直肠癌旁移行黏膜中Survivin基因表达的意义
苏 琪,吴硕东, 殷红专,韩霞, 陈春生,冯勇, 刘恩卿,中国医科大学第二临床学院普外四科 辽宁省沈阳市 110004
辽宁省自然科学基金资助项目:No. 972255
项目负责人:苏琪, 110004, 辽宁省沈阳市和平区三好街36号,中国医科大学第二临床学院普外四科.suqi100@hotmail.com
电话:024-83955072
收稿日期:2004-05-07 接受日期:2004-06-17
摘要
, http://www.100md.com
目的:探讨凋亡抑制基因survivin在直肠癌旁移行黏膜中的表达情况，为保肛手术的选择提供理论依据.
方法:应用黏液组化方法确定各种组织类型直肠癌旁移行黏膜的分布规律，应用免疫组织化学方法检测凋亡抑制基因survivin在直肠癌旁移行黏膜中的表达情况.
结果:直肠癌旁移行黏膜范围，在黏液癌(平均7.83cm)明显大于乳头状癌及管状腺癌(P<0.01)，在DukesC期(平均5.61cm)明显大于DukesA、B期(P<0.05). 正常黏膜(NM)、移行黏膜(TM)、非典型增生及癌组织中均有survival基因产物表达，由正常直肠黏膜到癌组织表达率逐渐增加，四组间差别有显著意义(P<0.05).
, 百拇医药 结论:在移行黏膜(TM)、非典型增生及癌组织中就存在survivin基因表达上调;在黏液癌及DukesC期直肠癌旁移行黏膜范围明显增宽，提示对低位黏液癌及DukesC期直肠癌保肛手术应慎重.
苏琪,吴硕东,殷红专, 韩霞,陈春生, 冯勇,刘恩卿. 直肠癌旁移行黏膜中Survivin基因表达的意义. 世界华人消化杂志 2004;12(9):2201-2202
0 引言Survivin 是凋亡抑制基因(inhibitorof apoptosis protein，IAP)家族的新成员.近年来，对survivin的分子生物学，凋亡抑制机制及其与肿瘤发展关系的研究已取得一定进展.随着保肛手术逐渐增加，特别是腹腔镜等微创技术在直肠癌中的应用，根治术后2a内局部复发有逐年增加的趋势，其中吻合口复发者占5-15%.所以癌旁移行黏膜(tansitionalmucosa，TM)的研究更加受到重视[1-2].我们率先将凋亡抑制基因survivin应用于直肠癌旁TM的研究，并与正常黏膜及癌组织进行对照如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 2000/2003年手术切除的直肠癌标本 73例，男41例，女32例;年龄53.0±12.3岁.乳头状腺癌32例，管状腺癌23例，黏液腺癌16例，未分化癌2例.Survivin羊抗人多克隆抗体(sc-8806)为SantaCruz公司产品、survivin一抗工作浓度为1:50，SP试剂盒为Zymed公司产品，高铁双胺奥蓝(HID-AB)试剂盒购于上海虹桥医用试剂研究所.
1.2 方法 标本经40g/L的中性甲醛固定后，沿肠管纵向自癌肿向两端每0.5 cm等长取材，近端平均距癌瘤20cm，远端4.5cm，石蜡包埋，制成5mm厚切片.每例切片均作HID-AB黏液染色，免疫组化染色，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照.直肠癌标本均由手术病例证实.临床病理分期按Dukes分期，组织学分类、分期参照全国大肠癌协会统一标准，有两名病理学教授分别阅片.HID-AB黏液染色采用Filipe标准[1]，正常黏膜腺管杯状细胞内出现黑色的硫酸粘蛋白，而TM则腺体中超过50%杯状细胞中出现蓝色唾液酸粘蛋白染色.免疫组化S-P染色:凡染色强度明显高于背景者为阳性表达，将阳性细胞按数量及染色强度分为3级:表达弱阳性(+),即阳性细胞数小于10%;表达强阳性(+++)，即阳性细胞数占60%以上;中强度阳性(++)，即阳性细胞数介于以上二者之间;染色强度与背景一致者为阴性.
