表达ureB/hlyE融合蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌预防幽门螺旋杆菌感染
焦志勇,广州市南方医科大学南方医院肿瘤科 广东省广州市 510515
陈旻湖,朱森林,李国庆, 胡品津,中山大学附属第一医院消化内科 广东省广州市 510080
2000年度教育部骨干教师基金
2002年广东省自然科学基金重点项目, No. 021898
通讯作者:陈旻湖, 510080, 广东省广州市, 中山大学附属第一医院消化内科. chenminhu@gzsums.edu.cn
电话: 020-87755766-8172
收稿日期: 2004-11-23 接受日期: 2004-12-09
, 百拇医药
摘要
目的:建立表达幽门螺杆菌(Hpylori)尿素酶B亚单位(UreB)与血溶素E(hlyE)融合蛋白的减毒沙门疫苗菌，并利用H pylori小鼠感染模型，研究该疫苗菌对H pylori感染的免疫保护作用.
方法:利用分子克隆技术构建携带ureB/hlyE融合基因的重组原核表达质粒pTrc99A-ureB/hlyE，经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列，并与GeneBank中相关序列进行同源性比较.pTrc99A-ureB/hlyE转化减毒伤寒沙门菌SL3261，培养后筛选阳性菌落，抽提质粒进行PCR及酶切鉴定.表达的UreB/hlyE融合蛋白SDS-PAGE电泳和Western-blotting进行鉴定，薄层扫描分析蛋白含量.实验小鼠随机分成4组，分别灌胃给予生理盐水组、减毒鼠伤寒沙门菌SL3261组、携带pTrc99A-ureB的SL3261组、携带 pTrc99A-ureB/hlyE的SL3261组.免疫后4 wk，予H pylori 107CFU/只进行攻击(生理盐水组不攻击).攻击4 wk后处死动物，取胃组织分别行改良Giemsa染色及定量细菌培养，观察H pylori定植情况.
, 百拇医药
结果:核苷酸序列测定及同源性分析证实，原核表达质粒pTrc99A-ureB/hlyE中所含的H pylori -ureB及hlyE基因与GeneBank中的H pylori-ureB和hlyE基因同源性分别为97.42%(1 663/1 707)、99.78%(910/912).重组减毒沙门氏菌可表达约100 ku的融合蛋白UreB/hlyE，含量占全菌体蛋白含量的15%;表达的融合蛋白能与小鼠抗H pylori血清特异性反应，具有良好的免疫原性.动物实验证实，疫苗组同空白对照组和SL3261组相比，H pylori定植密度明显下降，有显著性差异(P<0.05).表达UreB/hly蛋白的疫苗株组同表达UreB蛋白的疫苗株相比，H pylori定植密度明显下降，差异有统计学意义(P<0.05).
结论:重组疫苗菌对小鼠H pylori感染具有一定免疫预防作用，hlyE可以增强疫苗株的免疫保护效果.
, http://www.100md.com
焦志勇, 陈旻湖, 朱森林, 李国庆, 胡品津. 表达ureB/hlyE融合蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌预防幽门螺旋杆菌感染. 世界华人消化杂志 2005;13(6):787-789 (PDF) 携带H pylori-ureB/hlyE基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与鉴定. 1，5ureB and hlyE amplified respectively from recombinant pTrc99A-ureB/hlyE.2，6 negative control PCR;3，7 recombinant pTrc99A-ureB/hlyE digested by Nco I-SalI and Sal I -Hind III;4 molecular standard 100 bpladders.
2.2 重组质粒pTrc99A-ureB/hlyE的测序和同源性分析重组质粒pTrc99A-ureB/hlyE测序及同源性分析，结果表明重组质粒pTrc99A-ureB/hlyE中的ureB和hlyE与基因文库中H pylori ureB和hlyE同源性分别为97.42%(1 663/1707)和99.78%(910/912).蛋白同源性分别为97.68%(295/302)和99.65%(567/569).
