微囊化猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰的免疫隔离机制
刘菲, 刘雁冰, 钟岚, 熊伍军, 同济大学附属东方医院消化内科 上海市 200120
赵中辛,同济大学附属东方医院普外科 上海市 200120
刘菲,女, 1962-04-13生, 上海市人, 汉族, 1985年上海医科大学学士, 主任医师, 主要从事肝病的研究.
上海市浦东新区科委项目, No. PK2001-13
通讯作者:刘菲, 200120, 上海市即墨路150号, 同济大学附属东方医院消化内科. liufei2010@hotmail.com
, 百拇医药
电话: 021-38804518-7221
收稿日期: 2004-12-27 接受日期: 2005-01-26
Immunoisolation effects of microencapsulatedporcine hepatocyte transplantation in treating acute hepatic failure inrats
Fei Liu, Yan-Bing Liu, Lan Zhong, Wu-Jun Xiong, Zhong-Xin Zhao
Fei Liu, Yan-BingLiu, Lan Zhong, Wu-Jun Xiong, Department of Gastroenterology, Dongfang Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China
, 百拇医药
Zhong-Xin Zhao, Department of Generai Surgery, Dongfang Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China
Correspondence to: Fei Liu, Department of Gastroenterology, Dongfang Hospital, Tongji University, Shanghai 200120,China. liufei2010@hotmail.com
Received: 2004-12-27 Accepted: 2005-01-26
Abstract
AIM: To investigate the therapeutic effect of microencapsulated porcine hepatocyte transplantation intraperitoneally on toxic hepatic failure in rats.
, http://www.100md.com
METHODS: The isolated hepatocytes were encapsulated by the alginate method.The immunoisolation effects of sodium alginate-polyserine-sodium alginate(APA)microcapsules against NK cell-meidated cytotoxicity were evaluated. Microencapsulated porcine hepatocytes were transplanted into abdominal cavity of rats 48 hours after the induction of acute hepatic failure(AHF)with D-galactosamine. The survival rate and hepatic pathologic changes were determined. The expression of CD4, CD8, IgG and IgM in the greater omentum was examined.
, http://www.100md.com
RESULTS: Microcapsules effectively protected K562 cells against the killing by NK cells. Compared with the free hepatocyte transplantation group, the survival rate of the rats in microencapsulated porcine hepatocyte transplantation group was significantly higher, and the expression of CD4, CD8 and IgG in the greater omentum was much weaker.
CONCLUSION: APA microencapsules can effectively prevent cellular and humoral immune responses. Microencapsulated xenogeneic hepatocyte stransplantation is effective in the treatment of AHF.
, http://www.100md.com
Key Words: Microencapsulated porcine hepatocytes; Sodium alginate-polyserine-sodium alginate; Acute hepatic failure; Immunoisolation
Liu F, Liu YB, Zhong L, Xiong WJ, Zhao ZX. Immunoisolation effects of microencapsulated porcine hepatocyte transplantation in treating acute hepatic failure in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005;13(6):748-751
摘要
目的:探讨微囊化猪肝细胞腹腔内移植对药物性肝衰大鼠的治疗作用，观察受体存活率、肝组织病理变化及大网膜的免疫隔离作用.
, 百拇医药
方法:以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)包裹乳猪肝细胞，体外观察APA微囊对NK细胞介导的细胞毒作用的隔离效果.D-氨基半乳糖腹腔内注射诱导大鼠急性肝衰竭，48 h后将微囊化的猪肝细胞移植于大鼠腹腔内，观察移植大鼠存活率，免疫组化法检测大鼠大网膜内CD4、CD8、IgG和IgM的表达.
结果:微囊可有效保护囊内K562细胞不受NK细胞的杀伤.与裸肝细胞移植组相比，微囊化乳猪肝细胞移植组大鼠存活率显著提高(1wk存活率78.6% vs 66.7%，P= 0.0 046;2 wk存活率42.9% vs 25.0%，P= 0.0 027，P<0.01).大网膜CD4、CD8、IgG表达较弱(P = 0.0 342、P= 0.0 197及P= 0.0 445，P<0.05)，而IgM表达无明显差异(P>0.05).
结论:APA微囊可有效隔离抗体及淋巴细胞介导的体液和细胞免疫反应.微囊化异种肝细胞移植可治疗大鼠急性肝衰，给予肝功能代谢支持，提高移植治疗效果.
