新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶的变化
芦惠,王丽杰,中国医科大学附属第二医院儿科 辽宁省沈阳市 110004
项目负责人:芦惠, 110004, 沈阳市和平区三好街36号,中国医科大学附属第二医院儿科. luhui66999@sina.com
电话:024-23930619 传真:024-83955509
收稿日期:2004-07-20 接受日期:2004-09-04
摘要
目的:探讨新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶(XO)的变化.
, 百拇医药
方法:新生大鼠随机分为对照组8只，实验组每一时相点各8只.将E coli O55:B5脂多糖5mg/kg 注入新生鼠胃内，分别于灌胃后3，6，12，24，72h处死动物. 取部分肝组织固定，包埋，HE染色，光镜下观察其组织学改变.其余肝组织用于测定XO活性.
结果:实验组6，12h XO活性明显高于对照组(分别为4719±793 nkat/g vs 3 961±387 nkat/g，4929±477 nkat/g vs 3 961±387 nkat/g，P<0.05); 3，24，72h XO活性与对照组无显著差异(P<0.05). 内毒素治疗后随着时间的进行逐渐出现中央静脉扩张，肝窦充血、炎性细胞浸润，肝细胞水肿，胞质疏松，空泡变性.6，12 h可见大量肝细胞内出血，肝细胞坏死.24，72 h肝细胞水肿渐消失，出血坏死不明显.
, 百拇医药
结论:新生鼠肠损伤时可致肝脏受累，且XO活性愈高，肝损伤愈重.
芦惠,王丽杰. 新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶的变化.世界华人消化杂志 2004;12(10):2486-2487
0 引言
坏死性小肠结肠炎(necrotizingenterocolitis，NEC)是新生儿期最常见的胃肠道疾病，可导致多器官功能衰竭[1].肝脏是人体重要的免疫器官，在肠屏障功能受损时，作为第一道防线，一定程度上能抑制肠源性感染扩散，但其本身炎性细胞也可被激活，在倍增全身炎症反应的同时自身亦受到损伤[2].我们通过内毒素(lipopolysaccharide，LPS)建立新生鼠肠损伤模型，探讨肝脏黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，XO)的变化及意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 健康1日龄Wistar新生大鼠，平均体质量6.3±0.9g，由中国医科大学第二临床学院动物部提供.随机分为对照组8只，实验组每一时相点(3，6，12，24，72h)各8只.将1.9F硅胶管(B-DInc，Sandy，UT，USA)经口插入胃内，Ecoli O55: B5脂多糖(LPS;SigmaChemical CO.，St.Louis，Mo)5 mg/kg用无菌生理盐水稀释至0.2mL注入胃内; 对照组则注入无菌生理盐水0.2mL[3]. 灌胃后各组均放回母鼠旁，继续哺乳，直至实验结束.动物处死后，分离肝脏.取肝组织于40g/L多聚甲醛中固定，常规脱水，包埋切片，行HE染色，光镜下观察其组织学变化.其余肝组织于-80°C超低温冰箱中保存，以备检测.
1.2 方法 肝组织XO活性测定，按测定试剂盒要求，应用紫外/可见分光光度计(法国500-P型)，测定肝组织匀浆XO活性.同时按考马斯亮兰蛋白测定试剂盒说明测定每一样本的蛋白浓度.试剂盒均购自南京建成生物工程研究所.
, 百拇医药
统计学处理 经SPSS11.5 For Windows数据分析软件处理.所有数据以mean±SD表示，组间比较采用配对t检验.统计结果显著性以P<0.05表示.
2 结果
2.1 肝组织XO活性变化 实验组6，12h肝组织XO活性(4719±793 nkat/g，4929±477 nkat/g)均明显高于对照组(3961±387 nkat/g，P<0.05)，高峰在12h; 24 h (4 481±473 nkat/g) XO活性下降，3(4268±455 nkat/g)，24，72h (3 994±605 nkat/g)肝组织XO活性与对照组无显著差异(P>0.05).
2.2 肝组织形态学改变 对照组新生鼠肝小叶分界不清，肝板排列较成年大鼠差，胞质嗜碱性，门管区不清楚，但中央静脉清晰可见.内毒素治疗后随着时间的进行，逐渐出现中央静脉扩张，肝窦充血、炎性细胞浸润，肝细胞水肿，胞质疏松，空泡变性.6，12 h时可见大量肝细胞内出血，肝细胞坏死.24，72 h时肝细胞水肿渐消失，出血坏死不明显.
