氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞产生转化生长因子β1的影响
【摘要】 目的 观察氧化苦参碱对传代大鼠肝星状细胞自分泌产生TGFβ 1 的影响。方法 用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流消化正常大鼠肝脏，Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞并传一代，药物作用于传代HSC，以貂肺上皮细胞(Mv-1-Lu)生长抑制MTT法检测培养上清中TGFβ 1 活性及分泌总量，并抽取HSC的mRNA，RT-PCR半定量分析药物对HSC TGFβ 1 mRNA的表达。结果 氧化苦参碱可减少HSC TGFβ 1 的分泌总量，并抑制TGFβ 1 的活化及mRNA的表达。结论 氧化苦参碱能抑制肝星状细胞TGFβ 1 产生并活化可能是与其具有抗肝纤维化的作用有关。
关键词 氧化苦参碱 肝纤维化 肝星状细胞 TGFβ 1 mRNA
Effect of Oxymatrine on the production of transforming
growth factorβ 1 (TGFβ 1 )in hepatic stellate cells
Lu Qing，Zhang Jiming，Yin Youkuan，et al.
Hua Shan Hospital Affiliated Fu-Da Univtrsty，Shanghai100090.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Oxmatrine on the autocrine of transforming growth factorβ 1 (TGFβ 1 )in hepatic stellate cells(HSC).Methods HSCs were isolated and cultured from the liver of normal rat by in situ perfusion with pronase and collagenase and the density gradient centrifugation with Nycodens.The TGFβ 1 activity and total content in the supernatant of culture was measured by mink lung epithelial cell(Mv-1-Lu)proliferation inˉhibition MTT assay.TGFβ 1 mRNA expression of HSC was detected by RT-PCR.Results Qxymatrine can decrease the total content of TGFβ 1 in the supernatant，inhibit its activation and the mRNA expression of TGFβ 1 respectively.Conclusion Oxymatrine may inhibit the production of TGFβ 1 in HSC and its activation，and may be association with its antifibrotic action.
Key words Oxymatrine liver fibrosis hepatic stellate cells TGFβ 1 mRNA
现在已知，TGFβ 1 是目前最强有力的肝纤维化促进因子之一 [1] ，体内外实验均证明TGFβ 1 可促进ECM合成和沉积。肝星状细胞自分泌TGFβ 1 ，进而促进ECM和TGFβ 1 的生成，具有自分泌扩增的放大效应。氧化苦参碱(Oxymaˉtrine，Oxy)是从中药苦豆子和苦参根中提取的生物碱，我们发现其对大鼠肝星状细胞增殖有抑制作用 [2] 。本文采用氧化苦参碱作用于传代的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)，观察其HSC自分泌TGFβ 1 的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物和细胞株 Wistar雄性大鼠，体重400～450g，购自上海中医药大学动物中心。貂肺上皮细胞株-Mv-1-Lu(mink lung epithelial cell)购自中科院上海细胞生物研究所。
1.1.2 主要试剂和仪器 PronaseE，Nycodenz，Ⅳ型胶原酶、DNA酶Ⅰ(Sigma公司产品)，199培养液干粉、DMEM培养液干粉(GIBCO公司)，噻唑蓝(MTT)均购自华美生物工程公司。Waston-Marlow101U型恒流泵，Labsystem多功能酶标仪。
1.1.3 氧化苦参碱(Oxymatrine，Oxy) 分子式:C 15 H 24 N 2 O 2 分子量:264.4。本实验所用氧化苦参碱为白色结晶，纯度>97%，由宁夏绿谷药业有限公司惠赠。
1.1.4 PCR引物 参照文献 [3] 方法，由上海生工生物工程有限公司合成并纯化。
1.2 方法
