS基因启动子PCR扩增结果.M: PCR Marker (237-1 543 bp), 1-4: PCR产物1385 bp.
图2(PDF)重组质粒的酶切PCR鉴定结果.A: PCR Marker (377-1 543 bp); B: 重组质粒PCR;C: 质粒经KpnI 和Xho I双酶切;D: 重组质粒经KpnI单酶切; E空质粒经KpnI单酶切; F:DNA Marker (λDNA/Hind III).
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2.2 重组质粒 将所构建的重组质粒经单酶切(KpnI)、双酶切(KpnI 和XhoI)及质粒PCR扩增产物，用1%的琼脂糖电泳(图2).构建的重组质粒pPGV-iNOS经双酶切后呈现1373 bp 和4 765bp两条片段，单酶切为呈现6138 bp的一条带.空质粒PGB-B2-E单酶切为6391 bp的一条带.B泳道的产物约为1kb，与预计相符;C泳道的短片段于B泳道一致，长片段与E泳道的产物一致，而D泳道的产物稍落后于C和E泳道，说明其长度大于5kb. 结果证实iNOS基因启动子荧光报道重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt构建成功.将测序碱基序列以Blast的基因格式调人GeneBank比较，经Sequencer软件分析，pPGV-iNOSwt和PGV-B2-iNOSmt的送检序列与GenBank查询结果完全一致.说明重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt构建成功.图3为部分测序的结果.
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2.3 启动子功能活性分析 将启动子活性用标准化相对光单位(NRLU)表示.启动子iNOSmt的活性为6.5×104，与对照基因启动子B2-E的活性相比显著升高，升高132.1%，差异有显著性(P<0.05). 启动子iNOSwt的活性为3.2×104，与对照基因启动子B2-E的活性相比升高14.3%，差异无显著性(P>0.05). iNOSmt启动子活性升高的百分率是iNOSwt启动子的9倍.
图3(PDF)部分iNOS基因启动子测序.
3 讨论基因启动子为DNA链上能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA转录的序列，是基因表达不可缺少的重要调控序列.启动子位于结构基因的5’端，只能近距离起作用，有方向性，空间位置恒定，是转录起始的基本信号结构，决定基因的转录效率.因此，当基因启动子DNA链上的碱基发生突变或插入缺失，可影响基因的转录调控功能.研究启动子的功能变化，最常用的方法是构建启动子重组体质粒-瞬时转染分析法.我们成功构建的iNOS基因启动子-969位点多态性的荧光素酶报道基因重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt，用脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2，研究iNOS基因启动子-969G→C多态性的不同基因型启动子的功能活性差异.结果发现启动子iNOSmt的活性比对照基因启动子B2-E的活性显著升高，差异有显著性.启动子iNOSwt的活性比对照基因启动子B2-E的活性稍高，差异无显著性.表明iNOS基因启动子-969G→C的多态性导致该启动子的功能活性增强，GC基因型携带者比GG基因型携带者可能有更强的iNOS表达.
, 百拇医药
Jurgen etal [1]在1998年研究儿童严重疟疾患者与iNOS基因启动子-969G→C的多态性的关系中，发现杂合子GC的频率为17%，轻度疟疾患者杂合子GC的频率为30%，认为这种频率的差异与iNOS基因启动子-969G→C的突变后对疟疾产生抵抗有关.他们推测杂合子GC基因型患者可能产生大量的NO，对疟疾具有杀伤作用.本结果初步证实了Jurgenet al的推测，iNOS基因启动子-969G→C的多态性导致该启动子的功能活性增强，产生大量的NO，发挥效应.最近Morris etal [2]报道在iNOS基因启动子-756到-716位点之间有一个AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性与iNOS基因启动子的功能活性有关，他们发现iNOS基因启动子为“+”等位基因时活性比启动子为“-”等位基因的活性高25倍.认为在iNOS基因启动子AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性中，“+”等位基因携带者是iNOS基因高表达，导致2型糖尿病患者出现并发症的原因.本研究的结果与Morris的结果有相似之处，即iNOS基因启动子多态性改变影响其功能活性.为了区分iNOS基因启动子-969G→C多态性中是否存在iNOS基因启动子AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性位点，将构建的iNOS基因启动子-969G→C位点多态性的荧光素酶报道基因重组体质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt测序的结果，输入GenBank进行对比分析，未发现有AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性相同序列.提示iNOS基因启动子的这两个多态性都影响该基因启动子的功能活性.