, 百拇医药
3 讨论NEC多见于新生儿.早产、缺氧/缺血、肠道喂养和细菌增生是导致此病的主要危险因素[1,3-5].临床统计，80%以上的NEC患儿是早产儿或低出生体质量儿，其发病率与胎龄呈负相关[6-8]，原因是早产儿肠道免疫功能不成熟.胃肠道免疫功能分为非特异性(先天性)和特异性两部分，前者包括胃酸、蛋白水解酶、粘蛋白及通透性等[9].生理功能完整的肠黏膜对细菌和内毒素构成屏障作用;在感染和创伤等应激状况下，肠屏障受损，大量细菌和毒素经门静脉和肠系膜淋巴系统进入体循环，导致肠源性内毒素血症和细菌移位，并可引发炎症连锁反应，引起全身炎症反应综合征，最终致多器官功能衰竭(MOF)[2].因此有人称肠道为“创伤后多器官功能衰竭的源泉”.NEC亦可导致多器官功能衰竭.
新生鼠非特异性免疫功能缺陷[3]，我们发现，在肠道给予LPS后肝组织渐出现中央静脉扩张，肝窦充血、炎性细胞浸润，肝细胞水肿，胞质疏松，肝细胞出血、坏死等自身受损的表现.LPS可增加肠黏膜通透性、改变肠动力、降低肠防御机能、损害肠上皮细胞紧密连接从而促进肠道细菌移位.而肝脏是人体的主要代谢器官，也是重要的免疫器官.生理条件下，肝肠形成肠肝轴(enterohepaticaxis)，发挥多种生理功能.在肠屏障功能受损时，LPS进入循环系统，则肝脏炎性细胞可被源自肠道的细菌和毒素激活，出现肝细胞坏死[3,10].
, 百拇医药
活性氧(reactiveoxygen species，ROS)是造成肝损伤的重要因素.黄嘌呤脱氢酶/黄嘌呤氧化酶(xanthinedehydrogenase/ xanthine oxidase，XD/XO)系统是肝脏ROS的主要来源[11].XD是XO的前体，二者既独立存在又可相互转化.XD和XO均可催化次黄嘌呤向黄嘌呤及黄嘌呤向尿酸的转化.不同的是XD需NAD+作为电子受体，产生稳定的活性产物NADPH;而XO则以分子氧为电子受体，产生高活性超氧阴离子(O.2-)和过氧化氢(H2O2).正常情况下，XD占酶活性的90%，仅10%以XO形式存在.主要参与核酸的分解代谢;促进肠道对铁的吸收和转运;而且，当细菌或毒素侵袭导致毛细血管内皮轻微受损时，XD从血管内皮细胞释出，在有氧环境中转变为XO，在催化底物过程中产生O2-，对机体具有防御功能[12-13].但在缺血/再灌注或感染时，细胞内ATP分解过度，ATP不足使钙泵活性下降，细胞内Ca2+浓度升高，激活钙依赖蛋白酶，促使XD向XO转化，XO活性显著增加，ROS代谢产物亦增加.介导脂质过氧化反应，使膜受体、蛋白酶和离子通道的微环境发生改变，导致细胞功能障碍，甚至死亡[10-12].我们发现，经LPS治疗后，肝组织XO活性愈高，肝损伤愈重.72 h时XO活性降低，肝细胞水肿消失，出血坏死不明显.提示临床如能应用XO抑制剂有效减少活性氧的产生，对于新生儿NEC的整体治疗可能具有一定意义.