1.2.1 HSC的分离培养 用改良Friedman方法 [4] ，以0.015%胶原酶和1%链酶蛋白酶原位消化正常大鼠肝脏，以12%的Nycodenz行密度梯度离心，获取肝星状细胞;以含10%小牛血清的199培养液，在含5%CO 2 潮湿空气的培养箱中培养。细胞长满单层后，经胰蛋白酶消化并传一代培养。
1.2.2 TGFβ 1 生物学检测法 [5]
1.2.2.1 样本收集与酸化 传代细胞在24孔板中长至近单层时，培养的各组待测细胞与相应的药物(药物浓度为10 -3 、10 -4 mmol/L)温育24h，温育充分后换成无血清培养液继续温育24h，经无菌操作收集培养上清于1.5ml EP管中，-70℃保存。使用前进行一次性酸化处理，方法为:每50μl样本加入1μl1N的HCl混匀，使样本pH值达2～3，15min后以等量1N的NaOH中和，将样品pH值调至7.3～7.4。
1.2.2.2 TGFβ 1 生物学检测法 复苏冻存的貂肺上皮细胞(Mv-1-Lu)，于37℃、5%CO 2 -95%潮湿空气的CO 2 培养箱内培养数天。待细胞长成亚单层后用0.25%胰酶-EDˉTA消化细胞，离心洗涤，以2%NBS DMEM培养液调整细胞浓度为1×10 5 cells/ml，按50μl/孔接种于96孔板，每组设4个复孔，培养箱内培养1h，然后每孔再加入50μl用DMEM稀释的待测样品(每孔的NBS终浓度为1%)，继续培养48～72h。加入0.5%MTT溶液10μl，再温育4h。小心吸尽上清，每孔加酸性异丙醇100μl，室温轻柔振荡10min以溶解细胞内深蓝色结晶物，酶标仪570nm处测吸光度(Absorbenˉcy，A)值，计算细胞生长抑制率。
1.2.2.3 TGFβ 1 mRNA分析 经药物培养液作用48h，收集细胞，采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA [6] 。采用Promega公司“Access RT-PCR system试剂盒，RT-PCR扩增TGFβ 1 及β-actin基因片段，具体操作按试剂盒所附说明进行。在扩增TGFβ 1 转录产物的同时，扩增β-actin的基因产物。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外透射反射仪下图像摄入，分析其积分光密度，以TGFβ 1 与β-actin条带光密度比值作为TGFβ 1 mRNA的相对表达量。
1.3 统计方法 计量资料以均数(X)±标准差(s)表示，两 组间均数比较用成组t检验，多组间的均数比较用单因素方差分析，方差分析结果显示组间均数差别有统计学意义时(P<0.05)，进一步用bonferroni法作两两比较。同时考虑浓度和分组作用时，用两因素方差分析。
2 结果
2.1 氧化苦参碱对活性型HSC TGFβ 1 分泌的影响
2.1.1 未酸化的培养上清对Mv-1-Lu细胞的增殖抑制率反映的是标本中TGFβ 1 的活性型，氧化苦参碱对传代HSC分泌的活性型TGFβ 1 有明显的抑制作用，但未见有剂量依赖效应。见表1。
2.1.2 酸化后的培养上清对Mv-1-Lu细胞的增殖抑制率反映的是标本中总TGFβ 1 含量，氧化苦参碱对传代HSC TGFβ 1 分泌总量有抑制作用(P<0.01)，未见有剂量依赖关系。见表2。
表1 氧化苦参碱对活性型TGFβ 1 含量的影响 (略)
表2 氧化苦参碱对TGFβ 1 分泌总量的影响(略)
2.2 氧化苦参碱对HSC TGFβ 1 mRNA表达的影响 用药组与对照组相比，药物对HSC TGFβ 1 mRNA的表达低于对照组(P<0.01)。
表3 氧化苦参碱对HSC TGFβ 1 mRNA表达的影响 (略)
3 讨论
现在已知，TGFβ 1 是目前最强有力的肝纤维化促进因子之一，体内外实验均证明TGFβ 1 可促进ECM合成;而拮 抗性的TGFβ 1 抗体可完全抑制这种促进作用，TGFβ 1 还可通过促进金属蛋白酶组织抑制物(Tissue inhibitor of me talloproˉteinase，TIMP)生成以降低组织金属蛋白酶活性而抑制ECM降解 [7] 。TGFβ1 是以无活性的潜在型从细胞中分泌到细胞外，潜在型TGFβ 1 由活性型TGFβ 1 与潜在型结合肽(Latency associated peptide，LAP)结合而成 [8] 。潜在型TGFβ 1 不具备生物活性，经细胞外基质中的蛋白酶作用切除LAP后转为活性型。通过抑制TGFβ 1 的分泌及阻止其由潜在型向活性型转化，可抑制HSC的胶原合成。本实验采用生物学方法检测TGFβ 1 ，Mv-1-Lu貂肺上皮细胞，其生长可以被TGFβ抑制，此法可以检测10pg/ml TGFβ。尽管TGFβ存在着不同的亚型，包括TGFβ 1 、TGFβ 2 、TGFβ 3 ，均可在HSC中存在，但在生物学方法检测中以TGFβ, http://www.100md.com(卢清 张继明 尹有宽 张清波 邬祥惠)
关键词 氧化苦参碱 肝纤维化 肝星状细胞 TGFβ 1 mRNA
Effect of Oxymatrine on the production of transforming
growth factorβ 1 (TGFβ 1 )in hepatic stellate cells
Lu Qing，Zhang Jiming，Yin Youkuan，et al.