, 百拇医药
4 参考文献1 Jurgen FJ, Morduller KB, Lell B. Polymorphism in promoter region ofinducible nitric oxide synthase gene and protection
against Malaria. Lancet 1998;351:265-266
2 Morris BJ, Markus A, Glenn CL. Association of a functionalinducible nitric oxide synthase promoter variant with
complications in type 2 diabetes. J Mol Med 2002;80:96-104, http://www.100md.com( 程元桥, 林菊生, 王文琦, 廖家智, 姜晓丹, 冯 玮, 熊 平)
林菊生,廖家智,华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科湖北省武汉市 430030
姜晓丹,冯玮, 熊平,华中科技大学同济医学院免疫研究所湖北省武汉市 430030
项目负责人:林菊生,430030, 湖北省武汉市汉口解放大道2239号,华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所. linjusheng2002@yahoo.com.cn
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电话:027-83662688-3595
收稿日期:2004-03-05 接受日期:2004-04-29
摘要
目的:探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子-969G→C多态性的功能意义.
方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增已知的iNOS基因启动子-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子DNA序列，再采用基因重组技术将获得的启动子与PGVB-2-E荧光素酶载体质粒连接，构建新的重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt，并进行酶切图谱分析和测序分析.然后将重组质粒分别在脂质体的介导下转染HepG2细胞，检测荧光素酶的表达水平，分析不同基因型启动子的活性差异.
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结果:成功构建iNOS基因-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子荧光素酶载体重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt，发现iNOSmt启动子的活性比对照启动子的活性显著升高，升高132.1%，差异有显著性(P<0.05)，iNOSwt启动子的活性比对照启动子的活性升高14.3%，差异无显著性(P>0.05). iNOSmt启动子活性升高的百分率是iNOSwt启动子的9倍.
结论:iNOS基因启动子-969G→C的多态性改变导致该启动子的活性增强.
程元桥,林菊生, 王文琦,廖家智, 姜晓丹,冯玮, 熊平.诱导型一氧化氮合酶基因启动子-969G→C多态性的功能.世界华人消化杂志 2004;12(9):2219-2222
0 引言诱导型一氧化氮合酶(inducednitric oxide synthase，iNOS)基因启动子是已知最大最复杂的启动子之一，他的表达受精密复杂的调控.遗传易感性对基因的功能影响可表现在几个方面，其中基因启动子突变后可直接影响他的功能活性，表现为功能增强或减弱，所表达的蛋白水平也可发生改变.基础研究发现iNOS基因启动子-969处有G→C的多态性.然而，这一多态性的功能意义尚不清楚.我们构建iNOS基因启动子-969G→C多态性的不同基因型启动子的荧光素酶报道重组质粒，瞬时转染HepG2细胞，分别测定荧光素酶的活性，以研究iNOS基因启动子-969G→C多态性的功能.
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1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌DH5a菌株和HepG2细胞株由武汉同济医院肝病研究所细胞室保存;荧光素酶报道基因质粒PGV-B2(4818 bp)及PGV-B2-E质粒(6391 bp)由日本熊本大学医学院心血管系HirofumiYasue 教授惠赠;限制性内切酶KpnI，Xho I，T4DNA连接酶(Promega);高保真TaqDNA聚合酶(Pfu);LB培养基(Gibco);质粒提取试剂盒，低溶点琼脂糖，脂质体Lipofectin(Promega)，b-肌动蛋白驱动b-半乳糖苷酶报道质粒(PanVera Corp); 荧光素酶检测试剂盒，b半乳糖苷酶检测试剂盒(Promega);PCR仪(PerkinEmer)，恒温水浴箱，低温高速离心机，恒温震荡培养摇床;CO2细胞培养箱(德国Heraeus)，超净工作台，倒置显微镜(日本Nikon)，细胞计数器，荧光分光光度计F-4500(日本Hitachi)等.