, 百拇医药
4 参考文献1 Jilling T, Lu J, Jackson M, Caplan MS. Intestinal epithelialapoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat
model of neonatal necrotizing enterocolitis.Pediatr Res 2004;55:622-629
2 Fink MP. Intestinal epithelial hyperpermeability: update on thepathogenesis of gut mucosal barrier dysfunction in critical
illness. Curr Opin Crit Care 2003;9:143-151
, 百拇医药
3 Chan KL, Ho JC, Chan KW, Tam PK. A study of gut immunity to enteralendotoxin in rats of different ages: a possible
cause for necrotizing enterocolitis. JPediatr Surg 2002;37:1435-1440
4 Kafetzis DA, Skevaki C, Costalos C. Neonatal necrotizingenterocolitis: an overview. Curr Opin Infect Dis
2003;16:349-355
5 Hsueh W, Caplan MS, Qu XW, Tan XD, De Plaen IG, Gonzalez-Crussi F.Neonatal necrotizing enterocolitis: clinical
, 百拇医药
considerations and pathogenetic concepts.Pediatr Dev Pathol 2003;6:6-23
6 Buch NA, Ahmad SM, Ali SW, Hassan HM. An epidemiological study ofneonatal necrotizing enterocolitis. Saudi Med J
2001;22:231-237
7 Lee JS, Polin RA. Treatment and prevention of necrotizingenterocolitis. Semin Neonatol 2003;8:449-459
8 Foster J, Cole M. Oral immunoglobulin for preventing necrotizingenterocolitis in preterm and low birth-weight neonates.
, http://www.100md.com
Cochrane Database Syst Rev 2004;1:CD001816
9 Baumgart DC. Dignass AU. Intestinal barrier function. Curr OpinClin Nutr Metab Care 2002;5:685-694
10 Mathurin P, Deng QG, Keshavarzian A, Choudhary S, Holmes EW,Tsukamoto H. Exacerbation of alcoholic liver injury by
enteral endotoxin in rats. Hepatology 2000;32:1008-1017
11 Kono H, Rusyn I, Bradford BU, Connor HD, Mason RP, Thurman RG.Allopurinol prevents early alcohol-induced liver injury
, 百拇医药
in rats. J Pharmacol Exp Ther 2000;293:296-303
12 Meneshian A, Bulkley GB. The physiology of endothelial xanthineoxidase: from urate catabolism to reperfusion injury to
inflammatory signal transduction.Microcirculation 2002;9:161-175
13 Millar TM. Peroxynitrite formation from the simultaneous reductionof nitrite and oxygen by xanthine oxidase. FEBS Lett
2004;562:129-133, 百拇医药( 芦 惠, 王丽杰)
项目负责人:芦惠, 110004, 沈阳市和平区三好街36号,中国医科大学附属第二医院儿科. luhui66999@sina.com
电话:024-23930619 传真:024-83955509
收稿日期:2004-07-20 接受日期:2004-09-04
摘要
目的:探讨新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶(XO)的变化.
, 百拇医药
方法:新生大鼠随机分为对照组8只，实验组每一时相点各8只.将E coli O55:B5脂多糖5mg/kg 注入新生鼠胃内，分别于灌胃后3，6，12，24，72h处死动物. 取部分肝组织固定，包埋，HE染色，光镜下观察其组织学改变.其余肝组织用于测定XO活性.
结果:实验组6，12h XO活性明显高于对照组(分别为4719±793 nkat/g vs 3 961±387 nkat/g，4929±477 nkat/g vs 3 961±387 nkat/g，P<0.05); 3，24，72h XO活性与对照组无显著差异(P<0.05). 内毒素治疗后随着时间的进行逐渐出现中央静脉扩张，肝窦充血、炎性细胞浸润，肝细胞水肿，胞质疏松，空泡变性.6，12 h可见大量肝细胞内出血，肝细胞坏死.24，72 h肝细胞水肿渐消失，出血坏死不明显.
, 百拇医药
结论:新生鼠肠损伤时可致肝脏受累，且XO活性愈高，肝损伤愈重.
