野生型P53基因对肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响
曲波,吕志武, 关景明,哈尔滨医科大学附属二院消化内科 黑龙江省哈尔滨市 150086
潘海乐,哈尔滨医科大学附属二院骨科 黑龙江省哈尔滨市 150086
项目负责人:曲波, 150086, 黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路157号,哈尔滨医科大学附属二院消化内科.
收稿日期:2004-04-15 接受日期:2004-05-24
摘要
目的:观察野生型p53基因对昆明鼠肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响，探讨p53基因的抑瘤机制.
, http://www.100md.com
方法:♂5周龄昆明鼠30只，随机分类肝癌组(I)和p53基因治疗组(II).每只鼠于后肢股部皮下接种Hep-A-22肝癌细胞悬液0.2mL，建立动物模型.接种后24 h，II组实验动物于荷瘤局部皮下注射介导野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒液0.2mL，14 d后处死实验动物.PCR-ELISA定量检测肝癌组织端粒酶活性，免疫组化观察肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达情况.
结果:腺病毒介导的野生型p53基因能够显著抱制肝癌的生长(肿瘤直径23.32±1.45cm vs 5.13±0.37 cm，P<0.001)，明显降低端粒酶的活性表达(A值2.46±0.35vs 0.78±0. 06，P<0.01)，下调Bcl-2基因蛋白的生成(表达阳性率67.8%vs 25.9%，P<0.05).
结论:野生型p53基因从抑制肝瘤细胞增生，促进肿瘤细胞凋亡两个方面发挥抑癌功能.
, 百拇医药
曲波, 潘海乐,吕志武, 关景明.野生型P53基因对肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响.世界华人消化杂志 2004;12(10):2461-2463
0 引言肿瘤细胞的无限增生与细胞端粒酶激活有关，是正常细胞转变为恶性细胞的初始信号，是恶性肿瘤发生发展的重要机制.p53是研究最为广泛和深入的肿瘤抑制基因之一，他在多种肿瘤中的高突变率是人们认识到其用于肿瘤基因治疗的潜在价值.
1 材料和方法
1.1 材料 含野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒，由尹新华博士惠赠.病毒滴度为8.2×1013 pfu/L. TRAP-PCR-ELISA端粒酶检测试剂盒和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，购自宝灵曼公司.Bcl-2mAb购自博士公司.鼠Hep-A-22肝癌细胞株，由黑龙江省肿瘤研究所提供.昆明鼠，♂，体质量28-30g，购自黑龙江省肿瘤研究所.
, http://www.100md.com
1.2 方法 复苏Hep-A-22肝癌细胞株，接种到小鼠腹腔中，2wk后取腹水，离心，用RPMI1640营养液调细胞密度为1×1010/mL，每只鼠于后肢股部皮下接种0.2mL细胞悬液，7d后长出实体瘤.小鼠随机分为2组，肝癌组(I)和p53基因治疗组(II)，每组15只.带p53基因的腺病毒液于接种Hep-A-22肝癌细胞株后24h注入，每只鼠0.2mL，14 d后，测量肿瘤大小.
统计学分析 所有数据均用mean±SD表示，以t检验计算组间差异，P<0.05表示显著差异.
2结果Hep-A-22细胞转染带p53的重组腺病毒后在小鼠体内成瘤性降低，到14d时，接种带野生型p53基因小鼠，与单纯接种肿瘤细胞的鼠作比较，肿瘤明显变小.注射p53基因后，治疗组端粒酶活性明显低于肝癌组(A:2.46±0.35 vs 0.78±0.06, P<0.01)，差异有显著性(图1).II组肝癌组织中可见较多的核呈棕褐色的凋亡细胞，I组则偶见凋亡细胞(图2).I组中凋亡指数(%)显著低于II组，两组差异极为明显(3.2±0.8vs15.6±3.6，P<0.01)说明在外源野生型p53注射后，促进了肝癌细胞凋亡的发生.Bcl-2蛋白是膜蛋白，经免疫组化染色后，在细胞胞质可见到棕褐色颗粒.转染带p53腺病毒的肝癌组织，Bcl-2蛋白表达较单纯肝癌组织明显减少(图3).