Hua Shan Hospital Affiliated Fu-Da Univtrsty，Shanghai100090.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Oxmatrine on the autocrine of transforming growth factorβ 1 (TGFβ 1 )in hepatic stellate cells(HSC).Methods HSCs were isolated and cultured from the liver of normal rat by in situ perfusion with pronase and collagenase and the density gradient centrifugation with Nycodens.The TGFβ 1 activity and total content in the supernatant of culture was measured by mink lung epithelial cell(Mv-1-Lu)proliferation inˉhibition MTT assay.TGFβ 1 mRNA expression of HSC was detected by RT-PCR.Results Qxymatrine can decrease the total content of TGFβ 1 in the supernatant，inhibit its activation and the mRNA expression of TGFβ 1 respectively.Conclusion Oxymatrine may inhibit the production of TGFβ 1 in HSC and its activation，and may be association with its antifibrotic action.
Key words Oxymatrine liver fibrosis hepatic stellate cells TGFβ 1 mRNA
现在已知，TGFβ 1 是目前最强有力的肝纤维化促进因子之一 [1] ，体内外实验均证明TGFβ 1 可促进ECM合成和沉积。肝星状细胞自分泌TGFβ 1 ，进而促进ECM和TGFβ 1 的生成，具有自分泌扩增的放大效应。氧化苦参碱(Oxymaˉtrine，Oxy)是从中药苦豆子和苦参根中提取的生物碱，我们发现其对大鼠肝星状细胞增殖有抑制作用 [2] 。本文采用氧化苦参碱作用于传代的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)，观察其HSC自分泌TGFβ 1 的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物和细胞株 Wistar雄性大鼠，体重400～450g，购自上海中医药大学动物中心。貂肺上皮细胞株-Mv-1-Lu(mink lung epithelial cell)购自中科院上海细胞生物研究所。
1.1.2 主要试剂和仪器 PronaseE，Nycodenz，Ⅳ型胶原酶、DNA酶Ⅰ(Sigma公司产品)，199培养液干粉、DMEM培养液干粉(GIBCO公司)，噻唑蓝(MTT)均购自华美生物工程公司。Waston-Marlow101U型恒流泵，Labsystem多功能酶标仪。
1.1.3 氧化苦参碱(Oxymatrine，Oxy) 分子式:C 15 H 24 N 2 O 2 分子量:264.4。本实验所用氧化苦参碱为白色结晶，纯度>97%，由宁夏绿谷药业有限公司惠赠。
1.1.4 PCR引物 参照文献 [3] 方法，由上海生工生物工程有限公司合成并纯化。
1.2 方法
1.2.1 HSC的分离培养 用改良Friedman方法 [4] ，以0.015%胶原酶和1%链酶蛋白酶原位消化正常大鼠肝脏，以12%的Nycodenz行密度梯度离心，获取肝星状细胞;以含10%小牛血清的199培养液，在含5%CO 2 潮湿空气的培养箱中培养。细胞长满单层后，经胰蛋白酶消化并传一代培养。
1.2.2 TGFβ 1 生物学检测法 [5]