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2.3 重组质粒pTrc99A-ureB/hlyE在SL3261中的表达重组减毒鼠伤寒沙门氏菌菌体蛋白在100 ku左右出现一新生蛋白带，与推测的UreB/hlyE融合蛋白分子量相符，对照空菌及转化空质粒的细菌菌体蛋白中无该条蛋白带，薄层扫描分析显示:UreB/hlyE融合蛋白占菌体蛋白总量的15.5%(图2).Western-blotting结果表明，目的蛋白能与小鼠抗H pylori血清免疫着色(图3).
图2 (PDF) 融合蛋白UreB/hlyE在SL3261中的表达. 1:Protein marker(mr); 2: SL3261; 3，4: SL3261(pTrc99A); 5，6: SL3261(pTrc99A-ureB/hlyE).
图3 (PDF) 融合蛋白UreB/hlyE Western blotting结果. 1: Protein marker(mr); 2: SL3261; 3: SL3261(pTrc99A);4: SL3261(pTrc99A-ureB/hlyE).
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2.4 疫苗株免疫保护效果各组动物的H pylori定量培养结果比较(表2)，A、B和C之间差异没有统计学意义(P>0.05);D、E同A、B和C相比，H pylori定植密度差异有统计学意义(P<0.05);D与E相比，H pylori定量培养菌落数显著减少，有统计学意义(P= 0.049).
表2 各组动物胃组织中H pylori的定量培养(CFU/g)
aP<0.05vs A，B和C组;cP<0.05vs D组.
3 讨论
利用活减毒鼠伤寒沙门菌这种新型的口服疫苗载体释放系统与传统疫苗相比具有许多优点，如不必纯化抗原，不需佐剂，避免了抗原在胃内降解和变性[3].我们构建的表达H pylori ureB的减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗免疫动物取得了比较好的效果，保护率达50%[4].为了进一步增强减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗的免疫效果，我们利用分子克隆的方法，构建了表达ureB/hlyE融合蛋白的减毒沙门氏菌疫苗，UreB和hlyE的核苷酸序列与基因文库中相关序列的同源性为97.42%和99.78%.pTrc99A是一个高效原核表达载体，有强大的Trp/Lac杂合启动子，在化学诱导剂IPTG作用下表达所插入的基因.表达ureB/hlyE融合蛋白的减毒沙门氏菌疫苗在1 mmoL/L IPTG诱导下能够高效表达大小约为100 ku的融合蛋白.hlyE是大肠杆菌中一种可以促进孔道形成的毒素.可在细菌表面表达或分泌至细菌外并促进靶细胞膜上的孔道形成[5-6].Galenet al将伤寒杆菌的hlyE与SacB基因融合后，可在含150 g/l的乳糖固体培养基上生长，而SacB基因在肠道细菌胞内单独表达时，分解乳糖为葡萄糖后发酵导致细菌的死亡，说明此融合蛋白可通过hlyE的外排作用外排细菌表面或完全分泌到细菌周围.同时作者发现hlyE的外排作用还可以提高与之融合的蛋白的表达和免疫原性，疟疾原虫的MSP-1(19)蛋白在肠道细菌中很难表达，而与hlyE融合后不仅在减毒伤寒杆菌中表达良好而且可诱导特异性抗体的产生[7].组织H pylori定量培养可以比较准确地计数H pylorii菌落数，更全面敏感地评价组织H pylori定植水平[8].疫苗免疫小鼠的H pylori定量培养结果显示，表达UreB/hlyE融合蛋白重组减毒沙门菌疫苗株与表达ureB重组疫苗株相比，H pylori定量培养的菌落数少，差异有统计学意义(P= 0.049)，表达UreB/hlyE融合蛋白重组疫苗株的免疫保护效果高于表达ureB重组疫苗株，hlyE促进H pylori抗原的分泌表达，可以增强疫苗株的免疫保护作用.疫苗株免疫后的实验小鼠胃内H pylori定植水平虽然下降，但仍可培养出细菌，未出现无菌性免疫的效果.说明疫苗株只能明显减少胃内H pylori的定植，还不能完全清除H pylori;不过H pylori的减少也很有价值，因为H pylori定植水平与胃炎的严重程度和炎症细胞的浸润程度密切相关[8].本实验的结果证实表达ureB/hlyE融合基因的重组疫苗株可以预防H pylori的感染，减少胃内H pylori的定植水平;hlyE可增强重组疫苗株的免疫效果，可以作为提高此类疫苗免疫效果的一种方法.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Gomez-Duarte OG, Lucas B, Yan ZX, Panthel K, Haas R, Meyer TF. Protection of mice against gastric colonization
by Helicobacter pylori by single oral dose immunization with attenuated Salmonella typhimurium producing urease
subunits A and B. Vaccine 1998;16:460-471
2 del Castillo FJ, Leal SC, Moreno F, del Castillo I. The Escherichia coli K-12 sheA gene encodes a 34-kDa
, 百拇医药
secreted haemolysin. Mol Microbiol 1997;25:107-115
3 Gomez-Duarte OG, Bumann D, Meyer TF. The attenuated Salmonella vaccine approach for the control of
Helicobacter pylori-related diseases. Vaccine 1999;17:1667-1673
4 朱森林, 陈旻湖, 廖文俊, 陈洁, 胡品津. 表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的
构建和鉴定. 中华消化杂志 2001;21:526-529
5 Wallace AJ, Stillman TJ, Atkins A, Jamieson SJ, Bullough PA, Green J, Artymiuk PJ. E. coli hemolysin
, 百拇医药
E(HlyE, ClyA, SheA): X-ray crystal structure of the toxin and observation of membrane pores by electron microscopy.
