富含RNA酶组织总RNA提取方法的改良
张传仓, 刘卫鹏, 朱德新, 杜江, 封志纯, 南方医科大学珠江医院儿科 广东省广州市 510282
通讯作者:封志纯, 510282, 广东省广州市工业大道中253号, 南方医科大学珠江医院儿科. zhjfengzc2000@yahoo.com.cn
电话: 020-61643369 传真: 020-61643369
收稿日期: 2005-01-29 接受日期: 2005-03-03
摘要
目的:简化富含RNA酶组织RNA的抽提方法.
, 百拇医药 方法:健康SD大鼠10只，随机分成液氮组及改良组，每组5只，用乙醚麻醉后，分别取胰腺组织约50 mg，液氮组组织迅速放入液氮中，改良组组织放入一预装RNAguard 100 mL的1.5 mL EP管中，放入-70℃冰箱保存.液氮组将胰腺组织从液氮中取出，立即放入预装适量液氮的研钵中迅速研磨至粉末(研磨过程中始终保持研钵内有适量液氮)，移入另一1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，按Trizol法提取总RNA;改良组取眼科剪在酒精灯上消毒后冷却，从-70℃冰箱中取出冻存的组织，在冰盒上，加入1 mL Trizol，用眼科剪迅速剪切3 min(剪切过程组织不解冻)，剧烈振荡混匀30 s，以后步骤按Trizol法.
结果:改良法抽提RNA的效果与液氮研磨法无显著差异(P>0.05)，但方法简单方便.
结论:改良法提取RNA简单方便，结果稳定，值得推广应用.
, 百拇医药
张传仓, 刘卫鹏, 朱德新, 杜江, 封志纯. 富含RNA酶组织总RNA提取方法的改良. 世界华人消化杂志 2005;13(7):797-799 (PDF) RNA琼脂糖变性胶电泳.M: DNA Marker; 1-5: 液氮组; 6-10: 改良组.
图2 (PDF)b-actin RT-PCR产物琼脂糖电泳.M: DNA Marker; 1-5: 液氮组; 6-10: 改良组.
3 讨论对大部分研究者来说，RNA抽提比基因组DNA抽提要困难得多.事实上，现有的RNA抽提方法，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA更方便，成功率也更高.但用于组织RNA的抽提，困难就比较大.
组织RNA抽提失败最常见的原因有两个:RNA降解和组织内杂质的残留，而前者则是重中之重.现有的RNA抽提试剂，都含有快速抑制RNA酶的成分.在培养细胞中加入裂解液，简单的振荡，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解.细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的RNA酶，所以RNA得以保持完整[2-4].而组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触，RNA酶的活性也就无法得到迅速充分的抑制.因此，如果在抑制RNA活性的同时使组织充分裂解，降解问题也就可以彻底解决了.液氮碾磨法[5]的出现，从根本上解决了这一问题.组织在液氮中研磨的过程中，RNA酶在低温环境中被完全抑制.但是，液氮碾磨方法非常麻烦，特别是碰到样品数比较多的时候更是如此.研究者不仅要把庞大的研钵进行高温处理，以灭活RNA酶，还要不厌其烦地取用液氮，一不小心就可能面临被液氮冻伤的危险，而且，一旦液氮添加不及时，组织就会化冻，导致RNA提取失败.有人采用电动匀浆器的方法[6-7]，期望利用其破碎组织的速度将组织在RNA被大量降解前被匀浆，但匀浆器方法并不能杜绝降解现象，而且，很重要的一点，必须有电动匀浆器.
, 百拇医药
面对以上问题，我们在实验过程中，对富含RNA酶组织总RNA抽提的方法进行了改良.首先，我们找到了一种保存组织的有效试剂—RNAguard.RNAguard是一种组织内源核酸酶的抑制剂，能快速抑制样品中的内源核酸酶活性，确保动物组织/细胞中的RNA在 37℃1 d不降解，25℃ 1 wk不降解，4℃1 mo不降解，-20℃ 1 a以上不降解.RNAguard适用的样品包括:动物组织，培养细胞，昆虫，及部分植物组织.经过RNAguard处理的样品可以用几乎所有常用的RNA方法/试剂抽提RNA，所有的操作与用新鲜组织没有什么不同(见RNAguard试剂说明书).我们将组织取出后，浸泡在适量RNAguard中，并迅速在-70℃冰箱中冻存，基本上保证了组织内RNA不被降解，以后随便什么时候做都可以，非常方便.而且，RNAguard非常便宜.对于每个样品，RNAguard的用量不能太多(本实验中用100 mL)，多了会影响裂解液的效果.但这个用量，在常温下无法保证RNA酶被完全抑制，必须将样品放入-70℃冰箱中冻存才能达到理想的效果.
