Clostridium difficile细胞毒素B羧基末端功能区的克隆与表达
刘红升, 姜泊, 陈村龙, 陈学清, 广州南方医科大学南方医院消化病研究所 广东省广州市 510515
广州市科技攻关计划资助项目, No. 026G2434
通讯作者:刘红升, 510515, 广东省广州市, 广州南方医科大学南方医院消化病研究所. liuhs325@163.com
电话: 020-61365830
收稿日期: 2005-02-14 接受日期: 2005-03-22
摘要
目的:克隆并表达Clostridium difficile (C difficile)细胞毒素B羧基末端功能区基因，为探索高效的防治C difficile感染的疫苗和诊断抗原奠定基础.
, 百拇医药
方法:提取C difficile染色体基因，用PCR方法扩增Toxin B3基因，将其克隆至表达载体PET22b(+)，用重组质粒转化大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析.
结果:从C difficile基因组DNA中成功地克隆了毒素B的羧基末端重复区域的1 848 bp基因，经过双酶切、PCR和测序鉴定分析，插入到载体的基因与GenBank中公布的C difficile VPI10463的Toxin B3基因序列的同源性为99%.SDS-PAGE显示，目的基因表达产物的分子质量为71.3 ku，利用表达载体PET22b(+)表达出蛋白质，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%.
结论:含C difficile Toxin B3基因的PET22b(+)重组质粒能高效表达目的基因.该重组子的构建为Clostridium difficile相关性疾病的诊断及后期制备疫苗，提供了有力的保障.
, http://www.100md.com
刘红升, 姜泊, 陈村龙, 陈学清. Clostridium difficile细胞毒素B羧基末端功能区的克隆与表达. 世界华人消化杂志 2005;13(9):1136-1138
1 (PDF)CDB3基因的PCR产物、重组质粒和PET22b(+)载体用EcoRI单酶切的图谱. M: marker; 1: 重组质粒用EcoRI单酶切; 2: 重组质粒用EcoRI与XhoI双酶; 3: PET22b(+)载体用EcoRI单酶切，4: PCR产物.
2.3 诱导产物的SDS-PAGE 阳性克隆子在IPTG的诱导下，表达出的蛋白相对分子质量为71.3 ku，与预期的蛋白大小一致(图2)，凝胶自动扫描分析，其PET22b(+)CDB3重组蛋白占菌体总蛋白的34%，其中分泌表达占周质总蛋白的22.7%，可溶性表达占上清的14%，包涵体占沉淀的82.7%.
, http://www.100md.com
图2 (PDF) CDB3基因诱导表达产物的SDS-PAGE分析. M: 低分子质量的标准蛋白(97、66、43、31、20 ku); 1: 空大肠杆菌(BL21)经诱导作用的蛋白; 2: 含空PET22b(+)载体的BL21经诱导的蛋白; 3: 阳性克隆大肠杆菌在未诱导时的蛋白; 4、5、6:阳克隆大肠杆菌在IPTG诱导下1、3、4 h的蛋白.