, 百拇医药
关键词:微囊化猪肝细胞; 海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠; 急性肝衰竭; 免疫隔离
刘菲, 刘雁冰, 钟岚, 熊伍军, 赵中辛. 微囊化猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰的免疫隔离机制. 世界华人消化杂志 2005;13(6):748-751 (PDF) 三组大鼠存活率比较.
2.2 组织学检查 正常大网膜为纤维、血管及脂肪组织.移植后第3 d打开腹腔，II组大鼠腹腔内可见散在分布的微囊，有的聚集成团，一部分附着于大网膜，HE染色见团块内细胞形态较好，有的呈索状排列，并可见血管形成，个别见软骨样组织，少数微囊周围可见纤维组织出现.
2.3 大网膜CD4，CD8，IgG，IgM免疫组化结果 裸肝细胞组和微囊包裹组大鼠3 d于大网膜内均检测到CD4，CD8，IgG和IgM的表达(图2).与裸肝细胞组相比，微囊包裹组大网膜CD4，CD8，IgG表达较弱，二者相比显著差异(P= 0.0 342、P= 0.0 197及P= 0.0 445，P<0.05)，而IgM表达差异不明显(P>0.05，表3).
, http://www.100md.com
图2 裸肝组、微囊包裹组大鼠CD4，CD8及IgG表达×40. A:裸肝组CD4; B:微囊包裹组CD4; C:裸肝组CD8; D:微囊包裹组CD8; E:裸肝组IgG; F:微囊包裹组IgG.
表3 移植大鼠大网膜CD4，CD8，IgG及IgM表达水平
bP<0.01vs裸肝细胞组;dP<0.01vs裸肝细胞组.
3 讨论肝细胞移植(HCT)已成为继原位肝移植后又一治疗肝衰竭和肝先天性代谢障碍疾病的一种有效治疗措施.免疫排斥是肝细胞移植(HCT)面临的主要问题之一.HCT所致的免疫排斥反应，其强弱程度依赖于供受体组织相容性匹配程度.自从1988年微囊化技术首次应用以来，使异体或异种肝细胞移植翻开新的一页.微囊肝细胞，即将肝细胞包裹在藻酸盐-多聚赖氨酸-藻酸盐(APA)的微囊膜内，该膜允许营养物质及小分子细胞合成产物通过，而不让大分子如抗体通过，能使植入肝细胞被屏障起来，从技术上解决免疫排斥问题[3].通过微囊化技术，不同种属间的细胞移植在一定程度上可不需使用免疫抑制剂.
, http://www.100md.com
在我们的试验中，通过将猪肝细胞移植入急性肝衰大鼠腹腔内，明显降低了肝衰大鼠的死亡率，延长了大鼠的存活时间，肝功能也明显改善.而与裸肝细胞移植组相比，微囊化肝细胞移植组大鼠表现出更为显著的治疗效应，不仅死亡率更低、存活时间更长.进一步通过免疫组化法，发现裸肝细胞组和微囊包裹组大鼠在大网膜内均检测到CD4、CD8、IgG和IgM的表达.提示药物性肝衰大鼠腹腔内移植异种肝细胞后，受体在产生细胞免疫的同时，也有体液免疫的参与.研究还发现，与裸肝细胞组相比，微囊包裹组大网膜CD4、CD8、IgG表达较弱，二者相比显著差异(P<0.05)，证实了肝细胞经微囊包裹后，有效抵御了淋巴细胞介导的细胞免疫反应和抗体介导的体液免疫反应.Bumgardner et al[4]通过试验证实HCT的排斥反应主要是由T细胞介导的.并通过CD4，CD8单克隆抗体封闭T细胞介导的不同免疫途径，证实了肝细胞具有较强的免疫原性，能引起宿主体内强烈的CD4+，CD8+T细胞介导的免疫反应，其中迟发型超敏反应起重要作用.体液免疫反应的程度一般比较轻微，有试验证明同种大鼠HCT时有补体(主要是c3)及少量的抗体(主要是IgM)参与免疫排斥反应.本组结果与其相似.
