中国南方汉人IDUA基因KpnⅠ和D4S111两位点的多态性研究(基金项目)
基金项目:国家教委博士点基金资助课题(No.2000044)
【摘要】 目的 研究中国南方汉人IDUA基因KpnⅠ和D4S111两位点的遗传多态性及其传递规律，为今后的连锁分析打下基础。方法 采用PCR-RFLP和Amp-FLP技术，对162例无血缘关系的健康中国南方汉人的324条染色体和5个家系16位成员的32条染色体进行检测，然后用χ 2 检验进行统计学处理。结果 对于KpnⅠ位点，其等位基因A 1 (450bp)频率为0.17，等位基因A 2 (390bp+60bp)频率为0.83，杂合率为29%。对于D4S111位点，在162例无关个体中发现5个等位基因片段和9种基因型，等位基因片段长度为510～830bp，基因频率分布在0.0062～0.3580之间，PIC为0.6733，杂合性为0.7840。结论 中国南方汉人IDUA基因中KpnⅠ和D4S111两位点都具有高度多态性，其中KpnⅠ位点与国外的差异无显著性，而D4S111位点与国外高加索群体的则差异显著，其等位基因在世代中的传递均符合孟德尔遗传规律。
关键词 粘多糖贮积症Ⅰ型 IDUA基因 多态性 限制性片段长度 聚合酶链反应
Polymorphism analysis of the KpnⅠand D4S111loci in IDUA gene
of Chinese southern han population
Guo Yibin，Pan Jingxin，Guang Wei，et al.
Department of Medical Genetics，Sun Yatsen University，Guangzhou510080.
【Abstract】 Objective To investigate the genetic polymorphism of the loci(KpnⅠand D4S111)in theα-L-induroidase(IDUA)gene and to study the mode of transmission of alleles，and then to carry out the linkage analyˉses.Methods To analyze324chromosomes from162Chinese unrelated healthy han individuals and the genetypes of16members from five families by using PCR-RFLP and Amp-FLP.To statistically assess the differences of allele frequencies and heterzygosity between Chinese southern Han population and Caucasian one by usingχ 2 test.Results To the site of KpnⅠ，the frequency of allele1(A 1 ，450bp)is0.17，allele2(A 2 ，390plus60bp)is0.83and hetˉerozygosity is29%.To the locus of D4S111，five alleles ranging from510to830bp in size and nine different genoˉtypes were observed.The alleles frequencies were from0.0062to0.3580.The PIC was0.6733，and the heterozygosity was0.7840.Conclusion The loci of KpnⅠand D4S111in the IDUA gene from Chinese southern Han population have high polymorphism.The KpnⅠsite has no significant difference between Chinese southern Han population and Caucasion one，but D4S111locus has.The transmission of alleles of two loci from upper generation to lower one was completely agreement with the Mendelian gentic law.