3 讨论目前，在艰难梭菌相关性疾病(CDAD)的研究中发现，难辨梭菌产毒株主要产生的两种外毒素:毒素A(为分子质量308 ku的肠毒素)，毒素B(为分子质量270 ku的细胞毒素)[8].毒素A具有弱细胞毒作用，毒素B有极强的细胞毒性，为毒素A的10倍.动物模型已证明毒素A与B就是导致腹泻与肠炎症的原因，多数的C difficile产毒株均可以合成这两种毒素，而非产毒株艰难梭菌在临床上不具有致病性.但在动物模型中，毒素B必须在有小量的毒素A提前给予的情况下才具有致死性，因为毒素A必须和肠上皮细胞刷状缘上的受体相结合才能改变肠黏膜上皮细胞的电阻抗，进而改变其完整性，从而导致上皮细胞膜破坏，毒素B可进入肠上皮细胞，然而长期没有发现人类毒素B的受体[9].故上世纪90年代初以前一直认为毒素B仅在毒素A损伤肠黏膜细胞基础上而致病，因此对CDAD的诊断、预防的研究主要是针对C difficile 毒素A.但近十多年来在一些大的综合性医院出现的爆发性的CDAD流行中，经鉴定发现毒素A阴性而毒素B阳性的C difficile造成的，证实以前观点是不正确的[10-11].近年的研究发现，人肠黏膜细胞表面上，葡萄糖基变位受体是毒素B的受体，并据此假设毒素B无须毒素A先致人上皮细胞膜损害，即可进入细胞，并引起肠局限性炎症，致中性粒细胞聚集以及从中性粒细胞、巨噬细胞释放炎症递质[12-13].分子生物学研究表明，毒素B的氨基酸序列有3个显著结构:(1)位于毒素中央由疏水氨基酸组成并且具有高度保守性的序列，起跨膜、转运的作用.(2)位于C端的重复序列，起结合膜受体作用.(3)N端序列为毒素酶的作用及毒性作用区[14].Fredet al分别克隆并在大肠杆菌内表达了毒素B基因的3个氨基酸片段aa1-900，aa901-1750，aa1751-2366，发现毒素B酶活性作用和细胞毒性作用位于N’端.Genth et al[6]通过将毒素B分成3个片段CDB1、CDB2、CDB3，发现抗毒素B抗体与CDB3可以发生强烈反应，而与CDB1反应微弱，抗C difficile抗体既与CDB1又能与CDB3反应，CDB2则与两抗体均不反应，说明CDB3是良好的抗原.进一步实验发现，只有抗受体结合区域的抗体(抗CDB3抗体)才能保护完整细胞免受毒素B的细胞毒性攻击，而抗接触反应区的抗体(抗CDB1抗体)只有进入细胞内才能起保护作用.现有的研究表明，C difficile Toxin B3是一种理想的疫苗候选抗原.
, 百拇医药
目前，在C difficile感染的诊断中，传统实验室诊断的方法有细菌培养和组织培养检测毒素.细菌培养敏感，但时间长，缺乏特异性.组织培养敏感度、特异性都很高，但是受设备与技术水平的限制.而酶联免疫检测法则是缺乏组织培养条件的实验室首选方法，可以与组织培养相媲美，其优点是灵敏度和特异度高，并且几乎接近组织培养，快速、准确[15].Cdifficile抗毒素B抗体与CDB3可以发生强烈反应，故本研究为C difficile感染诊断抗原的研究也奠定了一定的基础.
我们参考C difficile国际标准株VPI 10463基因序列，用自行设计的CDB3引物在PCR反应中表现出较高的特异性，为理想的引物序列.在上、下游引物中分别加入EcoRI与XhoI酶切位点，保证了读码方向的正确性.为便于下一步的表达和纯化工作又将其装入了末端带有His标签的融合表达载体，酶切鉴定和测序结果显示获得了带有特异的C difficile CDB3基因.蛋白电泳分析表明获得了高效表达的C difficileToxinB3克隆株，ToxinB3重组蛋白占菌体总蛋白的34%，定位分析显示分泌表达占周质总蛋白的22.7%，可溶性表达占上清的14%，包涵体占沉淀的82.7%，为进一步研究C difficile相关性疾病的诊断和免疫保护作用奠定了重要的实验基础.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Bartlett J G. Clinical practice Antibiotic-associated diarrhea. NEngl J Med 2002;346:334-339
2 Kelly CP, Pothoulakis C, LaMont JT. Clostridium difficile colitis. NEngl J Med 1994;330:257-262
3 齐锡位, 刘世琴, 许晓. 抗生素相关性腹泻患者艰难梭菌的鉴定和敏感药物治疗.
第一军医大学分校学报 2002;25:88
4 Kink JA, Williams JA. Antibodies to recombinant Clostridiumdifficile toxin A and B are an effective treatment and
, 百拇医药
prevent relapse of C. difficile associateddisease in a hamster model of infection. Infect Immun 1998;66:2018-2025
5 Ward SJ, Douce G, Figueiredo D, Dougan G, Wren BW. Immunogenicityof a salmonella typhimurium aroA aroD
vaccine expressing a nontoxic domain ofClostridium difficile toxin A. Infect Immun 1999;67:2145-2152
6 Genth H, Selzer J, Busch C, Dumbach J, Hofmann F, Aktories K, JustI. New Method to generate enzymatically
, 百拇医药
deficient clostridium difficile toxin B asan antigen for immunization. Infect Immun 2000;68:1094-1101
7 杨晓强, 姜泊, 孙勇, 王继德. 艰难梭菌毒素基因3’末端重复区域基因片段的PCR克隆.