, http://www.100md.com
微囊化肝细胞移植显著的治疗作用，考虑与下列机制有关:(1)移植入腹腔的肝细胞发挥替代功能.本试验证明微囊包裹肝细胞与裸肝细胞白蛋白、转氨酶及尿素氮分泌水平无显著差异，表明微囊包裹对肝细胞分泌功能无明显影响.(2)微囊化技术效降低了免疫排斥反应.与裸肝细胞组相比，微囊包裹组大网膜CD4、CD8、IgG表达较弱，提示生物膜半透膜的阻隔作用降低了免疫反应的强度[5].(3)可能还与移植细胞促进受损肝脏的修复有关.其中有复杂的体液分子机制参与，包括促肝细胞生长因子、胰岛素、上皮生长因子、转化生长因子等，促进宿主残余肝细胞增值和肝功能的恢复.其中肝细胞生长因子是一种很强的DNA合成促进剂，主要由肝的非实质细胞表达，是一种热稳定肽酶，对肝有特异性，可成为HCT中有效的促分裂原，在肝损伤后对肝的再生起作用.其具体机制有待阐明.
4 参考文献1 郭水龙, 薛毅珑, 李新建, 罗芸, 田磊, 李雁凌, 张佐云. APA微囊移植免疫隔离效果的研究.
, http://www.100md.com
中国免疫学杂志 2003;19:682-685
2 Selden C, Casbard A, Themis M, Hodgson HJ. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in
rat peritoneum. Cell Transplant 2003;12:569-578
3 赵中辛, 丁友成. 异种肝细胞移植排斥机制的探讨. 中华器官移植杂志 2001;22:280-281
4 Bumgardner GL, Li J, Heininger M, Ferguson RM, Orosz CG. In vivo immunogenicity of purified allogeneic hepatocytes in
a murine hepatocyte transplant model. Transplantation 1998;65:47-52
5 何震宇, 高蓓, 朱泰来, 陈永田, 杨春, 张萍. 药物性肝衰大鼠脾内移植异种肝细胞治疗前后CD4、CD8的变化
及意义. 中国普通外科杂志 2004;13:224-227
编辑 潘伯荣 审读 张海宁, http://www.100md.com( 刘 菲,刘雁冰,钟 岚,熊伍军, 赵中辛)
赵中辛,同济大学附属东方医院普外科 上海市 200120
刘菲,女, 1962-04-13生, 上海市人, 汉族, 1985年上海医科大学学士, 主任医师, 主要从事肝病的研究.
上海市浦东新区科委项目, No. PK2001-13
通讯作者:刘菲, 200120, 上海市即墨路150号, 同济大学附属东方医院消化内科. liufei2010@hotmail.com
, 百拇医药
电话: 021-38804518-7221
收稿日期: 2004-12-27 接受日期: 2005-01-26
Immunoisolation effects of microencapsulatedporcine hepatocyte transplantation in treating acute hepatic failure inrats
Fei Liu, Yan-Bing Liu, Lan Zhong, Wu-Jun Xiong, Zhong-Xin Zhao
Fei Liu, Yan-BingLiu, Lan Zhong, Wu-Jun Xiong, Department of Gastroenterology, Dongfang Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China
, 百拇医药
Zhong-Xin Zhao, Department of Generai Surgery, Dongfang Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China
Correspondence to: Fei Liu, Department of Gastroenterology, Dongfang Hospital, Tongji University, Shanghai 200120,China. liufei2010@hotmail.com
Received: 2004-12-27 Accepted: 2005-01-26
Abstract
AIM: To investigate the therapeutic effect of microencapsulated porcine hepatocyte transplantation intraperitoneally on toxic hepatic failure in rats.
, http://www.100md.com
METHODS: The isolated hepatocytes were encapsulated by the alginate method.The immunoisolation effects of sodium alginate-polyserine-sodium alginate(APA)microcapsules against NK cell-meidated cytotoxicity were evaluated. Microencapsulated porcine hepatocytes were transplanted into abdominal cavity of rats 48 hours after the induction of acute hepatic failure(AHF)with D-galactosamine. The survival rate and hepatic pathologic changes were determined. The expression of CD4, CD8, IgG and IgM in the greater omentum was examined.
, http://www.100md.com
RESULTS: Microcapsules effectively protected K562 cells against the killing by NK cells. Compared with the free hepatocyte transplantation group, the survival rate of the rats in microencapsulated porcine hepatocyte transplantation group was significantly higher, and the expression of CD4, CD8 and IgG in the greater omentum was much weaker.
CONCLUSION: APA microencapsules can effectively prevent cellular and humoral immune responses. Microencapsulated xenogeneic hepatocyte stransplantation is effective in the treatment of AHF.
