消瘢方对体外CCl4损伤大鼠原代肝细胞保护作用的研究
吴亚云, 程明亮, 李宏, 陆彤, 耿晓霞, 贵阳医学院附属医院感染科 贵州省贵阳市 550004
贵州省自然科学基金资助项目, No. E-199
通讯作者:吴亚云, 550004, 贵州省贵阳市云岩区贵医街28号, 贵阳医学院附属医院感染科. gywuyy@21cn.com
收稿日期: 2005-03-01 接受日期: 2005-03-22
摘要
目的:探讨消瘢方抗肝纤维化作用的机理.
方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Ficoll密度梯度离心的方法，分离、培养大鼠肝细胞，先加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞24 h，再用四氯化碳(CCl4)蒸熏法制造肝细胞损伤模型.分别用MTT法及荧光实时定量RT-PCR法检测CCl4损伤后肝细胞的增殖、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达，并检测细胞培养上清中的谷草转氨酶(AST)活性.
, 百拇医药
结果:消瘢方药物血清能显著地促进CCl4损伤后肝细胞的增殖(P<0.05，P<0.01).CCl4损伤模型肝细胞内有一定量的caspase-3mRNA表达(6.96±0.69 ng)，加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后，肝细胞caspase-3mRNA的表达(6.31±0.64，6.01±0.68，5.54±0.58 ng)稍低于CCl4损伤模型，加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后，肝细胞caspase-3mRNA的表达(5.51±0.72，4.87±0.45，3.08±0.82 ng)显著下调(P<0.05，P<0.01).CCl4损伤模型肝细胞培养上清中AST活性为1 203.91±86.85 nkat，加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后，其培养上清中AST活性降低为1 092.39±57.01，1 025.54±29.17，996.03±53.68 nkat，加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后，其培养上清中AST活性(998.70±30.67，885.51±44.82，753.48±35.17 nkat)显著降低(P<0.05，P<0.01).消瘢方药物血清对CCl4损伤后肝细胞增殖的影响、下调肝细胞caspase-3mRNA的表达及降低肝细胞培养上清中AST活性的作用，均呈明显的血清浓度依赖关系.
, http://www.100md.com
结论:消瘢方抗肝纤维化机理与其保护肝细胞免受损害、抑制肝细胞凋亡有关.
吴亚云, 程明亮, 李宏, 陆彤, 耿晓霞. 消瘢方对体外CCl4损伤大鼠原代肝细胞保护作用的研究. 世界华人消化杂志 2005;13(9):1139-1141
表1 不同浓度血清对CCl4损伤后肝细胞增殖、caspase-3mRNA表达及AST的影响(mean±SD，n= 5)
aP<0.05，t= 3.25-4.55; bP<0.01，t= 5.45-8.12; dP<0.01，t= 9.38和10.76vs CCl4损伤模型组.eP<0.05，t= 3.12-3.23; fP<0.01，t= 5.87-8.46 vs同浓度正常大鼠血清.
, 百拇医药
3 讨论培养体系中的肝细胞可以很好地模拟体内肝脏生理环境，可作为研究肝特异代谢过程和肝脏功能的重要工具[7].我们采用二步灌流联合Ficoll密度梯度离心方法分离肝细胞，其纯度高达98%以上，细胞活力达90%以上.CCl4为不溶于水的无色液体，是经典的亲肝毒物.利用其极易挥发的特点而设计的CCl4蒸熏法制造肝细胞损伤模型，方法简单易行，成功率高[5].
我们通过用MTT法对消瘢方药物血清干预的体外培养CCl4损伤后大鼠肝细胞的增殖进行测定，结果显示:消瘢方药物血清较正常大鼠血清显著地能促进肝细胞的增殖，随血清浓度增高，对肝细胞增殖的促进作用增强，呈浓度依赖关系，说明消瘢方具有促进肝细胞再生作用，有助于肝损伤时肝细胞的修复.在凋亡过程中的caspase联级反应中，caspase-3是主要的效应性caspase，是细胞凋亡中公共的下游效应因子，即凋亡下游的关键执行者，在细胞凋亡中扮演重要角色.激活的caspase-3可进一步切割各种蛋白底物蛋白使细胞最终走向死亡[8-9]，因此，检测细胞内caspase-3的变化可作为判断细胞凋亡干预措施是否有效的可靠指标.caspase-3mRNA的表达与细胞凋亡呈正相关，caspase-3的定量检测还可克服形态学方法不能精确定量、亦不能很好地区别细胞的凋亡和坏死，具有一定的假阳性等的不足[10].我们的结果表明:随血清浓度增高，消瘢方药物血清较正常大鼠血清能显著下调肝细胞caspase-3mRNA的表达，影响了蛋白酶的切割过程，进而防止肝细胞凋亡和坏死的发生.细胞凋亡过程中的caspase激活涉及到两条途径，即细胞表面死亡受体途径及线粒体途径，有关消瘢方是如何调控肝细胞信号转导，还有待进一步研究.