Key words mucopolysaccharidosis typeⅠ IDUA gene polymorphism restriction fragment length polyˉmerse chain reaction(PCR)
粘多糖贮积症Ⅰ型(MPSⅠ)是一类由于α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-induroidase，IDUA)缺乏，导致患儿发育障碍，智力低下，骨骼畸形，脏器肿大的遗传性溶酶体病。编码此酶的IDUA基因的第2内含子含有D4S111位点，是一以约86bp为重复单位的数目可变串联重复(variable number tandem repeat，VNTR)序列 [1] ，而第3外显子和第2、第3部分内含子区域内则含有KpnⅠ位点 [2] ，它们均具有高度的多态性且与Huntington舞蹈病基因紧密连锁 [3，4] 。因此，利用这两个位点的遗传多态性，进行连锁分析，将有助于MPSⅠ型病和Huntington病携带者的检出及产前基因诊断。本文采用PCR-RFLP和Amp-FLP技术，对162例无亲缘关系的正常中国南方汉人的KpnⅠ位点和D4S111位点的遗传多态性进行了研究，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本 取居住广州地区，祖籍分别来自广东，广西，福建，江西，四川，海南，湖南，云南等地的无血缘关系的健康中国汉族个体162人的静脉血，其中男85人，女77人，用肝素抗凝。
1.1.2 引物及试剂 按文献 [2] 合成扩增IDUA基因内含KpnⅠ位点的450bp片段的一对引物。IK1:5′-AGG TCC TGC CTG GCTCCTGA-3′;IK2:5′-GGC TGG GAG CAG AGC CCA CA-3′。按文献 [3] 合成扩增D4S111位点VNTR的另一对引物。ID1:5′-TAG GTG TCT CCT CAG AGA GG-3′;ID2:5′-AGG ACC TGG TGG ACA CCT CA-3′。所用试剂除dNTPs，Taq DNA聚合酶(GENDA，加拿大)，100bp、123bp和1kb DNA ladder，KpnⅠ(GIBCO/BRL)，SDS，蛋白酶K，琼脂糖(Sigma)外，其余均为国产分析纯。
1.1.3 仪器 PCR热循环仪GC-1型(PE公司，美国)，紫外分光光度仪(Shimadzu UV-120-02，日本)，高速台式离心机(TGL-16，上海)。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及浓度测定 按我室常规方法进行 [5] 。
1.2.2 PCR扩增 反应体系为30μl，含10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，50mmol/L MgCl 2 ，0.1%Triton X-100，0.2mmol/L dNTP，上下游引物各20pmol以及0.2～0.5μg DNA模板，97℃变性5min后加2UTaq酶。对于KpnⅠ位点，扩增条件采用:95℃30s，68℃45s，72℃45s，35个循环，然后72℃继续保温7min。扩增片段大小为450bp。对于D4S111位点，扩增条件则采用:94℃45s，66℃60s，72℃75s，35个循环后72℃延伸5min。扩增片段从510～830bp不等。
1.2.3 扩增片段长度的判断 按Ludwg等 [6] 介绍的方法判断PCR扩增片段的长短(bp)。
1.2.4 多态性分析及数据处理
1.2.4.1 KpnⅠ位点的RFLP 450bp PCR产物含有KpnⅠ多态位点。该位点是由IDUA基因亮氨酸密码子的第一个碱基T变为C引起的 [7] 。450bp扩增产物经KpnⅠ酶切后产生390bp和60bp两个片段。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行快速检测，对有深、纯扩增带的样品直接进行KpnⅠ酶切分析。酶切反应采用:8μl PCR产物+2μl BSA(10×)+2μl NEB1(10×)+7.5μl dH 2 O+0.5μl KpnⅠ(10U/μl)，37℃酶解2～4h。
1.2.4.2 D4S111位点的VNTR 从凝胶上直接判读每个个体基因型，计算各等位片段频率。杂合度观察由样本基因型直接算出，无偏估测值(unbiased estimate)按n[1-∑(n i /n) 2 ]/(n-1)算出，n为样本等位片段总数，n i 为各等位片段数。多态信息含量(polymorphic information content，PIC)按1-∑f i2 统计，f为等位片段频率 [8] 。
1.2.4.3 统计学处理 采用χ 2 检验对观察到的基因型数与理论期望值间一致符合率进行统计学处理。
