黄果及红果人参、西洋参基因组的RAPD分子标记研究
五加科人参属植物西洋参Panax quiquefolium L.，人参Panax ginseng C.A.Mey.均为享有盛名的珍贵药用植物。为了进行人参属植物的分类研究，先后从形态特征、组织解剖、农艺性状、抗逆抗病性、生理生化、染色体核型、种皮纹饰、化学成分、遗传分析、RAPD分子指纹技术、同工酶、变异情况调查等方面进行了研究。但对黄果及红果人参、西洋参基因组的RAPD分子标记研究未见报道。
由于RAPD技术是在基因组DNA水平上随机进行扩增，所检测的位点在基因组中随机分布，因而可以更客观地说明群体遗传多样性的水平。自二十世纪90年代以来，已被广泛地应用于种间、品种间、亚种、居群或不同基因组间的分类、遗传和进化关系等方面的研究。如利用RAPD分析研究发现人参种内有较丰富的遗传多样性。本文选用黄果、红果人参，黄果、红果西洋参进行RAPD分析，旨在为亲缘关系分类及新品种鉴定提供新的分子证据，并为该属植物种质资源的保护和利用提供科学依据。
1. 材料和方法
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1.1 实验材料
本研究供试的西洋参(Panax quinquefolium L.)黄果和红果植株的4年生新鲜冰冻的叶片由中国科学院左家特产研究所提供，供试的人参(Panax ginseng C.A.Mey)黄果和红果植株的4年生新鲜冰冻的叶片由吉林农业大学西洋参场提供，具体来源及植株数见表1。其中黄果红果人参、黄果红果西洋参每一扩增反应取 0.3g幼嫩叶片用于DNA提取。
1.2 实验试剂
随机引物为上海癌细胞研究所及大连宝生物公司产品，Taq DNA 聚合酶、dNTP为北京鼎国生物技术公司产品
1.3 DNA提取：
采用北京鼎国生物技术公司的植物基因组DNA提取试剂盒，操作步骤参照其说明书。
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1.4 RAPD扩增
RAPD反应为25μl体系，包括如下试剂：
10×PCR buffer (20mmol/L MgCl2)2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，Taq DNA 聚合酶1U、随机引物40ng，基因组DNA80ng。扩增反应在Biometra公司生产的LINOⅡ型 PCR仪上进行，程序为：94.0℃，3min+(94.0℃，1min+38.0℃，1min+72.0℃)×45+72.0℃，10 min。扩增产物检测：取RAPD反应液10μL于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色 ，在紫外透射仪上观察并拍照。扩增产物长度与100bp DNA ladder标记物比较。
1.5 聚类分析
1.5.1 反应条带的观察及统计
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电泳图谱中每一条带均代表了引物与膜板DNA互补的一对结合位点，可记为一个分子标记，根据分子量标准对照反应产物在胶上的对应位置，估计扩增产物的分子量大小。PCR扩增反应重复一次，选取可重复的DNA带记录，有带的记为1，无带的记为0，形成0/1矩阵图的原始数据输入计算机。
1.5.2 数据分析
应用SPSS9.0统计软件对扩增结果进行聚类分析(见图2)。
2. 结果与分析
2.1 RAPD扩增结果
本实验应用15个随机引物对黄果人参、红果人参；黄果西洋参、红果西洋参进行RAPD扩增，结果有14个引物扩增出DNA多态性条带，所得扩增结果见表2。其中P P P，OPR0.5，CCD142-03，5个引物在人参和西洋参之间产生多态性条带；P 、P 、P 、P 、P 、P、CCD142-01，6种引物在红果西洋参和黄果西洋参之间产生多态性；P、P 、P 、P 、P、CCD142-01，6种引物在红果人参和黄果人参之间产生多态性；而P 、P 、P、CCD142-014种引物则可将4个品种完全区别开，如图1，为P 引物的RAPD扩增结果。从图1所示，本实验扩增所分离的多态性条带重现性稳定，因而，可作为特异的分子标记用于品种之间的区分和鉴定。
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2.2 聚类分析
用SPSS9.0分析软件对RAPD扩增结果进行分析，得到一树状分支图。从图中可以看出，西洋参的两个品种聚为一支，而人参的两个品种聚为一支，均表现相互间遗传关系较近，而人参与西洋参遗传差异则较大。