1.2.2.1 样本收集与酸化 传代细胞在24孔板中长至近单层时，培养的各组待测细胞与相应的药物(药物浓度为10 -3 、10 -4 mmol/L)温育24h，温育充分后换成无血清培养液继续温育24h，经无菌操作收集培养上清于1.5ml EP管中，-70℃保存。使用前进行一次性酸化处理，方法为:每50μl样本加入1μl1N的HCl混匀，使样本pH值达2～3，15min后以等量1N的NaOH中和，将样品pH值调至7.3～7.4。
1.2.2.2 TGFβ 1 生物学检测法 复苏冻存的貂肺上皮细胞(Mv-1-Lu)，于37℃、5%CO 2 -95%潮湿空气的CO 2 培养箱内培养数天。待细胞长成亚单层后用0.25%胰酶-EDˉTA消化细胞，离心洗涤，以2%NBS DMEM培养液调整细胞浓度为1×10 5 cells/ml，按50μl/孔接种于96孔板，每组设4个复孔，培养箱内培养1h，然后每孔再加入50μl用DMEM稀释的待测样品(每孔的NBS终浓度为1%)，继续培养48～72h。加入0.5%MTT溶液10μl，再温育4h。小心吸尽上清，每孔加酸性异丙醇100μl，室温轻柔振荡10min以溶解细胞内深蓝色结晶物，酶标仪570nm处测吸光度(Absorbenˉcy，A)值，计算细胞生长抑制率。
1.2.2.3 TGFβ 1 mRNA分析 经药物培养液作用48h，收集细胞，采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA [6] 。采用Promega公司“Access RT-PCR system试剂盒，RT-PCR扩增TGFβ 1 及β-actin基因片段，具体操作按试剂盒所附说明进行。在扩增TGFβ 1 转录产物的同时，扩增β-actin的基因产物。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外透射反射仪下图像摄入，分析其积分光密度，以TGFβ 1 与β-actin条带光密度比值作为TGFβ 1 mRNA的相对表达量。
1.3 统计方法 计量资料以均数(X)±标准差(s)表示，两 组间均数比较用成组t检验，多组间的均数比较用单因素方差分析，方差分析结果显示组间均数差别有统计学意义时(P<0.05)，进一步用bonferroni法作两两比较。同时考虑浓度和分组作用时，用两因素方差分析。
2 结果
2.1 氧化苦参碱对活性型HSC TGFβ 1 分泌的影响
2.1.1 未酸化的培养上清对Mv-1-Lu细胞的增殖抑制率反映的是标本中TGFβ 1 的活性型，氧化苦参碱对传代HSC分泌的活性型TGFβ 1 有明显的抑制作用，但未见有剂量依赖效应。见表1。
2.1.2 酸化后的培养上清对Mv-1-Lu细胞的增殖抑制率反映的是标本中总TGFβ 1 含量，氧化苦参碱对传代HSC TGFβ 1 分泌总量有抑制作用(P<0.01)，未见有剂量依赖关系。见表2。
表1 氧化苦参碱对活性型TGFβ 1 含量的影响 (略)
表2 氧化苦参碱对TGFβ 1 分泌总量的影响(略)
2.2 氧化苦参碱对HSC TGFβ 1 mRNA表达的影响 用药组与对照组相比，药物对HSC TGFβ 1 mRNA的表达低于对照组(P<0.01)。
表3 氧化苦参碱对HSC TGFβ 1 mRNA表达的影响 (略)
3 讨论
现在已知，TGFβ 1 是目前最强有力的肝纤维化促进因子之一，体内外实验均证明TGFβ 1 可促进ECM合成;而拮 抗性的TGFβ 1 抗体可完全抑制这种促进作用，TGFβ 1 还可通过促进金属蛋白酶组织抑制物(Tissue inhibitor of me talloproˉteinase，TIMP)生成以降低组织金属蛋白酶活性而抑制ECM降解 [7] 。TGFβ1 是以无活性的潜在型从细胞中分泌到细胞外，潜在型TGFβ 1 由活性型TGFβ 1 与潜在型结合肽(Latency associated peptide，LAP)结合而成 [8] 。潜在型TGFβ 1 不具备生物活性，经细胞外基质中的蛋白酶作用切除LAP后转为活性型。通过抑制TGFβ 1 的分泌及阻止其由潜在型向活性型转化，可抑制HSC的胶原合成。本实验采用生物学方法检测TGFβ 1 ，Mv-1-Lu貂肺上皮细胞，其生长可以被TGFβ抑制，此法可以检测10pg/ml TGFβ。尽管TGFβ存在着不同的亚型，包括TGFβ 1 、TGFβ 2 、TGFβ 3 ，均可在HSC中存在，但在生物学方法检测中以TGFβ, http://www.100md.com(卢清 张继明 尹有宽 张清波 邬祥惠)