Cell 2000;100:265-276
6 Atkins A, Wyborn NR, Wallace AJ, Stillman TJ, Black LK, Fielding AB, Hisakado M, Artymiuk PJ, Green J.
Structure-function relationships of a novel bacterial toxin, hemolysin E. The role of alpha G. J Biol Chem 2000;
, 百拇医药 275:41150-41155
7 Galen JE, Levine MM. Can a flawless live vector vaccine strain be engineered? Trends Microbiol
2001;9:372-376
8 Sutton P, Wilson J, Lee A. Further development of the Helicobacter pylori mouse vaccination model. Vaccine
2000;18:2677-2685
编辑 潘伯荣 审读 张海宁, 百拇医药( 焦志勇,陈旻湖,朱森林,李国庆,胡品津)
陈旻湖,朱森林,李国庆, 胡品津,中山大学附属第一医院消化内科 广东省广州市 510080
2000年度教育部骨干教师基金
2002年广东省自然科学基金重点项目, No. 021898
通讯作者:陈旻湖, 510080, 广东省广州市, 中山大学附属第一医院消化内科. chenminhu@gzsums.edu.cn
电话: 020-87755766-8172
收稿日期: 2004-11-23 接受日期: 2004-12-09
, 百拇医药
摘要
目的:建立表达幽门螺杆菌(Hpylori)尿素酶B亚单位(UreB)与血溶素E(hlyE)融合蛋白的减毒沙门疫苗菌，并利用H pylori小鼠感染模型，研究该疫苗菌对H pylori感染的免疫保护作用.
方法:利用分子克隆技术构建携带ureB/hlyE融合基因的重组原核表达质粒pTrc99A-ureB/hlyE，经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列，并与GeneBank中相关序列进行同源性比较.pTrc99A-ureB/hlyE转化减毒伤寒沙门菌SL3261，培养后筛选阳性菌落，抽提质粒进行PCR及酶切鉴定.表达的UreB/hlyE融合蛋白SDS-PAGE电泳和Western-blotting进行鉴定，薄层扫描分析蛋白含量.实验小鼠随机分成4组，分别灌胃给予生理盐水组、减毒鼠伤寒沙门菌SL3261组、携带pTrc99A-ureB的SL3261组、携带 pTrc99A-ureB/hlyE的SL3261组.免疫后4 wk，予H pylori 107CFU/只进行攻击(生理盐水组不攻击).攻击4 wk后处死动物，取胃组织分别行改良Giemsa染色及定量细菌培养，观察H pylori定植情况.
, 百拇医药
结果:核苷酸序列测定及同源性分析证实，原核表达质粒pTrc99A-ureB/hlyE中所含的H pylori -ureB及hlyE基因与GeneBank中的H pylori-ureB和hlyE基因同源性分别为97.42%(1 663/1 707)、99.78%(910/912).重组减毒沙门氏菌可表达约100 ku的融合蛋白UreB/hlyE，含量占全菌体蛋白含量的15%;表达的融合蛋白能与小鼠抗H pylori血清特异性反应，具有良好的免疫原性.动物实验证实，疫苗组同空白对照组和SL3261组相比，H pylori定植密度明显下降，有显著性差异(P<0.05).表达UreB/hly蛋白的疫苗株组同表达UreB蛋白的疫苗株相比，H pylori定植密度明显下降，差异有统计学意义(P<0.05).