2.3 人参属不同种源多态位点百分率
所谓多态位点是指在该位点上扩增DNA片段出现的频率小于0.99的位点。通过14个10碱基随机引物对人参属的4个种源28个个体的DNA样品进行了RAPD分析。共检测到131个位点。多态位点百分率在35%-46%。
2.4 遗传距离
F=2Nxy(Nx+Ny)
P=1-F
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F为共享度。Nx、Ny分别为第x和y个体拥有的RAPD标记数，Nxy 为x、Y个体共享的RAPD标记数。P遗传距离
3. 讨论
本研究采用随机引物对人参属植物进行扩增，探讨了其在人参属植物中的应用，获得了用于区分人参及西洋参效果较好的分子标记。同时，对RAPD扩增结果进行统计分析，其结果与形态学和细胞学分类结果相符。证实RAPD分子标记可应用于人参及西洋参的分类、品种鉴别及亲缘关系的分析,是应用常规分类方法无法进行亲缘关系分析时的有效手段，且不受环境影响，直接分析其基因型。
RAPD技术，根据各种源间的遗传距离，结合各种源的地理气候因子进行种源鉴定更准确。
人参种质资源研究，在研究手段上尚需进行新的探索。因人参生长和繁殖周期长且栽培技术复杂，构建F和BC 需9年，故快速简便的分子生物学新方法的引入尤显重要。分子标记育种是当今作物育种的发展方向，可显著的缩短育种周期。对于不同农家品种的特异条带的研究，需改用其它更好的鉴定方法，如筛选小卫星或微卫星特异探针，通过与样品杂交来鉴定植物或将其制成引物，根据扩增出简单重复序列的长度来鉴定植物。
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本实验在长春中国人民解放军军需大学植物基因工程中心，植物分子生物学研究室完成。
参考文献
兰进. 1985. 人参农家品种的初步调查. 吉林农业科学, (3)：92
姜顺善. 1992. 关于人参品种的比较研究.人参研究, (1)：16
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任跃英. 1993. 人参育种的基础研究. 人参研究,(4)2-6
肖培根，朱兆仪，张福全等. 1987. 人参的研究与栽培.北京：农业出版社, 39
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李方元，孙先. 1985. 八个人参农家品种类型染色体核型差异. 特产科学实验, (2)：1
马小军，汪小全，肖培根等1999. 人参农家类型种皮扫描电镜观察.中国中药杂志, (5)：269
刘丽萍，王铁生，刘云章等. 1990. 不同类型人参化学成分测定.特产研究, (1)：48
赵寿经，王荣生，刘云章等. 1993. 人参农家类型主要经济性状的遗传特性研究.中药材,16(8)：6
赵寿经. 1996. 人参、西洋参同工酶电泳分析.特产研究,(4)21-25
马小军. 1998. 人参种质资源及其DNA指纹的研究.博士研究生毕业论文.北京：中国医学科学院中国协和医科大学, 46-55
贾继增. 1996. 分子标记种质资源鉴定和分子标记育种. 中国农业科学, 29(4)：1, http://www.100md.com
由于RAPD技术是在基因组DNA水平上随机进行扩增，所检测的位点在基因组中随机分布，因而可以更客观地说明群体遗传多样性的水平。自二十世纪90年代以来，已被广泛地应用于种间、品种间、亚种、居群或不同基因组间的分类、遗传和进化关系等方面的研究。如利用RAPD分析研究发现人参种内有较丰富的遗传多样性。本文选用黄果、红果人参，黄果、红果西洋参进行RAPD分析，旨在为亲缘关系分类及新品种鉴定提供新的分子证据，并为该属植物种质资源的保护和利用提供科学依据。
1. 材料和方法
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1.1 实验材料
本研究供试的西洋参(Panax quinquefolium L.)黄果和红果植株的4年生新鲜冰冻的叶片由中国科学院左家特产研究所提供，供试的人参(Panax ginseng C.A.Mey)黄果和红果植株的4年生新鲜冰冻的叶片由吉林农业大学西洋参场提供，具体来源及植株数见表1。其中黄果红果人参、黄果红果西洋参每一扩增反应取 0.3g幼嫩叶片用于DNA提取。
1.2 实验试剂
随机引物为上海癌细胞研究所及大连宝生物公司产品，Taq DNA 聚合酶、dNTP为北京鼎国生物技术公司产品
1.3 DNA提取：
采用北京鼎国生物技术公司的植物基因组DNA提取试剂盒，操作步骤参照其说明书。