, 百拇医药
统计学处理计量资料采用t检验;计数资料采用x2分析.
2 结果
2.1 黏液组化染色结果 73例直肠癌中有70例检出了癌旁移行黏膜，检出率95.8%，癌旁TM分布范围0-12.3(平均3.14)cm, 其中52例(71%)局限在癌旁3cm范围内. 黏液腺癌旁TM分布最广，平均7.83±1.36cm，明显大于乳头状腺癌(1.08±1.36)及管状腺癌(2.13±1.91cm P <0.01). Dukes分期越晚，其相应癌旁TM分布越广，DukesC期(5.61±4.52cm)明显大于DukesA、B期(1.05±0.84和2.70±2.60cm P <0.01，P<0.05).
2.2 免疫组化染色结果 正常黏膜(NM)、移行黏膜(TM)、非典型增生及癌组织中均有survival基因产物表达，由正常直肠黏膜到癌组织表达率逐渐增加，4组间差别有显著意义(P<0.05). 在癌组织及癌旁组织，survival基因产物均位于细胞质，未见细胞核及细胞膜阳性，阳性细胞成弥漫性、局灶性或散在性分布.60例survivin阳性的直肠癌病例中，TM平均范围3.8cm，13例survivin阴性的直肠癌病例中TM平均范围1.2cm，二者间差异有显著意义(P <0.05)(表1).
, http://www.100md.com
表1Survivin基因产物在直肠癌及癌前状态的表达
x2检验x20.05(3)＝10.23 P <0.05.
, 百拇医药
3 讨论Survivin 是凋亡抑制基因(inhibitorof apoptosis protein ,IAP)家族的新成员.Survivin 的结构较为独特，他仅含有单一的BIR功能区，没有指环结构，是一个142个氨基酸的蛋白.Survivin 和EPR-1位于染色体(17q25)的同一基因组，长度范围在75-130kb，他们分别由不同的mRNA(1.9kb和1.3 kb)所编码.Survivin表达于人与鼠的胚胎发育组织，但在正常成人组织很少表达[3-5].研究表明survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子[5].Caspase 是细胞凋亡的核心机制，其级联式激活并溶解蛋白质，决定了凋亡形态的变化[7].Survivin直接作用于Caspase,主要抑制Caspase-3，Caspase-7的活性，阻断细胞的凋亡过程.另外survivin也可以通过p21间接抑制Caspase，其机制是survivin与细胞周期调控因子CDK4形成survivin-CDK4复合体，使得p21从CDK4的复合体中释放出来，p21进一步与线粒体Caspase3结和，抑制其活性，阻止细胞凋亡[3-5].
, http://www.100md.com
近几年来，对survivin的分子生物学，凋亡抑制机制及其与肿瘤发展，血管形成，细胞周期关系的研究正引起国外学者的广泛关注.但目前尚未见到将其用于癌旁移行黏膜的研究.我们应用黏液组织化学方法观察了直肠癌旁TM的分布情况.应用免疫组织化学的方法研究人原发性直肠癌旁TM中survivin基因产物的表达，此方法具有简便、快速等特点且能够观察survivin基因产物在良恶性细胞中的定位.结果显示在癌旁正常黏膜survivin基因产物阳性表达最低(9.38%)，在移行黏膜、非典型增生、癌组织(79.45%)逐渐增高，4组间差异有显著意义(P<0.05). 提示该基因对直肠癌的发生发展起重要作用，survivin基因有望成为直肠癌基因治疗的新靶点.