第一军医大学学报 2002;22:791-793
8 von Eichel-Streiber C, Laufenberg-Feldmann R, Sartingen S, SchulzeJ, Sauerborn M. Comparative sequence analysis
of the clostridium difficile toxins A andB. MolGen Genet 1992;233:260-268
, 百拇医药
9 Neunlist M, Barouk J, Michel K, Just I, Oreshkova T, Schemann M,Galmiche JP. Toxin B ofClostridium difficile
activates human VIP submucosal neurons, inpart via an IL-1beta-dependent pathway.
Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol 2003;285:G1049-1055
10 Moncrief JS, Zheng L, Neville LM, Lyerly DM. Geneticcharacterization of toxin A-negative, toxin B-positive Clostridium
, http://www.100md.com
difficile isolates by PCR. J ClinMicrobiol 2000;38:3072-3075
11 Limaye AP, Turgeon DK, Cookson BT, Fritsche TR. Pseudo-membranouscolitis caused by a toxin A (-) B (+) strain of
Clostridium difficile. J ClinMicrobiol 2000;38:1696-1697
12 Mitty RD, LaMont JT. Clostridium difficile diarrhea: pathogenesis,epidemiology and treatment.
Gastroenterologist 1994;2:61-69
, http://www.100md.com
13 Miller PD, Pothoulakis C, Baeker TR, LaMont JT, Rothstein TL.Macrophage-dependent stimulation of T cell depleted
spleen cells by Clostridium difficiletoxin A and calcium ionophore. Cell Immunol 1990;126:155-163
14 Hofmann F, Busch C, Prepens U, Just I, Aktories K. Localization ofthe Glucosyltransferase activity or Clostridium
difficile Toxin B to the N-terminalpart of the holotoxin. J Biol Chem 1997;272:11074-11078
15 Wilkins TD, Lyerly DM. Clostridium difficile testing:after 20years, still challenging. J Clin Microbiol 2003;41:531-534
编辑 张海宁, 百拇医药( 刘红升,姜 泊,陈村龙, 陈学清)
广州市科技攻关计划资助项目, No. 026G2434
通讯作者:刘红升, 510515, 广东省广州市, 广州南方医科大学南方医院消化病研究所. liuhs325@163.com
电话: 020-61365830
收稿日期: 2005-02-14 接受日期: 2005-03-22
摘要
目的:克隆并表达Clostridium difficile (C difficile)细胞毒素B羧基末端功能区基因，为探索高效的防治C difficile感染的疫苗和诊断抗原奠定基础.
, 百拇医药
方法:提取C difficile染色体基因，用PCR方法扩增Toxin B3基因，将其克隆至表达载体PET22b(+)，用重组质粒转化大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析.
结果:从C difficile基因组DNA中成功地克隆了毒素B的羧基末端重复区域的1 848 bp基因，经过双酶切、PCR和测序鉴定分析，插入到载体的基因与GenBank中公布的C difficile VPI10463的Toxin B3基因序列的同源性为99%.SDS-PAGE显示，目的基因表达产物的分子质量为71.3 ku，利用表达载体PET22b(+)表达出蛋白质，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%.
结论:含C difficile Toxin B3基因的PET22b(+)重组质粒能高效表达目的基因.该重组子的构建为Clostridium difficile相关性疾病的诊断及后期制备疫苗，提供了有力的保障.
, http://www.100md.com
刘红升, 姜泊, 陈村龙, 陈学清. Clostridium difficile细胞毒素B羧基末端功能区的克隆与表达. 世界华人消化杂志 2005;13(9):1136-1138
1 (PDF)CDB3基因的PCR产物、重组质粒和PET22b(+)载体用EcoRI单酶切的图谱. M: marker; 1: 重组质粒用EcoRI单酶切; 2: 重组质粒用EcoRI与XhoI双酶; 3: PET22b(+)载体用EcoRI单酶切，4: PCR产物.