结论:重组疫苗菌对小鼠H pylori感染具有一定免疫预防作用，hlyE可以增强疫苗株的免疫保护效果.
, http://www.100md.com
焦志勇, 陈旻湖, 朱森林, 李国庆, 胡品津. 表达ureB/hlyE融合蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌预防幽门螺旋杆菌感染. 世界华人消化杂志 2005;13(6):787-789 (PDF) 携带H pylori-ureB/hlyE基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与鉴定. 1，5ureB and hlyE amplified respectively from recombinant pTrc99A-ureB/hlyE.2，6 negative control PCR;3，7 recombinant pTrc99A-ureB/hlyE digested by Nco I-SalI and Sal I -Hind III;4 molecular standard 100 bpladders.
2.2 重组质粒pTrc99A-ureB/hlyE的测序和同源性分析重组质粒pTrc99A-ureB/hlyE测序及同源性分析，结果表明重组质粒pTrc99A-ureB/hlyE中的ureB和hlyE与基因文库中H pylori ureB和hlyE同源性分别为97.42%(1 663/1707)和99.78%(910/912).蛋白同源性分别为97.68%(295/302)和99.65%(567/569).
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2.3 重组质粒pTrc99A-ureB/hlyE在SL3261中的表达重组减毒鼠伤寒沙门氏菌菌体蛋白在100 ku左右出现一新生蛋白带，与推测的UreB/hlyE融合蛋白分子量相符，对照空菌及转化空质粒的细菌菌体蛋白中无该条蛋白带，薄层扫描分析显示:UreB/hlyE融合蛋白占菌体蛋白总量的15.5%(图2).Western-blotting结果表明，目的蛋白能与小鼠抗H pylori血清免疫着色(图3).
图2 (PDF) 融合蛋白UreB/hlyE在SL3261中的表达. 1:Protein marker(mr); 2: SL3261; 3，4: SL3261(pTrc99A); 5，6: SL3261(pTrc99A-ureB/hlyE).
图3 (PDF) 融合蛋白UreB/hlyE Western blotting结果. 1: Protein marker(mr); 2: SL3261; 3: SL3261(pTrc99A);4: SL3261(pTrc99A-ureB/hlyE).
, http://www.100md.com
2.4 疫苗株免疫保护效果各组动物的H pylori定量培养结果比较(表2)，A、B和C之间差异没有统计学意义(P>0.05);D、E同A、B和C相比，H pylori定植密度差异有统计学意义(P<0.05);D与E相比，H pylori定量培养菌落数显著减少，有统计学意义(P= 0.049).