在survivin基因产物表达阳性的直肠癌病例中，TM范围大于survivin阴性的病例(P <0.05)，表明survivin基因的增加可能是导致癌旁移行性变化的因素之一.在直肠癌的发生过程中，从TM开始就有survivin基因产物的表达上凋，表明survivin基因增加与直肠癌的发生有关，可作为判断肿瘤发生可能性的有用标志物，并提示TM具有一定的恶性潜能.为此，在直肠癌微创及保肛门手术时，应该彻底切除癌旁TM,以减少局部复发率，提高生活质量.直肠癌survivin基因产物表达上调与TM的范围之间存在一定相关性，其具体机制有待分子生物学深入研究.
, 百拇医药
4 参考文献1 苏琪, 王宇令,刘恩卿, 陈春生,冯勇, 王伟,李冠群, 彭春辉.直肠癌旁移行粘膜变化规律及其临床意义.中国肛肠病杂志
2000;20:3-5
2 谢正勇, 卿三华.国人青年结直肠癌解剖部位分布及临床病理特点.世界华人消化杂志 2003;11:1511-1514
3 Ambrosini G, Adida C, Sirugo G, Altieri DC. Induction of apoptosisand inhibition of cell proliferation by survivin gene
targeting. J Biol Chen 1998;273:11177-11182
, http://www.100md.com
4 Adida C, Crotty PL, Mograth J, Berrebi D, Diebold J, Altieri DC.Developmentally regulated expression of the novel cancer
anti-apoptosis gene survivin in human andmouse differentiation. Am J Pathol 1998;152:43-49
5 Suzuki A, Ito T, Kawano H, Hayashida M, Hayasaki Y, Tsutomi Y,Akahane K, Nakano T, Miura M, Shiraki K. Survivin
initiates procaspase 3/P21 complexformation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediatedcell
death. Ncogene 2000;19:1346-1353, 百拇医药( 苏 琪, 吴硕东, 殷红专, 韩 霞, 陈春生, 冯 勇, 刘恩卿)
辽宁省自然科学基金资助项目:No. 972255
项目负责人:苏琪, 110004, 辽宁省沈阳市和平区三好街36号,中国医科大学第二临床学院普外四科.suqi100@hotmail.com
电话:024-83955072
收稿日期:2004-05-07 接受日期:2004-06-17
摘要
, http://www.100md.com
目的:探讨凋亡抑制基因survivin在直肠癌旁移行黏膜中的表达情况，为保肛手术的选择提供理论依据.
方法:应用黏液组化方法确定各种组织类型直肠癌旁移行黏膜的分布规律，应用免疫组织化学方法检测凋亡抑制基因survivin在直肠癌旁移行黏膜中的表达情况.
结果:直肠癌旁移行黏膜范围，在黏液癌(平均7.83cm)明显大于乳头状癌及管状腺癌(P<0.01)，在DukesC期(平均5.61cm)明显大于DukesA、B期(P<0.05). 正常黏膜(NM)、移行黏膜(TM)、非典型增生及癌组织中均有survival基因产物表达，由正常直肠黏膜到癌组织表达率逐渐增加，四组间差别有显著意义(P<0.05).
, 百拇医药 结论:在移行黏膜(TM)、非典型增生及癌组织中就存在survivin基因表达上调;在黏液癌及DukesC期直肠癌旁移行黏膜范围明显增宽，提示对低位黏液癌及DukesC期直肠癌保肛手术应慎重.