, http://www.100md.com
Key Words: Microencapsulated porcine hepatocytes; Sodium alginate-polyserine-sodium alginate; Acute hepatic failure; Immunoisolation
Liu F, Liu YB, Zhong L, Xiong WJ, Zhao ZX. Immunoisolation effects of microencapsulated porcine hepatocyte transplantation in treating acute hepatic failure in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005;13(6):748-751
摘要
目的:探讨微囊化猪肝细胞腹腔内移植对药物性肝衰大鼠的治疗作用，观察受体存活率、肝组织病理变化及大网膜的免疫隔离作用.
, 百拇医药
方法:以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)包裹乳猪肝细胞，体外观察APA微囊对NK细胞介导的细胞毒作用的隔离效果.D-氨基半乳糖腹腔内注射诱导大鼠急性肝衰竭，48 h后将微囊化的猪肝细胞移植于大鼠腹腔内，观察移植大鼠存活率，免疫组化法检测大鼠大网膜内CD4、CD8、IgG和IgM的表达.
结果:微囊可有效保护囊内K562细胞不受NK细胞的杀伤.与裸肝细胞移植组相比，微囊化乳猪肝细胞移植组大鼠存活率显著提高(1wk存活率78.6% vs 66.7%，P= 0.0 046;2 wk存活率42.9% vs 25.0%，P= 0.0 027，P<0.01).大网膜CD4、CD8、IgG表达较弱(P = 0.0 342、P= 0.0 197及P= 0.0 445，P<0.05)，而IgM表达无明显差异(P>0.05).
结论:APA微囊可有效隔离抗体及淋巴细胞介导的体液和细胞免疫反应.微囊化异种肝细胞移植可治疗大鼠急性肝衰，给予肝功能代谢支持，提高移植治疗效果.
, 百拇医药
关键词:微囊化猪肝细胞; 海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠; 急性肝衰竭; 免疫隔离
刘菲, 刘雁冰, 钟岚, 熊伍军, 赵中辛. 微囊化猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰的免疫隔离机制. 世界华人消化杂志 2005;13(6):748-751 (PDF) 三组大鼠存活率比较.
2.2 组织学检查 正常大网膜为纤维、血管及脂肪组织.移植后第3 d打开腹腔，II组大鼠腹腔内可见散在分布的微囊，有的聚集成团，一部分附着于大网膜，HE染色见团块内细胞形态较好，有的呈索状排列，并可见血管形成，个别见软骨样组织，少数微囊周围可见纤维组织出现.
2.3 大网膜CD4，CD8，IgG，IgM免疫组化结果 裸肝细胞组和微囊包裹组大鼠3 d于大网膜内均检测到CD4，CD8，IgG和IgM的表达(图2).与裸肝细胞组相比，微囊包裹组大网膜CD4，CD8，IgG表达较弱，二者相比显著差异(P= 0.0 342、P= 0.0 197及P= 0.0 445，P<0.05)，而IgM表达差异不明显(P>0.05，表3).
, http://www.100md.com
图2 裸肝组、微囊包裹组大鼠CD4，CD8及IgG表达×40. A:裸肝组CD4; B:微囊包裹组CD4; C:裸肝组CD8; D:微囊包裹组CD8; E:裸肝组IgG; F:微囊包裹组IgG.
表3 移植大鼠大网膜CD4，CD8，IgG及IgM表达水平
CD4 | CD8 | IgG | , 百拇医药 IgM | |||||
阳性率 | 强阳性率 | 阳性率 | 强阳性率 | 阳性率 | 强阳性率 | 阳性率 | 强阳性率 | |
裸肝细胞 | 19.8±2.6 | 12.8±3.5 | , 百拇医药 20.1±7.5 | 12.5±5.00 | 18.3±1.4 | 12.0±1.9 | 17.3±6.0 | 12.1±5.0 |
包裹肝细胞 | 12.3±3.7b | 7.5±2.8d | 13.0±5.4b | , 百拇医药 7.6±4.3d | 10.9±4.0b | 7.1±3.7 | 17.8±5.5 | 11.7±4.1 |
bP<0.01vs裸肝细胞组;dP<0.01vs裸肝细胞组.