2.3 诱导产物的SDS-PAGE 阳性克隆子在IPTG的诱导下，表达出的蛋白相对分子质量为71.3 ku，与预期的蛋白大小一致(图2)，凝胶自动扫描分析，其PET22b(+)CDB3重组蛋白占菌体总蛋白的34%，其中分泌表达占周质总蛋白的22.7%，可溶性表达占上清的14%，包涵体占沉淀的82.7%.
, http://www.100md.com
图2 (PDF) CDB3基因诱导表达产物的SDS-PAGE分析. M: 低分子质量的标准蛋白(97、66、43、31、20 ku); 1: 空大肠杆菌(BL21)经诱导作用的蛋白; 2: 含空PET22b(+)载体的BL21经诱导的蛋白; 3: 阳性克隆大肠杆菌在未诱导时的蛋白; 4、5、6:阳克隆大肠杆菌在IPTG诱导下1、3、4 h的蛋白.
3 讨论目前，在艰难梭菌相关性疾病(CDAD)的研究中发现，难辨梭菌产毒株主要产生的两种外毒素:毒素A(为分子质量308 ku的肠毒素)，毒素B(为分子质量270 ku的细胞毒素)[8].毒素A具有弱细胞毒作用，毒素B有极强的细胞毒性，为毒素A的10倍.动物模型已证明毒素A与B就是导致腹泻与肠炎症的原因，多数的C difficile产毒株均可以合成这两种毒素，而非产毒株艰难梭菌在临床上不具有致病性.但在动物模型中，毒素B必须在有小量的毒素A提前给予的情况下才具有致死性，因为毒素A必须和肠上皮细胞刷状缘上的受体相结合才能改变肠黏膜上皮细胞的电阻抗，进而改变其完整性，从而导致上皮细胞膜破坏，毒素B可进入肠上皮细胞，然而长期没有发现人类毒素B的受体[9].故上世纪90年代初以前一直认为毒素B仅在毒素A损伤肠黏膜细胞基础上而致病，因此对CDAD的诊断、预防的研究主要是针对C difficile 毒素A.但近十多年来在一些大的综合性医院出现的爆发性的CDAD流行中，经鉴定发现毒素A阴性而毒素B阳性的C difficile造成的，证实以前观点是不正确的[10-11].近年的研究发现，人肠黏膜细胞表面上，葡萄糖基变位受体是毒素B的受体，并据此假设毒素B无须毒素A先致人上皮细胞膜损害，即可进入细胞，并引起肠局限性炎症，致中性粒细胞聚集以及从中性粒细胞、巨噬细胞释放炎症递质[12-13].分子生物学研究表明，毒素B的氨基酸序列有3个显著结构:(1)位于毒素中央由疏水氨基酸组成并且具有高度保守性的序列，起跨膜、转运的作用.(2)位于C端的重复序列，起结合膜受体作用.(3)N端序列为毒素酶的作用及毒性作用区[14].Fredet al分别克隆并在大肠杆菌内表达了毒素B基因的3个氨基酸片段aa1-900，aa901-1750，aa1751-2366，发现毒素B酶活性作用和细胞毒性作用位于N’端.Genth et al[6]通过将毒素B分成3个片段CDB1、CDB2、CDB3，发现抗毒素B抗体与CDB3可以发生强烈反应，而与CDB1反应微弱，抗C difficile抗体既与CDB1又能与CDB3反应，CDB2则与两抗体均不反应，说明CDB3是良好的抗原.进一步实验发现，只有抗受体结合区域的抗体(抗CDB3抗体)才能保护完整细胞免受毒素B的细胞毒性攻击，而抗接触反应区的抗体(抗CDB1抗体)只有进入细胞内才能起保护作用.现有的研究表明，C difficile Toxin B3是一种理想的疫苗候选抗原.
, 百拇医药
目前，在C difficile感染的诊断中，传统实验室诊断的方法有细菌培养和组织培养检测毒素.细菌培养敏感，但时间长，缺乏特异性.组织培养敏感度、特异性都很高，但是受设备与技术水平的限制.而酶联免疫检测法则是缺乏组织培养条件的实验室首选方法，可以与组织培养相媲美，其优点是灵敏度和特异度高，并且几乎接近组织培养，快速、准确[15].Cdifficile抗毒素B抗体与CDB3可以发生强烈反应，故本研究为C difficile感染诊断抗原的研究也奠定了一定的基础.