, 百拇医药 组织的匀浆过程，是RNA提取成功与否的关键步骤，而彻底匀浆是提高获得率和降低降解的关键.我们采取了以下措施:(1)在-70℃冰箱中制作含有300 mL/L乙醇溶液的冰盒:因为在普通冰箱中制作的冰盒，温度不够低，无法保证组织在加入裂解液后不溶化;冰盒中含有300 mL/L的乙醇一方面可以使冰松软，EP管可以插入，以达到更好的冷冻效果，另一方面，乙醇可以有效抑制局部环境中的RNA酶，防止操作过程中的外源性污染.(2)用于组织剪切的眼科剪在使用前，必须放在酒精灯上充分灼烧，并完全冷却后使用.(3)剪切要迅速、充分，时间约需3-5 min，直至组织成均一的混悬液.(4)通过控制EP管插入冰中的时间，保持组织既不溶解，裂解液也不被冻结.当然，如果有条件，用电动匀浆器会比手工剪切效果更好.
总之，改良法在很大程度上简化了组织RNA抽提的过程，而且非常稳定，即使是从富含RNA酶的组织中提取RNA，其提取效率及RNA的完整性也可以达到理想的效果，值得推广应用.
4 参考文献1 董凌燕, 刘超, 张梅, 刘翠萍, 覃又文. 不同浓度葡萄糖对大鼠胰岛b细胞胰岛素基因表达的影响.
, 百拇医药
南京医科大学学报 2003;23:318-321
2 王晓谦. 大鼠心肌总RNA的提取. 河南科技大学学报(医学版) 2004;22:85-86
3 Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources
enriched in ribonuclease. Biochemistry 1979;18:5294-5299
4 Samuelson LC, Keller PR, Darlington GJ, Meisler MH. Glucocorticoid and developmental regulation of amylase mRNAs
, 百拇医药
in mouse liver cells. Mol Cell Biol 1988;8:3857-3863
5 Gadbois DM, Salo WL, Ann DK, Downing SW, Carlson DM. The preparation of poly(A)+ mRNA from the hagfish slime
gland. Prep Biochem 1988;18:67-76
6 张勇, 郭永章, 曹西南, 李立. 实验性胰腺炎大鼠胰腺总RNA的提取. 昆明医学院学报 2003;24:29-31
7 夏璐, 楼恺娴, 龚自华, 涂水平, 翟祖康, 袁耀宗, 徐家裕. 生长抑素类似物对急性胰腺炎大鼠胰腺组织
表皮生长因子基因表达的影响及其机制. 胃肠病学 2000;5:216-219
编辑 张海宁, 百拇医药( 张传仓,刘卫鹏, 朱德新,杜 江,封志纯)
通讯作者:封志纯, 510282, 广东省广州市工业大道中253号, 南方医科大学珠江医院儿科. zhjfengzc2000@yahoo.com.cn
电话: 020-61643369 传真: 020-61643369
收稿日期: 2005-01-29 接受日期: 2005-03-03
摘要
目的:简化富含RNA酶组织RNA的抽提方法.
, 百拇医药 方法:健康SD大鼠10只，随机分成液氮组及改良组，每组5只，用乙醚麻醉后，分别取胰腺组织约50 mg，液氮组组织迅速放入液氮中，改良组组织放入一预装RNAguard 100 mL的1.5 mL EP管中，放入-70℃冰箱保存.液氮组将胰腺组织从液氮中取出，立即放入预装适量液氮的研钵中迅速研磨至粉末(研磨过程中始终保持研钵内有适量液氮)，移入另一1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，按Trizol法提取总RNA;改良组取眼科剪在酒精灯上消毒后冷却，从-70℃冰箱中取出冻存的组织，在冰盒上，加入1 mL Trizol，用眼科剪迅速剪切3 min(剪切过程组织不解冻)，剧烈振荡混匀30 s，以后步骤按Trizol法.
结果:改良法抽提RNA的效果与液氮研磨法无显著差异(P>0.05)，但方法简单方便.
结论:改良法提取RNA简单方便，结果稳定，值得推广应用.
, 百拇医药
张传仓, 刘卫鹏, 朱德新, 杜江, 封志纯. 富含RNA酶组织总RNA提取方法的改良. 世界华人消化杂志 2005;13(7):797-799 (PDF) RNA琼脂糖变性胶电泳.M: DNA Marker; 1-5: 液氮组; 6-10: 改良组.
图2 (PDF)b-actin RT-PCR产物琼脂糖电泳.M: DNA Marker; 1-5: 液氮组; 6-10: 改良组.
3 讨论对大部分研究者来说，RNA抽提比基因组DNA抽提要困难得多.事实上，现有的RNA抽提方法，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA更方便，成功率也更高.但用于组织RNA的抽提，困难就比较大.