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图1 昆明鼠肿瘤大题照片.A: 肝癌组肿瘤明显形成;B: 治疗组肿瘤体积明显缩小.
图2 肿瘤细胞凋亡×40.A: 肝癌组偶见凋亡细胞;B: 治疗组凋亡细胞增多.
图3 肿瘤细胞Bcl-2免疫组化×40.A: 肝癌组Bcl-2强阳性表达细胞;B: 治疗组Bcl-2表达减弱.
3 讨论绝大多数的恶性肿瘤细胞具有端粒酶活性，而除生殖细胞以外的正常人体组织大多为端粒酶阴性[1-9]，因此端粒酶可能成为肿瘤治疗的新靶点[10-12].采用端粒酶抑制剂进行肿瘤治疗具有广谱性，适合所有的恶性肿瘤治疗，已有一些小分子合成物被证明有端粒酶抑制作用[13-14]，但其特异性和安全性值得怀疑.当前关于恶性肿瘤发病机制方面的一个重要观点认为:肿瘤不仅仅是一种异常“增生”性的疾病[15]，而且和机体的另外一个重要生理调控机制一凋亡过程和紊乱关系密切[16].细胞凋亡在胚胎发育过程中既不断进行，是细胞的自主性死亡操作，具有级连效应，受多种基因的精细节，对维持机体内环境的稳定具有重要意义[17].凋亡减弱是肿瘤发生的重要机制[18]，有研究表明在肿瘤发生过程中多种凋亡基因发生变异[19-20].p53基因迄今为止发现的与肿瘤发生关系最为密切的基因，有野生和突变两种构型.野生型p53的抑癌基因，并且为有DNA损伤的细胞凋亡过程所必需.p53基因与是否对肿瘤组织的端粒酶存在影响，各家报道并不一致.我们认为可能与p53基因下调Bcl-2基因的表达有关.从本实验的结果可以看出，在p53基因注射之后，治疗组动物的Bcl-2蛋白表达强度明显减弱，并且这种减弱的水平与端粒酶活性的降低具有明显的平行关系.此外，我们还发现，治疗组动物，端粒酶阴性的肝癌组织也多同时有Bcl-2表达产物强度的下降，这一方面说明表达与商粒酶活性之间的密切关系，另一方面也显示端粒酶阳性的肿瘤细胞多处于凋亡抑制状态，即恶性肿瘤的增生与凋亡都发生了异常.而野生型p53基因则通过阻断肿瘤细胞永生的关键环节，即降低端粒酶活性和下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达，这两个方面发挥其抑癌作用.
, 百拇医药
4 参考文献1 奚伟红,倪晓谦, 沈玉琴,黄琴梅.胃癌端粒酶活性临床研究.世界华人消化杂志 2000;8(特刊8):113
2 朱芮, 肖卫东,熊永炎, 邹典定,王莉, 陈新煜.胃腺癌组织中端粒酶及nm23的表达与预后.世界华人消化杂志
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3 Hiyama E, Kodama T, Shinbara K, Iwao T, Itoh M, Hiyama K, Shay JW,Matsuura Y, Yokoyama T. Telomerase activity
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4 杨仕明,房殿春, 罗元辉,鲁荣, 刘为纹.胃肠道黏膜下肿瘤端粒酶表达的意义.华人消化杂志 1998;6:765-767
5 王维, 罗和生,余保平. 端粒酶与大肠癌.世界华人消化杂志 2000;8:800-802
6 仇生龙,黄锦湫, 王裕发,彭志海. 大肠癌前病变与癌及脱落细胞端粒酶分析.华人消化杂志 1998;6:992-993
7 贾林, 李瑜元.结肠灌洗脱落细胞端粒酶活性诊断结肠癌的价值.华人消化杂志1998;6:955-957
8 赵东兵,张伟, 金顺钱,刘毅, 常邵静,邵永孚. 大肠癌组织中端粒酶活性的研究.中华肿瘤杂志 1998;20:199-201
9 Wang Q, Wu QM,Li SB. Detection of telomerase activity and cytology in diagnosis ofcardiac cancer. World J
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Gastroenterol 2000;6(Suppl 3):29
10 Zhang FX, Zhang XY, Fan DM, Deng ZY, Yan Y, Wu HP, Fan JJ.Antisense telomerase RNA induced human gastric
cancer cell apoptosis. World JGastroenterol 2000;6:430-432
11 夏忠胜,朱兆华, 何守搞.全反式维甲酸和5-Fu对裸鼠胃癌移植瘤生长和端粒酶活性的影响.世界华人消化杂志
2000;8:674-677
12 朱兆华,夏忠胜, 何守搞.全反式维甲酸和5-Fu对胃癌细胞端粒酶活性和细胞生长的影响.世界华人消化杂志
, http://www.100md.com
