陈国凤,王琳, 成军,刘妍, 张健,邵清, 张玲霞,李莉,中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心,全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039

    国家自然科学基金攻关项目,No. C03011402, No. C30070689

    军队“九、五”科技攻关项目,No. 98D063

    军队回国留学人员启动基金项目,No. 98H038

    军队“十、五”科技攻关青年基金项目,No. 01Q138

    军队“十、五”科技攻关面上项目,No. 01MB135

    项目负责人:成军, 100039, 北京市,中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心,全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn

    电话:010-66933391 传真:010-63801283

    收稿日期:2004-05-28 接受日期:2004-09-30

    摘要

    目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响，进一步阐明TP在乙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.

    方法:根据AF384372HBVDNA病毒株序列设计、合成HBVDNA P-TP基因序列特异性的引物，以含有AF384372HBVDNAP全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段，以常规的分子生物学技术将获得的HBVDNA-TP编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取mRNA，逆转录为cDNA，与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.

    结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定，证实准确无误.以单链可变区抗体的Westernblot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达，提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA，进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中，发现有111个基因表达水平显著上调，88个基因表达水平显著下调.

    结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBVDNA P-TP转染细胞后差异表达基因 ......