芦惠,王丽杰. 新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶的变化.世界华人消化杂志 2004;12(10):2486-2487
0 引言
坏死性小肠结肠炎(necrotizingenterocolitis，NEC)是新生儿期最常见的胃肠道疾病，可导致多器官功能衰竭[1].肝脏是人体重要的免疫器官，在肠屏障功能受损时，作为第一道防线，一定程度上能抑制肠源性感染扩散，但其本身炎性细胞也可被激活，在倍增全身炎症反应的同时自身亦受到损伤[2].我们通过内毒素(lipopolysaccharide，LPS)建立新生鼠肠损伤模型，探讨肝脏黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，XO)的变化及意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 健康1日龄Wistar新生大鼠，平均体质量6.3±0.9g，由中国医科大学第二临床学院动物部提供.随机分为对照组8只，实验组每一时相点(3，6，12，24，72h)各8只.将1.9F硅胶管(B-DInc，Sandy，UT，USA)经口插入胃内，Ecoli O55: B5脂多糖(LPS;SigmaChemical CO.，St.Louis，Mo)5 mg/kg用无菌生理盐水稀释至0.2mL注入胃内; 对照组则注入无菌生理盐水0.2mL[3]. 灌胃后各组均放回母鼠旁，继续哺乳，直至实验结束.动物处死后，分离肝脏.取肝组织于40g/L多聚甲醛中固定，常规脱水，包埋切片，行HE染色，光镜下观察其组织学变化.其余肝组织于-80°C超低温冰箱中保存，以备检测.
1.2 方法 肝组织XO活性测定，按测定试剂盒要求，应用紫外/可见分光光度计(法国500-P型)，测定肝组织匀浆XO活性.同时按考马斯亮兰蛋白测定试剂盒说明测定每一样本的蛋白浓度.试剂盒均购自南京建成生物工程研究所.
, 百拇医药
统计学处理 经SPSS11.5 For Windows数据分析软件处理.所有数据以mean±SD表示，组间比较采用配对t检验.统计结果显著性以P<0.05表示.
2 结果
2.1 肝组织XO活性变化 实验组6，12h肝组织XO活性(4719±793 nkat/g，4929±477 nkat/g)均明显高于对照组(3961±387 nkat/g，P<0.05)，高峰在12h; 24 h (4 481±473 nkat/g) XO活性下降，3(4268±455 nkat/g)，24，72h (3 994±605 nkat/g)肝组织XO活性与对照组无显著差异(P>0.05).
2.2 肝组织形态学改变 对照组新生鼠肝小叶分界不清，肝板排列较成年大鼠差，胞质嗜碱性，门管区不清楚，但中央静脉清晰可见.内毒素治疗后随着时间的进行，逐渐出现中央静脉扩张，肝窦充血、炎性细胞浸润，肝细胞水肿，胞质疏松，空泡变性.6，12 h时可见大量肝细胞内出血，肝细胞坏死.24，72 h时肝细胞水肿渐消失，出血坏死不明显.
, 百拇医药
3 讨论NEC多见于新生儿.早产、缺氧/缺血、肠道喂养和细菌增生是导致此病的主要危险因素[1,3-5].临床统计，80%以上的NEC患儿是早产儿或低出生体质量儿，其发病率与胎龄呈负相关[6-8]，原因是早产儿肠道免疫功能不成熟.胃肠道免疫功能分为非特异性(先天性)和特异性两部分，前者包括胃酸、蛋白水解酶、粘蛋白及通透性等[9].生理功能完整的肠黏膜对细菌和内毒素构成屏障作用;在感染和创伤等应激状况下，肠屏障受损，大量细菌和毒素经门静脉和肠系膜淋巴系统进入体循环，导致肠源性内毒素血症和细菌移位，并可引发炎症连锁反应，引起全身炎症反应综合征，最终致多器官功能衰竭(MOF)[2].因此有人称肠道为“创伤后多器官功能衰竭的源泉”.NEC亦可导致多器官功能衰竭.
新生鼠非特异性免疫功能缺陷[3]，我们发现，在肠道给予LPS后肝组织渐出现中央静脉扩张，肝窦充血、炎性细胞浸润，肝细胞水肿，胞质疏松，肝细胞出血、坏死等自身受损的表现.LPS可增加肠黏膜通透性、改变肠动力、降低肠防御机能、损害肠上皮细胞紧密连接从而促进肠道细菌移位.而肝脏是人体的主要代谢器官，也是重要的免疫器官.生理条件下，肝肠形成肠肝轴(enterohepaticaxis)，发挥多种生理功能.在肠屏障功能受损时，LPS进入循环系统，则肝脏炎性细胞可被源自肠道的细菌和毒素激活，出现肝细胞坏死[3,10].