2000;8:669-673
13 许兰涛,马力. 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞影响的研究.世界华人消化杂志 2000;8:1065-1066
14 孟志强,郭伟剑, 于尔辛,宋明志, 黄雯霞.健脾理气方药物血清对肝癌细胞端粒酶活性及凋亡的影响.世界华人消化杂志
2000;8: 879-882
15 李宝杰,王新红, 曲波.肝细胞癌变过程中cyclinD1的异常表达与端粒酶活性的相关分析及意义.世界华人消化杂志
2003;11:1682-1689
16 郭光云,徐少勇, 邓长生.酒石酸锑钾诱导人胃癌细胞凋亡.世界华人消化杂志 2004;12:520-522
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17 廖冰, 薛玲,何萍, 赵国强,车丽洪. 癌基因对大鼠肝卵圆细胞分化和转化的影响.世界华人消化杂志 2004;12:344-346
18 Ameisen JC. Programmed cell death(apoptosis)and cell survivalregulation: relevance to aidsand cancer. AIDS
1994;8: 1197-1212
19 Sugamura K, Makino M, Shirai H, Kimura O, Maeta M, Itoh H, KaibaraN. Enhanced induction of apoptosis of human
gastric carcinoma cells after preoperativetreatment with 5-fluorouracil. Cancer 1997;79:12-17
20 杨文宇,黄宗海. 自杀基因治疗恶性肿瘤的载体效率及基因表达.世界华人消化杂志 2004;12:194-198, http://www.100md.com( 曲 波, 潘海乐, 吕志武, 关景明)
潘海乐,哈尔滨医科大学附属二院骨科 黑龙江省哈尔滨市 150086
项目负责人:曲波, 150086, 黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路157号,哈尔滨医科大学附属二院消化内科.
收稿日期:2004-04-15 接受日期:2004-05-24
摘要
目的:观察野生型p53基因对昆明鼠肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响，探讨p53基因的抑瘤机制.
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方法:♂5周龄昆明鼠30只，随机分类肝癌组(I)和p53基因治疗组(II).每只鼠于后肢股部皮下接种Hep-A-22肝癌细胞悬液0.2mL，建立动物模型.接种后24 h，II组实验动物于荷瘤局部皮下注射介导野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒液0.2mL，14 d后处死实验动物.PCR-ELISA定量检测肝癌组织端粒酶活性，免疫组化观察肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达情况.
结果:腺病毒介导的野生型p53基因能够显著抱制肝癌的生长(肿瘤直径23.32±1.45cm vs 5.13±0.37 cm，P<0.001)，明显降低端粒酶的活性表达(A值2.46±0.35vs 0.78±0. 06，P<0.01)，下调Bcl-2基因蛋白的生成(表达阳性率67.8%vs 25.9%，P<0.05).
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曲波, 潘海乐,吕志武, 关景明.野生型P53基因对肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响.世界华人消化杂志 2004;12(10):2461-2463
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1 材料和方法
1.1 材料 含野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒，由尹新华博士惠赠.病毒滴度为8.2×1013 pfu/L. TRAP-PCR-ELISA端粒酶检测试剂盒和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，购自宝灵曼公司.Bcl-2mAb购自博士公司.鼠Hep-A-22肝癌细胞株，由黑龙江省肿瘤研究所提供.昆明鼠，♂，体质量28-30g，购自黑龙江省肿瘤研究所.