我们参考C difficile国际标准株VPI 10463基因序列，用自行设计的CDB3引物在PCR反应中表现出较高的特异性，为理想的引物序列.在上、下游引物中分别加入EcoRI与XhoI酶切位点，保证了读码方向的正确性.为便于下一步的表达和纯化工作又将其装入了末端带有His标签的融合表达载体，酶切鉴定和测序结果显示获得了带有特异的C difficile CDB3基因.蛋白电泳分析表明获得了高效表达的C difficileToxinB3克隆株，ToxinB3重组蛋白占菌体总蛋白的34%，定位分析显示分泌表达占周质总蛋白的22.7%，可溶性表达占上清的14%，包涵体占沉淀的82.7%，为进一步研究C difficile相关性疾病的诊断和免疫保护作用奠定了重要的实验基础.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Bartlett J G. Clinical practice Antibiotic-associated diarrhea. NEngl J Med 2002;346:334-339
2 Kelly CP, Pothoulakis C, LaMont JT. Clostridium difficile colitis. NEngl J Med 1994;330:257-262
3 齐锡位, 刘世琴, 许晓. 抗生素相关性腹泻患者艰难梭菌的鉴定和敏感药物治疗.
第一军医大学分校学报 2002;25:88
4 Kink JA, Williams JA. Antibodies to recombinant Clostridiumdifficile toxin A and B are an effective treatment and
, 百拇医药
prevent relapse of C. difficile associateddisease in a hamster model of infection. Infect Immun 1998;66:2018-2025
5 Ward SJ, Douce G, Figueiredo D, Dougan G, Wren BW. Immunogenicityof a salmonella typhimurium aroA aroD
vaccine expressing a nontoxic domain ofClostridium difficile toxin A. Infect Immun 1999;67:2145-2152
6 Genth H, Selzer J, Busch C, Dumbach J, Hofmann F, Aktories K, JustI. New Method to generate enzymatically
, 百拇医药
deficient clostridium difficile toxin B asan antigen for immunization. Infect Immun 2000;68:1094-1101
7 杨晓强, 姜泊, 孙勇, 王继德. 艰难梭菌毒素基因3’末端重复区域基因片段的PCR克隆.
第一军医大学学报 2002;22:791-793
8 von Eichel-Streiber C, Laufenberg-Feldmann R, Sartingen S, SchulzeJ, Sauerborn M. Comparative sequence analysis
of the clostridium difficile toxins A andB. MolGen Genet 1992;233:260-268
, 百拇医药
9 Neunlist M, Barouk J, Michel K, Just I, Oreshkova T, Schemann M,Galmiche JP. Toxin B ofClostridium difficile
activates human VIP submucosal neurons, inpart via an IL-1beta-dependent pathway.
Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol 2003;285:G1049-1055
10 Moncrief JS, Zheng L, Neville LM, Lyerly DM. Geneticcharacterization of toxin A-negative, toxin B-positive Clostridium
, http://www.100md.com
difficile isolates by PCR. J ClinMicrobiol 2000;38:3072-3075
11 Limaye AP, Turgeon DK, Cookson BT, Fritsche TR. Pseudo-membranouscolitis caused by a toxin A (-) B (+) strain of
Clostridium difficile. J ClinMicrobiol 2000;38:1696-1697
12 Mitty RD, LaMont JT. Clostridium difficile diarrhea: pathogenesis,epidemiology and treatment.
Gastroenterologist 1994;2:61-69
, http://www.100md.com
13 Miller PD, Pothoulakis C, Baeker TR, LaMont JT, Rothstein TL.Macrophage-dependent stimulation of T cell depleted
spleen cells by Clostridium difficiletoxin A and calcium ionophore. Cell Immunol 1990;126:155-163
14 Hofmann F, Busch C, Prepens U, Just I, Aktories K. Localization ofthe Glucosyltransferase activity or Clostridium
difficile Toxin B to the N-terminalpart of the holotoxin. J Biol Chem 1997;272:11074-11078
15 Wilkins TD, Lyerly DM. Clostridium difficile testing:after 20years, still challenging. J Clin Microbiol 2003;41:531-534
编辑 张海宁, 百拇医药( 刘红升,姜 泊,陈村龙, 陈学清)