1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 对于KpnⅠ位点的检测，可配置8%聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis=49:1)。取2μl100bp ladder作为片段长度标准，取2.5μl PCR产物作为未切对照，取不同类型酶切产物及家系Ⅱ的酶切产物各5μl加样，调20mA电泳1h。而对于D4S111位点，可配置6%聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis=39:1)。各取2μl1kb和123bp DNA ladˉder作片段长度标准，取4μl PCR产物加样，进行电泳分离。
1.2.6 银染 电泳毕，将胶移入10%乙醇溶液中作用5min→换上1%HNO 3 溶液作用3min→用重蒸水洗两次，每次数, 百拇医药(郭奕斌 潘敬新 光 炜 林群娣 胡 彬 曾瑞萍)
【摘要】 目的 研究中国南方汉人IDUA基因KpnⅠ和D4S111两位点的遗传多态性及其传递规律，为今后的连锁分析打下基础。方法 采用PCR-RFLP和Amp-FLP技术，对162例无血缘关系的健康中国南方汉人的324条染色体和5个家系16位成员的32条染色体进行检测，然后用χ 2 检验进行统计学处理。结果 对于KpnⅠ位点，其等位基因A 1 (450bp)频率为0.17，等位基因A 2 (390bp+60bp)频率为0.83，杂合率为29%。对于D4S111位点，在162例无关个体中发现5个等位基因片段和9种基因型，等位基因片段长度为510～830bp，基因频率分布在0.0062～0.3580之间，PIC为0.6733，杂合性为0.7840。结论 中国南方汉人IDUA基因中KpnⅠ和D4S111两位点都具有高度多态性，其中KpnⅠ位点与国外的差异无显著性，而D4S111位点与国外高加索群体的则差异显著，其等位基因在世代中的传递均符合孟德尔遗传规律。
关键词 粘多糖贮积症Ⅰ型 IDUA基因 多态性 限制性片段长度 聚合酶链反应
Polymorphism analysis of the KpnⅠand D4S111loci in IDUA gene
of Chinese southern han population
Guo Yibin，Pan Jingxin，Guang Wei，et al.
Department of Medical Genetics，Sun Yatsen University，Guangzhou510080.
【Abstract】 Objective To investigate the genetic polymorphism of the loci(KpnⅠand D4S111)in theα-L-induroidase(IDUA)gene and to study the mode of transmission of alleles，and then to carry out the linkage analyˉses.Methods To analyze324chromosomes from162Chinese unrelated healthy han individuals and the genetypes of16members from five families by using PCR-RFLP and Amp-FLP.To statistically assess the differences of allele frequencies and heterzygosity between Chinese southern Han population and Caucasian one by usingχ 2 test.Results To the site of KpnⅠ，the frequency of allele1(A 1 ，450bp)is0.17，allele2(A 2 ，390plus60bp)is0.83and hetˉerozygosity is29%.To the locus of D4S111，five alleles ranging from510to830bp in size and nine different genoˉtypes were observed.The alleles frequencies were from0.0062to0.3580.The PIC was0.6733，and the heterozygosity was0.7840.Conclusion The loci of KpnⅠand D4S111in the IDUA gene from Chinese southern Han population have high polymorphism.The KpnⅠsite has no significant difference between Chinese southern Han population and Caucasion one，but D4S111locus has.The transmission of alleles of two loci from upper generation to lower one was completely agreement with the Mendelian gentic law.