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1.2 方法 复苏Hep-A-22肝癌细胞株，接种到小鼠腹腔中，2wk后取腹水，离心，用RPMI1640营养液调细胞密度为1×1010/mL，每只鼠于后肢股部皮下接种0.2mL细胞悬液，7d后长出实体瘤.小鼠随机分为2组，肝癌组(I)和p53基因治疗组(II)，每组15只.带p53基因的腺病毒液于接种Hep-A-22肝癌细胞株后24h注入，每只鼠0.2mL，14 d后，测量肿瘤大小.
统计学分析 所有数据均用mean±SD表示，以t检验计算组间差异，P<0.05表示显著差异.
2结果Hep-A-22细胞转染带p53的重组腺病毒后在小鼠体内成瘤性降低，到14d时，接种带野生型p53基因小鼠，与单纯接种肿瘤细胞的鼠作比较，肿瘤明显变小.注射p53基因后，治疗组端粒酶活性明显低于肝癌组(A:2.46±0.35 vs 0.78±0.06, P<0.01)，差异有显著性(图1).II组肝癌组织中可见较多的核呈棕褐色的凋亡细胞，I组则偶见凋亡细胞(图2).I组中凋亡指数(%)显著低于II组，两组差异极为明显(3.2±0.8vs15.6±3.6，P<0.01)说明在外源野生型p53注射后，促进了肝癌细胞凋亡的发生.Bcl-2蛋白是膜蛋白，经免疫组化染色后，在细胞胞质可见到棕褐色颗粒.转染带p53腺病毒的肝癌组织，Bcl-2蛋白表达较单纯肝癌组织明显减少(图3).
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图1 昆明鼠肿瘤大题照片.A: 肝癌组肿瘤明显形成;B: 治疗组肿瘤体积明显缩小.
图2 肿瘤细胞凋亡×40.A: 肝癌组偶见凋亡细胞;B: 治疗组凋亡细胞增多.
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3 讨论绝大多数的恶性肿瘤细胞具有端粒酶活性，而除生殖细胞以外的正常人体组织大多为端粒酶阴性[1-9]，因此端粒酶可能成为肿瘤治疗的新靶点[10-12].采用端粒酶抑制剂进行肿瘤治疗具有广谱性，适合所有的恶性肿瘤治疗，已有一些小分子合成物被证明有端粒酶抑制作用[13-14]，但其特异性和安全性值得怀疑.当前关于恶性肿瘤发病机制方面的一个重要观点认为:肿瘤不仅仅是一种异常“增生”性的疾病[15]，而且和机体的另外一个重要生理调控机制一凋亡过程和紊乱关系密切[16].细胞凋亡在胚胎发育过程中既不断进行，是细胞的自主性死亡操作，具有级连效应，受多种基因的精细节，对维持机体内环境的稳定具有重要意义[17].凋亡减弱是肿瘤发生的重要机制[18]，有研究表明在肿瘤发生过程中多种凋亡基因发生变异[19-20].p53基因迄今为止发现的与肿瘤发生关系最为密切的基因，有野生和突变两种构型.野生型p53的抑癌基因，并且为有DNA损伤的细胞凋亡过程所必需.p53基因与是否对肿瘤组织的端粒酶存在影响，各家报道并不一致.我们认为可能与p53基因下调Bcl-2基因的表达有关.从本实验的结果可以看出，在p53基因注射之后，治疗组动物的Bcl-2蛋白表达强度明显减弱，并且这种减弱的水平与端粒酶活性的降低具有明显的平行关系.此外，我们还发现，治疗组动物，端粒酶阴性的肝癌组织也多同时有Bcl-2表达产物强度的下降，这一方面说明表达与商粒酶活性之间的密切关系，另一方面也显示端粒酶阳性的肿瘤细胞多处于凋亡抑制状态，即恶性肿瘤的增生与凋亡都发生了异常.而野生型p53基因则通过阻断肿瘤细胞永生的关键环节，即降低端粒酶活性和下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达，这两个方面发挥其抑癌作用.
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