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1.4 RAPD扩增
RAPD反应为25μl体系，包括如下试剂：
10×PCR buffer (20mmol/L MgCl2)2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，Taq DNA 聚合酶1U、随机引物40ng，基因组DNA80ng。扩增反应在Biometra公司生产的LINOⅡ型 PCR仪上进行，程序为：94.0℃，3min+(94.0℃，1min+38.0℃，1min+72.0℃)×45+72.0℃，10 min。扩增产物检测：取RAPD反应液10μL于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色 ，在紫外透射仪上观察并拍照。扩增产物长度与100bp DNA ladder标记物比较。
1.5 聚类分析
1.5.1 反应条带的观察及统计
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电泳图谱中每一条带均代表了引物与膜板DNA互补的一对结合位点，可记为一个分子标记，根据分子量标准对照反应产物在胶上的对应位置，估计扩增产物的分子量大小。PCR扩增反应重复一次，选取可重复的DNA带记录，有带的记为1，无带的记为0，形成0/1矩阵图的原始数据输入计算机。
1.5.2 数据分析
应用SPSS9.0统计软件对扩增结果进行聚类分析(见图2)。
2. 结果与分析
2.1 RAPD扩增结果
本实验应用15个随机引物对黄果人参、红果人参；黄果西洋参、红果西洋参进行RAPD扩增，结果有14个引物扩增出DNA多态性条带，所得扩增结果见表2。其中P P P，OPR0.5，CCD142-03，5个引物在人参和西洋参之间产生多态性条带；P 、P 、P 、P 、P 、P、CCD142-01，6种引物在红果西洋参和黄果西洋参之间产生多态性；P、P 、P 、P 、P、CCD142-01，6种引物在红果人参和黄果人参之间产生多态性；而P 、P 、P、CCD142-014种引物则可将4个品种完全区别开，如图1，为P 引物的RAPD扩增结果。从图1所示，本实验扩增所分离的多态性条带重现性稳定，因而，可作为特异的分子标记用于品种之间的区分和鉴定。
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2.2 聚类分析
用SPSS9.0分析软件对RAPD扩增结果进行分析，得到一树状分支图。从图中可以看出，西洋参的两个品种聚为一支，而人参的两个品种聚为一支，均表现相互间遗传关系较近，而人参与西洋参遗传差异则较大。
2.3 人参属不同种源多态位点百分率
所谓多态位点是指在该位点上扩增DNA片段出现的频率小于0.99的位点。通过14个10碱基随机引物对人参属的4个种源28个个体的DNA样品进行了RAPD分析。共检测到131个位点。多态位点百分率在35%-46%。
2.4 遗传距离
F=2Nxy(Nx+Ny)
P=1-F
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F为共享度。Nx、Ny分别为第x和y个体拥有的RAPD标记数，Nxy 为x、Y个体共享的RAPD标记数。P遗传距离
3. 讨论
本研究采用随机引物对人参属植物进行扩增，探讨了其在人参属植物中的应用，获得了用于区分人参及西洋参效果较好的分子标记。同时，对RAPD扩增结果进行统计分析，其结果与形态学和细胞学分类结果相符。证实RAPD分子标记可应用于人参及西洋参的分类、品种鉴别及亲缘关系的分析,是应用常规分类方法无法进行亲缘关系分析时的有效手段，且不受环境影响，直接分析其基因型。
RAPD技术，根据各种源间的遗传距离，结合各种源的地理气候因子进行种源鉴定更准确。
人参种质资源研究，在研究手段上尚需进行新的探索。因人参生长和繁殖周期长且栽培技术复杂，构建F和BC 需9年，故快速简便的分子生物学新方法的引入尤显重要。分子标记育种是当今作物育种的发展方向，可显著的缩短育种周期。对于不同农家品种的特异条带的研究，需改用其它更好的鉴定方法，如筛选小卫星或微卫星特异探针，通过与样品杂交来鉴定植物或将其制成引物，根据扩增出简单重复序列的长度来鉴定植物。
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本实验在长春中国人民解放军军需大学植物基因工程中心，植物分子生物学研究室完成。
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