Key words mucopolysaccharidosis typeⅠ IDUA gene polymorphism restriction fragment length polyˉmerse chain reaction(PCR)
粘多糖贮积症Ⅰ型(MPSⅠ)是一类由于α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-induroidase，IDUA)缺乏，导致患儿发育障碍，智力低下，骨骼畸形，脏器肿大的遗传性溶酶体病。编码此酶的IDUA基因的第2内含子含有D4S111位点，是一以约86bp为重复单位的数目可变串联重复(variable number tandem repeat，VNTR)序列 [1] ，而第3外显子和第2、第3部分内含子区域内则含有KpnⅠ位点 [2] ，它们均具有高度的多态性且与Huntington舞蹈病基因紧密连锁 [3，4] 。因此，利用这两个位点的遗传多态性，进行连锁分析，将有助于MPSⅠ型病和Huntington病携带者的检出及产前基因诊断。本文采用PCR-RFLP和Amp-FLP技术，对162例无亲缘关系的正常中国南方汉人的KpnⅠ位点和D4S111位点的遗传多态性进行了研究，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本 取居住广州地区，祖籍分别来自广东，广西，福建，江西，四川，海南，湖南，云南等地的无血缘关系的健康中国汉族个体162人的静脉血，其中男85人，女77人，用肝素抗凝。
1.1.2 引物及试剂 按文献 [2] 合成扩增IDUA基因内含KpnⅠ位点的450bp片段的一对引物。IK1:5′-AGG TCC TGC CTG GCTCCTGA-3′;IK2:5′-GGC TGG GAG CAG AGC CCA CA-3′。按文献 [3] 合成扩增D4S111位点VNTR的另一对引物。ID1:5′-TAG GTG TCT CCT CAG AGA GG-3′;ID2:5′-AGG ACC TGG TGG ACA CCT CA-3′。所用试剂除dNTPs，Taq DNA聚合酶(GENDA，加拿大)，100bp、123bp和1kb DNA ladder，KpnⅠ(GIBCO/BRL)，SDS，蛋白酶K，琼脂糖(Sigma)外，其余均为国产分析纯。
1.1.3 仪器 PCR热循环仪GC-1型(PE公司，美国)，紫外分光光度仪(Shimadzu UV-120-02，日本)，高速台式离心机(TGL-16，上海)。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及浓度测定 按我室常规方法进行 [5] 。
1.2.2 PCR扩增 反应体系为30μl，含10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，50mmol/L MgCl 2 ，0.1%Triton X-100，0.2mmol/L dNTP，上下游引物各20pmol以及0.2～0.5μg DNA模板，97℃变性5min后加2UTaq酶。对于KpnⅠ位点，扩增条件采用:95℃30s，68℃45s，72℃45s，35个循环，然后72℃继续保温7min。扩增片段大小为450bp。对于D4S111位点，扩增条件则采用:94℃45s，66℃60s，72℃75s，35个循环后72℃延伸5min。扩增片段从510～830bp不等。
1.2.3 扩增片段长度的判断 按Ludwg等 [6] 介绍的方法判断PCR扩增片段的长短(bp)。
1.2.4 多态性分析及数据处理
1.2.4.1 KpnⅠ位点的RFLP 450bp PCR产物含有KpnⅠ多态位点。该位点是由IDUA基因亮氨酸密码子的第一个碱基T变为C引起的 [7] 。450bp扩增产物经KpnⅠ酶切后产生390bp和60bp两个片段。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行快速检测，对有深、纯扩增带的样品直接进行KpnⅠ酶切分析。酶切反应采用:8μl PCR产物+2μl BSA(10×)+2μl NEB1(10×)+7.5μl dH 2 O+0.5μl KpnⅠ(10U/μl)，37℃酶解2～4h。
1.2.4.2 D4S111位点的VNTR 从凝胶上直接判读每个个体基因型，计算各等位片段频率。杂合度观察由样本基因型直接算出，无偏估测值(unbiased estimate)按n[1-∑(n i /n) 2 ]/(n-1)算出，n为样本等位片段总数，n i 为各等位片段数。多态信息含量(polymorphic information content，PIC)按1-∑f i2 统计，f为等位片段频率 [8] 。
1.2.4.3 统计学处理 采用χ 2 检验对观察到的基因型数与理论期望值间一致符合率进行统计学处理。
1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 对于KpnⅠ位点的检测，可配置8%聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis=49:1)。取2μl100bp ladder作为片段长度标准，取2.5μl PCR产物作为未切对照，取不同类型酶切产物及家系Ⅱ的酶切产物各5μl加样，调20mA电泳1h。而对于D4S111位点，可配置6%聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis=39:1)。各取2μl1kb和123bp DNA ladˉder作片段长度标准，取4μl PCR产物加样，进行电泳分离。
1.2.6 银染 电泳毕，将胶移入10%乙醇溶液中作用5min→换上1%HNO 3 溶液作用3min→用重蒸水洗两次，每次数, 百拇医药(郭奕斌 潘敬新 光 炜 林群娣 胡 彬 曾瑞萍)