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1.2 方法 从GenBank下载人iNOS基因全部序列(GenBankaccession，L09210)，设计启动子引物时，在两端分别接上KpnI酶切序列GGTACC，XhoI酶切序列CTCGAG.上游序列为S:5’-GACGGTACCGAAGGAAATGAGTGGACAGTGG-3’(7 086-7 107)，下游序列为AS:5’-GACCTCGAGAACAGTCAAACCAGGAAGAGACC-3’(8 453-8 431). 由上海生工公司合成.
1.2.1 重组质粒的构建筛选与鉴定 模板DNA来自iNOS基因启动子-969G→C多态性GG和GC基因型患者DNA.PCR反应预变性94°C 4 min，主循环变性94°C 50 s，退火41°C 1 min，延伸72°C 1 min 30 s，23循环.最后72 °C延伸5min. 2%琼脂糖(含EB)电泳鉴定片段大小.用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收纯化PCR产物，得到iNOSwt和iNOSmt启动子片段.常规法制备感受态DH5a细菌，转化PGV-B2-E质粒后大量制备质粒.再将PCR获得的启动子片段和PGV-B2-E载体质粒分别用XhoI和Kpn I酶切，回收纯化.最后将不同的启动子片段分别与PGV-B2-E质粒载体片段在T4DNA连接酶的作用下连接，得到构建的含启动子荧光素酶重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt.将重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt分别转化感受态细菌DH5a，阴性对照以TE替代连接产物.阳性对照以PGV-B2-E质粒替代连接产物.挑选中等大小的Amp抗性菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中振摇培养过夜.用质粒小量制备试剂盒抽提质粒，行PCR鉴定及酶切分析鉴定.获得阳性克隆.将iNOS基因启动子PCR扩增产物及选择经酶切和PCR鉴定阳性的重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt，送上海生物工程公司测序分析，以证实构建成功.
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1.2.2 脂质体介导的质粒转染细胞 选择已鉴定的重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt阳性菌落，细菌扩增后大量制备转染质粒，溶于TE50 uL，-20 °C保存.采用脂质体Lipofectin介导的转染技术，将重组质粒转染HepG2细胞，并与b-肌动蛋白驱动b-半乳糖苷酶报道质粒220ng共转染，作为内对照，以控制转染效率.室温下放置30min，以便形成DNA-脂质体复合物.阳性对照组加PGV-B2-E质粒.阴性对照组加PGV-B2质粒. 将转染质粒的细胞培养28h检测. 转染的细胞经3次冻融裂解(-80°C 30 min，室温10min)后，裂解的细胞液转移至离心管，离心.取上清，按荧光素酶检测说明书加样.用荧光分光光度计测定20s内的光输出量.b-半乳糖苷酶的检测按说明书执行，用分光光度计在410nm处测定A值.
统计学处理 所获的数据用均值±标准差表示.荧光素酶活性用裂解细胞提取物中每克蛋白荧光素光亮强度lightu/g 表示. 启动子活性用标准化相对光单位(NRLU)代表.标准化相对光单位/A410=同一细胞提取物测得的平均荧光素酶活性/b-半乳糖苷酶活性.采用Bonferroni方法进行统计处理，P<0.05则有统计学意义.
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2 结果
2.1 PCR扩增目的片段的结果 应用PCR技术扩增iNOS基因启动子的全长达1385 bp，分别获得含iNOS基因野生和突变的启动子目的片段.由于扩增的目的片段较长，在PCR过程中易出现碱基错配，所以采用了高保真TaqDNA聚合酶(Pfu).在实验初期，PCR扩增经历了多次的失败.经查阅文献和回顾设计引物的过程及改进实验程序，终于扩增出所需的目的基因片段(图1).
图1(PDF)iNOS基因启动子PCR扩增结果.M: PCR Marker (237-1 543 bp), 1-4: PCR产物1385 bp.
图2(PDF)重组质粒的酶切PCR鉴定结果.A: PCR Marker (377-1 543 bp); B: 重组质粒PCR;C: 质粒经KpnI 和Xho I双酶切;D: 重组质粒经KpnI单酶切; E空质粒经KpnI单酶切; F:DNA Marker (λDNA/Hind III).