表2 各组动物胃组织中H pylori的定量培养(CFU/g)
分组 | 动物数 | , 百拇医药 中位数 |
A空白对照组 | 8 | 160×105 |
B SL3261 | 10 | 126×105 |
C SL3261(pTrc99A) | 10 | 135×105 |
, 百拇医药 D SL3261(pTrc99A-ureB) | 10 | 24×105a |
E SL3261(pTrc99A-ureB/hlyE) | 10 | 3.5×105ac |
3 讨论
利用活减毒鼠伤寒沙门菌这种新型的口服疫苗载体释放系统与传统疫苗相比具有许多优点，如不必纯化抗原，不需佐剂，避免了抗原在胃内降解和变性[3].我们构建的表达H pylori ureB的减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗免疫动物取得了比较好的效果，保护率达50%[4].为了进一步增强减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗的免疫效果，我们利用分子克隆的方法，构建了表达ureB/hlyE融合蛋白的减毒沙门氏菌疫苗，UreB和hlyE的核苷酸序列与基因文库中相关序列的同源性为97.42%和99.78%.pTrc99A是一个高效原核表达载体，有强大的Trp/Lac杂合启动子，在化学诱导剂IPTG作用下表达所插入的基因.表达ureB/hlyE融合蛋白的减毒沙门氏菌疫苗在1 mmoL/L IPTG诱导下能够高效表达大小约为100 ku的融合蛋白.hlyE是大肠杆菌中一种可以促进孔道形成的毒素.可在细菌表面表达或分泌至细菌外并促进靶细胞膜上的孔道形成[5-6].Galenet al将伤寒杆菌的hlyE与SacB基因融合后，可在含150 g/l的乳糖固体培养基上生长，而SacB基因在肠道细菌胞内单独表达时，分解乳糖为葡萄糖后发酵导致细菌的死亡，说明此融合蛋白可通过hlyE的外排作用外排细菌表面或完全分泌到细菌周围.同时作者发现hlyE的外排作用还可以提高与之融合的蛋白的表达和免疫原性，疟疾原虫的MSP-1(19)蛋白在肠道细菌中很难表达，而与hlyE融合后不仅在减毒伤寒杆菌中表达良好而且可诱导特异性抗体的产生[7].组织H pylori定量培养可以比较准确地计数H pylorii菌落数，更全面敏感地评价组织H pylori定植水平[8].疫苗免疫小鼠的H pylori定量培养结果显示，表达UreB/hlyE融合蛋白重组减毒沙门菌疫苗株与表达ureB重组疫苗株相比，H pylori定量培养的菌落数少，差异有统计学意义(P= 0.049)，表达UreB/hlyE融合蛋白重组疫苗株的免疫保护效果高于表达ureB重组疫苗株，hlyE促进H pylori抗原的分泌表达，可以增强疫苗株的免疫保护作用.疫苗株免疫后的实验小鼠胃内H pylori定植水平虽然下降，但仍可培养出细菌，未出现无菌性免疫的效果.说明疫苗株只能明显减少胃内H pylori的定植，还不能完全清除H pylori;不过H pylori的减少也很有价值，因为H pylori定植水平与胃炎的严重程度和炎症细胞的浸润程度密切相关[8].本实验的结果证实表达ureB/hlyE融合基因的重组疫苗株可以预防H pylori的感染，减少胃内H pylori的定植水平;hlyE可增强重组疫苗株的免疫效果，可以作为提高此类疫苗免疫效果的一种方法.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Gomez-Duarte OG, Lucas B, Yan ZX, Panthel K, Haas R, Meyer TF. Protection of mice against gastric colonization
by Helicobacter pylori by single oral dose immunization with attenuated Salmonella typhimurium producing urease
subunits A and B. Vaccine 1998;16:460-471
2 del Castillo FJ, Leal SC, Moreno F, del Castillo I. The Escherichia coli K-12 sheA gene encodes a 34-kDa
, 百拇医药
secreted haemolysin. Mol Microbiol 1997;25:107-115
3 Gomez-Duarte OG, Bumann D, Meyer TF. The attenuated Salmonella vaccine approach for the control of
Helicobacter pylori-related diseases. Vaccine 1999;17:1667-1673
4 朱森林, 陈旻湖, 廖文俊, 陈洁, 胡品津. 表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的
构建和鉴定. 中华消化杂志 2001;21:526-529
5 Wallace AJ, Stillman TJ, Atkins A, Jamieson SJ, Bullough PA, Green J, Artymiuk PJ. E. coli hemolysin
, 百拇医药
E(HlyE, ClyA, SheA): X-ray crystal structure of the toxin and observation of membrane pores by electron microscopy.
Cell 2000;100:265-276
6 Atkins A, Wyborn NR, Wallace AJ, Stillman TJ, Black LK, Fielding AB, Hisakado M, Artymiuk PJ, Green J.
Structure-function relationships of a novel bacterial toxin, hemolysin E. The role of alpha G. J Biol Chem 2000;
, 百拇医药 275:41150-41155
7 Galen JE, Levine MM. Can a flawless live vector vaccine strain be engineered? Trends Microbiol
2001;9:372-376
8 Sutton P, Wilson J, Lee A. Further development of the Helicobacter pylori mouse vaccination model. Vaccine
2000;18:2677-2685
编辑 潘伯荣 审读 张海宁, 百拇医药( 焦志勇,陈旻湖,朱森林,李国庆,胡品津)