苏琪,吴硕东,殷红专, 韩霞,陈春生, 冯勇,刘恩卿. 直肠癌旁移行黏膜中Survivin基因表达的意义. 世界华人消化杂志 2004;12(9):2201-2202
0 引言Survivin 是凋亡抑制基因(inhibitorof apoptosis protein，IAP)家族的新成员.近年来，对survivin的分子生物学，凋亡抑制机制及其与肿瘤发展关系的研究已取得一定进展.随着保肛手术逐渐增加，特别是腹腔镜等微创技术在直肠癌中的应用，根治术后2a内局部复发有逐年增加的趋势，其中吻合口复发者占5-15%.所以癌旁移行黏膜(tansitionalmucosa，TM)的研究更加受到重视[1-2].我们率先将凋亡抑制基因survivin应用于直肠癌旁TM的研究，并与正常黏膜及癌组织进行对照如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 2000/2003年手术切除的直肠癌标本 73例，男41例，女32例;年龄53.0±12.3岁.乳头状腺癌32例，管状腺癌23例，黏液腺癌16例，未分化癌2例.Survivin羊抗人多克隆抗体(sc-8806)为SantaCruz公司产品、survivin一抗工作浓度为1:50，SP试剂盒为Zymed公司产品，高铁双胺奥蓝(HID-AB)试剂盒购于上海虹桥医用试剂研究所.
1.2 方法 标本经40g/L的中性甲醛固定后，沿肠管纵向自癌肿向两端每0.5 cm等长取材，近端平均距癌瘤20cm，远端4.5cm，石蜡包埋，制成5mm厚切片.每例切片均作HID-AB黏液染色，免疫组化染色，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照.直肠癌标本均由手术病例证实.临床病理分期按Dukes分期，组织学分类、分期参照全国大肠癌协会统一标准，有两名病理学教授分别阅片.HID-AB黏液染色采用Filipe标准[1]，正常黏膜腺管杯状细胞内出现黑色的硫酸粘蛋白，而TM则腺体中超过50%杯状细胞中出现蓝色唾液酸粘蛋白染色.免疫组化S-P染色:凡染色强度明显高于背景者为阳性表达，将阳性细胞按数量及染色强度分为3级:表达弱阳性(+),即阳性细胞数小于10%;表达强阳性(+++)，即阳性细胞数占60%以上;中强度阳性(++)，即阳性细胞数介于以上二者之间;染色强度与背景一致者为阴性.
, 百拇医药
统计学处理计量资料采用t检验;计数资料采用x2分析.
2 结果
2.1 黏液组化染色结果 73例直肠癌中有70例检出了癌旁移行黏膜，检出率95.8%，癌旁TM分布范围0-12.3(平均3.14)cm, 其中52例(71%)局限在癌旁3cm范围内. 黏液腺癌旁TM分布最广，平均7.83±1.36cm，明显大于乳头状腺癌(1.08±1.36)及管状腺癌(2.13±1.91cm P <0.01). Dukes分期越晚，其相应癌旁TM分布越广，DukesC期(5.61±4.52cm)明显大于DukesA、B期(1.05±0.84和2.70±2.60cm P <0.01，P<0.05).
2.2 免疫组化染色结果 正常黏膜(NM)、移行黏膜(TM)、非典型增生及癌组织中均有survival基因产物表达，由正常直肠黏膜到癌组织表达率逐渐增加，4组间差别有显著意义(P<0.05). 在癌组织及癌旁组织，survival基因产物均位于细胞质，未见细胞核及细胞膜阳性，阳性细胞成弥漫性、局灶性或散在性分布.60例survivin阳性的直肠癌病例中，TM平均范围3.8cm，13例survivin阴性的直肠癌病例中TM平均范围1.2cm，二者间差异有显著意义(P <0.05)(表1).
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表1Survivin基因产物在直肠癌及癌前状态的表达
| 上皮类型 | n | 阴性 | 弱阳性 | 阳性 | 强阳性 | 阳性率% |
| 正常粘膜 | 32 | 29 | 2 | 1 | 0 | 9.38 |
| 移行粘膜 | 70 | 47 | 12 | 8 | 3 | 32.86 |
| 非典增生 | 21 | 12 | 4 | 3 | 2 | 42.86 |
| 癌 | 73 | 15 | 20 | 18 | 20 | 79.45 |
x2检验x20.05(3)＝10.23 P <0.05.