, 百拇医药
活性氧(reactiveoxygen species，ROS)是造成肝损伤的重要因素.黄嘌呤脱氢酶/黄嘌呤氧化酶(xanthinedehydrogenase/ xanthine oxidase，XD/XO)系统是肝脏ROS的主要来源[11].XD是XO的前体，二者既独立存在又可相互转化.XD和XO均可催化次黄嘌呤向黄嘌呤及黄嘌呤向尿酸的转化.不同的是XD需NAD+作为电子受体，产生稳定的活性产物NADPH;而XO则以分子氧为电子受体，产生高活性超氧阴离子(O.2-)和过氧化氢(H2O2).正常情况下，XD占酶活性的90%，仅10%以XO形式存在.主要参与核酸的分解代谢;促进肠道对铁的吸收和转运;而且，当细菌或毒素侵袭导致毛细血管内皮轻微受损时，XD从血管内皮细胞释出，在有氧环境中转变为XO，在催化底物过程中产生O2-，对机体具有防御功能[12-13].但在缺血/再灌注或感染时，细胞内ATP分解过度，ATP不足使钙泵活性下降，细胞内Ca2+浓度升高，激活钙依赖蛋白酶，促使XD向XO转化，XO活性显著增加，ROS代谢产物亦增加.介导脂质过氧化反应，使膜受体、蛋白酶和离子通道的微环境发生改变，导致细胞功能障碍，甚至死亡[10-12].我们发现，经LPS治疗后，肝组织XO活性愈高，肝损伤愈重.72 h时XO活性降低，肝细胞水肿消失，出血坏死不明显.提示临床如能应用XO抑制剂有效减少活性氧的产生，对于新生儿NEC的整体治疗可能具有一定意义.
, 百拇医药
4 参考文献1 Jilling T, Lu J, Jackson M, Caplan MS. Intestinal epithelialapoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat
model of neonatal necrotizing enterocolitis.Pediatr Res 2004;55:622-629
2 Fink MP. Intestinal epithelial hyperpermeability: update on thepathogenesis of gut mucosal barrier dysfunction in critical
illness. Curr Opin Crit Care 2003;9:143-151
, 百拇医药
3 Chan KL, Ho JC, Chan KW, Tam PK. A study of gut immunity to enteralendotoxin in rats of different ages: a possible
cause for necrotizing enterocolitis. JPediatr Surg 2002;37:1435-1440
4 Kafetzis DA, Skevaki C, Costalos C. Neonatal necrotizingenterocolitis: an overview. Curr Opin Infect Dis
2003;16:349-355
5 Hsueh W, Caplan MS, Qu XW, Tan XD, De Plaen IG, Gonzalez-Crussi F.Neonatal necrotizing enterocolitis: clinical
, 百拇医药
considerations and pathogenetic concepts.Pediatr Dev Pathol 2003;6:6-23
6 Buch NA, Ahmad SM, Ali SW, Hassan HM. An epidemiological study ofneonatal necrotizing enterocolitis. Saudi Med J
2001;22:231-237
7 Lee JS, Polin RA. Treatment and prevention of necrotizingenterocolitis. Semin Neonatol 2003;8:449-459
8 Foster J, Cole M. Oral immunoglobulin for preventing necrotizingenterocolitis in preterm and low birth-weight neonates.
, http://www.100md.com
Cochrane Database Syst Rev 2004;1:CD001816
9 Baumgart DC. Dignass AU. Intestinal barrier function. Curr OpinClin Nutr Metab Care 2002;5:685-694
10 Mathurin P, Deng QG, Keshavarzian A, Choudhary S, Holmes EW,Tsukamoto H. Exacerbation of alcoholic liver injury by
enteral endotoxin in rats. Hepatology 2000;32:1008-1017
11 Kono H, Rusyn I, Bradford BU, Connor HD, Mason RP, Thurman RG.Allopurinol prevents early alcohol-induced liver injury
, 百拇医药
in rats. J Pharmacol Exp Ther 2000;293:296-303
12 Meneshian A, Bulkley GB. The physiology of endothelial xanthineoxidase: from urate catabolism to reperfusion injury to
inflammatory signal transduction.Microcirculation 2002;9:161-175
13 Millar TM. Peroxynitrite formation from the simultaneous reductionof nitrite and oxygen by xanthine oxidase. FEBS Lett
2004;562:129-133, 百拇医药( 芦 惠, 王丽杰)