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2.2 重组质粒 将所构建的重组质粒经单酶切(KpnI)、双酶切(KpnI 和XhoI)及质粒PCR扩增产物，用1%的琼脂糖电泳(图2).构建的重组质粒pPGV-iNOS经双酶切后呈现1373 bp 和4 765bp两条片段，单酶切为呈现6138 bp的一条带.空质粒PGB-B2-E单酶切为6391 bp的一条带.B泳道的产物约为1kb，与预计相符;C泳道的短片段于B泳道一致，长片段与E泳道的产物一致，而D泳道的产物稍落后于C和E泳道，说明其长度大于5kb. 结果证实iNOS基因启动子荧光报道重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt构建成功.将测序碱基序列以Blast的基因格式调人GeneBank比较，经Sequencer软件分析，pPGV-iNOSwt和PGV-B2-iNOSmt的送检序列与GenBank查询结果完全一致.说明重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt构建成功.图3为部分测序的结果.
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2.3 启动子功能活性分析 将启动子活性用标准化相对光单位(NRLU)表示.启动子iNOSmt的活性为6.5×104，与对照基因启动子B2-E的活性相比显著升高，升高132.1%，差异有显著性(P<0.05). 启动子iNOSwt的活性为3.2×104，与对照基因启动子B2-E的活性相比升高14.3%，差异无显著性(P>0.05). iNOSmt启动子活性升高的百分率是iNOSwt启动子的9倍.
图3(PDF)部分iNOS基因启动子测序.
3 讨论基因启动子为DNA链上能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA转录的序列，是基因表达不可缺少的重要调控序列.启动子位于结构基因的5’端，只能近距离起作用，有方向性，空间位置恒定，是转录起始的基本信号结构，决定基因的转录效率.因此，当基因启动子DNA链上的碱基发生突变或插入缺失，可影响基因的转录调控功能.研究启动子的功能变化，最常用的方法是构建启动子重组体质粒-瞬时转染分析法.我们成功构建的iNOS基因启动子-969位点多态性的荧光素酶报道基因重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt，用脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2，研究iNOS基因启动子-969G→C多态性的不同基因型启动子的功能活性差异.结果发现启动子iNOSmt的活性比对照基因启动子B2-E的活性显著升高，差异有显著性.启动子iNOSwt的活性比对照基因启动子B2-E的活性稍高，差异无显著性.表明iNOS基因启动子-969G→C的多态性导致该启动子的功能活性增强，GC基因型携带者比GG基因型携带者可能有更强的iNOS表达.
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Jurgen etal [1]在1998年研究儿童严重疟疾患者与iNOS基因启动子-969G→C的多态性的关系中，发现杂合子GC的频率为17%，轻度疟疾患者杂合子GC的频率为30%，认为这种频率的差异与iNOS基因启动子-969G→C的突变后对疟疾产生抵抗有关.他们推测杂合子GC基因型患者可能产生大量的NO，对疟疾具有杀伤作用.本结果初步证实了Jurgenet al的推测，iNOS基因启动子-969G→C的多态性导致该启动子的功能活性增强，产生大量的NO，发挥效应.最近Morris etal [2]报道在iNOS基因启动子-756到-716位点之间有一个AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性与iNOS基因启动子的功能活性有关，他们发现iNOS基因启动子为“+”等位基因时活性比启动子为“-”等位基因的活性高25倍.认为在iNOS基因启动子AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性中，“+”等位基因携带者是iNOS基因高表达，导致2型糖尿病患者出现并发症的原因.本研究的结果与Morris的结果有相似之处，即iNOS基因启动子多态性改变影响其功能活性.为了区分iNOS基因启动子-969G→C多态性中是否存在iNOS基因启动子AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性位点，将构建的iNOS基因启动子-969G→C位点多态性的荧光素酶报道基因重组体质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt测序的结果，输入GenBank进行对比分析，未发现有AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性相同序列.提示iNOS基因启动子的这两个多态性都影响该基因启动子的功能活性.
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4 参考文献1 Jurgen FJ, Morduller KB, Lell B. Polymorphism in promoter region ofinducible nitric oxide synthase gene and protection
against Malaria. Lancet 1998;351:265-266
2 Morris BJ, Markus A, Glenn CL. Association of a functionalinducible nitric oxide synthase promoter variant with
complications in type 2 diabetes. J Mol Med 2002;80:96-104, http://www.100md.com( 程元桥, 林菊生, 王文琦, 廖家智, 姜晓丹, 冯 玮, 熊 平)