3 讨论肝细胞移植(HCT)已成为继原位肝移植后又一治疗肝衰竭和肝先天性代谢障碍疾病的一种有效治疗措施.免疫排斥是肝细胞移植(HCT)面临的主要问题之一.HCT所致的免疫排斥反应，其强弱程度依赖于供受体组织相容性匹配程度.自从1988年微囊化技术首次应用以来，使异体或异种肝细胞移植翻开新的一页.微囊肝细胞，即将肝细胞包裹在藻酸盐-多聚赖氨酸-藻酸盐(APA)的微囊膜内，该膜允许营养物质及小分子细胞合成产物通过，而不让大分子如抗体通过，能使植入肝细胞被屏障起来，从技术上解决免疫排斥问题[3].通过微囊化技术，不同种属间的细胞移植在一定程度上可不需使用免疫抑制剂.
, http://www.100md.com
在我们的试验中，通过将猪肝细胞移植入急性肝衰大鼠腹腔内，明显降低了肝衰大鼠的死亡率，延长了大鼠的存活时间，肝功能也明显改善.而与裸肝细胞移植组相比，微囊化肝细胞移植组大鼠表现出更为显著的治疗效应，不仅死亡率更低、存活时间更长.进一步通过免疫组化法，发现裸肝细胞组和微囊包裹组大鼠在大网膜内均检测到CD4、CD8、IgG和IgM的表达.提示药物性肝衰大鼠腹腔内移植异种肝细胞后，受体在产生细胞免疫的同时，也有体液免疫的参与.研究还发现，与裸肝细胞组相比，微囊包裹组大网膜CD4、CD8、IgG表达较弱，二者相比显著差异(P<0.05)，证实了肝细胞经微囊包裹后，有效抵御了淋巴细胞介导的细胞免疫反应和抗体介导的体液免疫反应.Bumgardner et al[4]通过试验证实HCT的排斥反应主要是由T细胞介导的.并通过CD4，CD8单克隆抗体封闭T细胞介导的不同免疫途径，证实了肝细胞具有较强的免疫原性，能引起宿主体内强烈的CD4+，CD8+T细胞介导的免疫反应，其中迟发型超敏反应起重要作用.体液免疫反应的程度一般比较轻微，有试验证明同种大鼠HCT时有补体(主要是c3)及少量的抗体(主要是IgM)参与免疫排斥反应.本组结果与其相似.
, http://www.100md.com
微囊化肝细胞移植显著的治疗作用，考虑与下列机制有关:(1)移植入腹腔的肝细胞发挥替代功能.本试验证明微囊包裹肝细胞与裸肝细胞白蛋白、转氨酶及尿素氮分泌水平无显著差异，表明微囊包裹对肝细胞分泌功能无明显影响.(2)微囊化技术效降低了免疫排斥反应.与裸肝细胞组相比，微囊包裹组大网膜CD4、CD8、IgG表达较弱，提示生物膜半透膜的阻隔作用降低了免疫反应的强度[5].(3)可能还与移植细胞促进受损肝脏的修复有关.其中有复杂的体液分子机制参与，包括促肝细胞生长因子、胰岛素、上皮生长因子、转化生长因子等，促进宿主残余肝细胞增值和肝功能的恢复.其中肝细胞生长因子是一种很强的DNA合成促进剂，主要由肝的非实质细胞表达，是一种热稳定肽酶，对肝有特异性，可成为HCT中有效的促分裂原，在肝损伤后对肝的再生起作用.其具体机制有待阐明.
4 参考文献1 郭水龙, 薛毅珑, 李新建, 罗芸, 田磊, 李雁凌, 张佐云. APA微囊移植免疫隔离效果的研究.
, http://www.100md.com
中国免疫学杂志 2003;19:682-685
2 Selden C, Casbard A, Themis M, Hodgson HJ. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in
rat peritoneum. Cell Transplant 2003;12:569-578
3 赵中辛, 丁友成. 异种肝细胞移植排斥机制的探讨. 中华器官移植杂志 2001;22:280-281
4 Bumgardner GL, Li J, Heininger M, Ferguson RM, Orosz CG. In vivo immunogenicity of purified allogeneic hepatocytes in
a murine hepatocyte transplant model. Transplantation 1998;65:47-52
5 何震宇, 高蓓, 朱泰来, 陈永田, 杨春, 张萍. 药物性肝衰大鼠脾内移植异种肝细胞治疗前后CD4、CD8的变化
及意义. 中国普通外科杂志 2004;13:224-227
编辑 潘伯荣 审读 张海宁, http://www.100md.com( 刘 菲,刘雁冰,钟 岚,熊伍军, 赵中辛)