组织RNA抽提失败最常见的原因有两个:RNA降解和组织内杂质的残留，而前者则是重中之重.现有的RNA抽提试剂，都含有快速抑制RNA酶的成分.在培养细胞中加入裂解液，简单的振荡，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解.细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的RNA酶，所以RNA得以保持完整[2-4].而组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触，RNA酶的活性也就无法得到迅速充分的抑制.因此，如果在抑制RNA活性的同时使组织充分裂解，降解问题也就可以彻底解决了.液氮碾磨法[5]的出现，从根本上解决了这一问题.组织在液氮中研磨的过程中，RNA酶在低温环境中被完全抑制.但是，液氮碾磨方法非常麻烦，特别是碰到样品数比较多的时候更是如此.研究者不仅要把庞大的研钵进行高温处理，以灭活RNA酶，还要不厌其烦地取用液氮，一不小心就可能面临被液氮冻伤的危险，而且，一旦液氮添加不及时，组织就会化冻，导致RNA提取失败.有人采用电动匀浆器的方法[6-7]，期望利用其破碎组织的速度将组织在RNA被大量降解前被匀浆，但匀浆器方法并不能杜绝降解现象，而且，很重要的一点，必须有电动匀浆器.
, 百拇医药
面对以上问题，我们在实验过程中，对富含RNA酶组织总RNA抽提的方法进行了改良.首先，我们找到了一种保存组织的有效试剂—RNAguard.RNAguard是一种组织内源核酸酶的抑制剂，能快速抑制样品中的内源核酸酶活性，确保动物组织/细胞中的RNA在 37℃1 d不降解，25℃ 1 wk不降解，4℃1 mo不降解，-20℃ 1 a以上不降解.RNAguard适用的样品包括:动物组织，培养细胞，昆虫，及部分植物组织.经过RNAguard处理的样品可以用几乎所有常用的RNA方法/试剂抽提RNA，所有的操作与用新鲜组织没有什么不同(见RNAguard试剂说明书).我们将组织取出后，浸泡在适量RNAguard中，并迅速在-70℃冰箱中冻存，基本上保证了组织内RNA不被降解，以后随便什么时候做都可以，非常方便.而且，RNAguard非常便宜.对于每个样品，RNAguard的用量不能太多(本实验中用100 mL)，多了会影响裂解液的效果.但这个用量，在常温下无法保证RNA酶被完全抑制，必须将样品放入-70℃冰箱中冻存才能达到理想的效果.
, 百拇医药 组织的匀浆过程，是RNA提取成功与否的关键步骤，而彻底匀浆是提高获得率和降低降解的关键.我们采取了以下措施:(1)在-70℃冰箱中制作含有300 mL/L乙醇溶液的冰盒:因为在普通冰箱中制作的冰盒，温度不够低，无法保证组织在加入裂解液后不溶化;冰盒中含有300 mL/L的乙醇一方面可以使冰松软，EP管可以插入，以达到更好的冷冻效果，另一方面，乙醇可以有效抑制局部环境中的RNA酶，防止操作过程中的外源性污染.(2)用于组织剪切的眼科剪在使用前，必须放在酒精灯上充分灼烧，并完全冷却后使用.(3)剪切要迅速、充分，时间约需3-5 min，直至组织成均一的混悬液.(4)通过控制EP管插入冰中的时间，保持组织既不溶解，裂解液也不被冻结.当然，如果有条件，用电动匀浆器会比手工剪切效果更好.
总之，改良法在很大程度上简化了组织RNA抽提的过程，而且非常稳定，即使是从富含RNA酶的组织中提取RNA，其提取效率及RNA的完整性也可以达到理想的效果，值得推广应用.
4 参考文献1 董凌燕, 刘超, 张梅, 刘翠萍, 覃又文. 不同浓度葡萄糖对大鼠胰岛b细胞胰岛素基因表达的影响.
, 百拇医药
南京医科大学学报 2003;23:318-321
2 王晓谦. 大鼠心肌总RNA的提取. 河南科技大学学报(医学版) 2004;22:85-86
3 Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources
enriched in ribonuclease. Biochemistry 1979;18:5294-5299
4 Samuelson LC, Keller PR, Darlington GJ, Meisler MH. Glucocorticoid and developmental regulation of amylase mRNAs
, 百拇医药
in mouse liver cells. Mol Cell Biol 1988;8:3857-3863
5 Gadbois DM, Salo WL, Ann DK, Downing SW, Carlson DM. The preparation of poly(A)+ mRNA from the hagfish slime
gland. Prep Biochem 1988;18:67-76
6 张勇, 郭永章, 曹西南, 李立. 实验性胰腺炎大鼠胰腺总RNA的提取. 昆明医学院学报 2003;24:29-31
7 夏璐, 楼恺娴, 龚自华, 涂水平, 翟祖康, 袁耀宗, 徐家裕. 生长抑素类似物对急性胰腺炎大鼠胰腺组织
表皮生长因子基因表达的影响及其机制. 胃肠病学 2000;5:216-219
编辑 张海宁, 百拇医药( 张传仓,刘卫鹏, 朱德新,杜 江,封志纯)