, 百拇医药
3 讨论Survivin 是凋亡抑制基因(inhibitorof apoptosis protein ,IAP)家族的新成员.Survivin 的结构较为独特，他仅含有单一的BIR功能区，没有指环结构，是一个142个氨基酸的蛋白.Survivin 和EPR-1位于染色体(17q25)的同一基因组，长度范围在75-130kb，他们分别由不同的mRNA(1.9kb和1.3 kb)所编码.Survivin表达于人与鼠的胚胎发育组织，但在正常成人组织很少表达[3-5].研究表明survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子[5].Caspase 是细胞凋亡的核心机制，其级联式激活并溶解蛋白质，决定了凋亡形态的变化[7].Survivin直接作用于Caspase,主要抑制Caspase-3，Caspase-7的活性，阻断细胞的凋亡过程.另外survivin也可以通过p21间接抑制Caspase，其机制是survivin与细胞周期调控因子CDK4形成survivin-CDK4复合体，使得p21从CDK4的复合体中释放出来，p21进一步与线粒体Caspase3结和，抑制其活性，阻止细胞凋亡[3-5].
, http://www.100md.com
近几年来，对survivin的分子生物学，凋亡抑制机制及其与肿瘤发展，血管形成，细胞周期关系的研究正引起国外学者的广泛关注.但目前尚未见到将其用于癌旁移行黏膜的研究.我们应用黏液组织化学方法观察了直肠癌旁TM的分布情况.应用免疫组织化学的方法研究人原发性直肠癌旁TM中survivin基因产物的表达，此方法具有简便、快速等特点且能够观察survivin基因产物在良恶性细胞中的定位.结果显示在癌旁正常黏膜survivin基因产物阳性表达最低(9.38%)，在移行黏膜、非典型增生、癌组织(79.45%)逐渐增高，4组间差异有显著意义(P<0.05). 提示该基因对直肠癌的发生发展起重要作用，survivin基因有望成为直肠癌基因治疗的新靶点.
在survivin基因产物表达阳性的直肠癌病例中，TM范围大于survivin阴性的病例(P <0.05)，表明survivin基因的增加可能是导致癌旁移行性变化的因素之一.在直肠癌的发生过程中，从TM开始就有survivin基因产物的表达上凋，表明survivin基因增加与直肠癌的发生有关，可作为判断肿瘤发生可能性的有用标志物，并提示TM具有一定的恶性潜能.为此，在直肠癌微创及保肛门手术时，应该彻底切除癌旁TM,以减少局部复发率，提高生活质量.直肠癌survivin基因产物表达上调与TM的范围之间存在一定相关性，其具体机制有待分子生物学深入研究.
, 百拇医药
4 参考文献1 苏琪, 王宇令,刘恩卿, 陈春生,冯勇, 王伟,李冠群, 彭春辉.直肠癌旁移行粘膜变化规律及其临床意义.中国肛肠病杂志
2000;20:3-5
2 谢正勇, 卿三华.国人青年结直肠癌解剖部位分布及临床病理特点.世界华人消化杂志 2003;11:1511-1514
3 Ambrosini G, Adida C, Sirugo G, Altieri DC. Induction of apoptosisand inhibition of cell proliferation by survivin gene
targeting. J Biol Chen 1998;273:11177-11182
, http://www.100md.com
4 Adida C, Crotty PL, Mograth J, Berrebi D, Diebold J, Altieri DC.Developmentally regulated expression of the novel cancer
anti-apoptosis gene survivin in human andmouse differentiation. Am J Pathol 1998;152:43-49
5 Suzuki A, Ito T, Kawano H, Hayashida M, Hayasaki Y, Tsutomi Y,Akahane K, Nakano T, Miura M, Shiraki K. Survivin
initiates procaspase 3/P21 complexformation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediatedcell
death. Ncogene 2000;19:1346-1353, 百拇医药( 苏 琪, 吴硕东, 殷红专, 韩 霞, 陈春生, 冯 勇, 刘恩卿)