, 百拇医药
转氨酶活性是肝细胞损伤的敏感指标.肝细胞损伤时，其细胞膜通透性发生改变，AST从肝细胞内泄漏至培养基中，其活性的高低与肝实质细胞受损的程度一致.我们的结果显示:随消瘢方药物血清浓度增高，肝细胞培养上清的AST下降，提示消瘢方具有防止肝细胞炎症、坏死及抗肝细胞损伤作用，与整体动物实验结果吻合[3].总之，我们从细胞水平证明消瘢方具有保护肝细胞、防止其凋亡、变性和坏死作用，阐明消瘢方抗肝纤维化作用是通过减少引起肝纤维化的始动刺激因素而发挥的.
致谢:本实验细胞培养部分在贵阳医学院免疫与干细胞中心完成，得到左丽教授、舒利平讲师、赵星助教等同志的大力帮助，在此一并致谢!
4 参考文献1 Canbay A, Friedman S, Gores GJ. Apoptosis:the nexus of liver injuryand fibrosis. Hepatology 2004;39:273-278
, http://www.100md.com
2 张东伟, 牛建昭, 陈家旭, 王冠一. 异病同治理论在中医研究中应用的思考.
世界科学技术—中医药现代化 3002;5:16-21
3 吴亚云, 姚玉梅, 熊涛, 刘琴, 邓开盛, 程明亮. 苗族草药“消疤草”预防猪血清免疫性肝纤维化的实验研究.
第十三次全国中西医结合肝病学术会议会编 2003:276-278
4 谢华福, 甘淋, 李娟, 刘小燕, 宋杰, 李洪. 一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法.
泸洲医学院学报 2003;26:306-307
5 孙燕荣, 董俊兴, 吕秋军, 吴曙光. 二咖啡酰奎宁酸对大鼠肝原代细胞保护作用的研究.
, http://www.100md.com
解放军药学学报 2004;20:80-84
6 Liu WH, Saint DA. A new quantitative method of real time reversetranscription polymerase chain reaction assay based
on simulation of polymerase chain reactionkinetics. Anal Biochem 2002;302:52-59
7 张莉萍, 康格非. 原代肝细胞培养的研究现状. 国外医学临床生物化学与检验学分册 2004;25:193-196
8 Rust C, Gores GJ. Apoptosis and liver disease. Am J Med 2000;108:567-574
9 张晓田. Caspase-3与细胞凋亡的研究. 医学综述 2002;8:621-623
10 张勇, 沈佰华, 余奇文, 马安伦, 李宁丽, 张冬青. 用荧光定量检测caspase-3的活性.
细胞与分子免疫学杂志 2001;17:188-190
编辑 张海宁, 百拇医药( 吴亚云,程明亮, 李 宏, 陆 彤, 耿晓霞)
贵州省自然科学基金资助项目, No. E-199
通讯作者:吴亚云, 550004, 贵州省贵阳市云岩区贵医街28号, 贵阳医学院附属医院感染科. gywuyy@21cn.com
收稿日期: 2005-03-01 接受日期: 2005-03-22
摘要
目的:探讨消瘢方抗肝纤维化作用的机理.
方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Ficoll密度梯度离心的方法，分离、培养大鼠肝细胞，先加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞24 h，再用四氯化碳(CCl4)蒸熏法制造肝细胞损伤模型.分别用MTT法及荧光实时定量RT-PCR法检测CCl4损伤后肝细胞的增殖、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达，并检测细胞培养上清中的谷草转氨酶(AST)活性.
, 百拇医药
结果:消瘢方药物血清能显著地促进CCl4损伤后肝细胞的增殖(P<0.05，P<0.01).CCl4损伤模型肝细胞内有一定量的caspase-3mRNA表达(6.96±0.69 ng)，加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后，肝细胞caspase-3mRNA的表达(6.31±0.64，6.01±0.68，5.54±0.58 ng)稍低于CCl4损伤模型，加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后，肝细胞caspase-3mRNA的表达(5.51±0.72，4.87±0.45，3.08±0.82 ng)显著下调(P<0.05，P<0.01).CCl4损伤模型肝细胞培养上清中AST活性为1 203.91±86.85 nkat，加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后，其培养上清中AST活性降低为1 092.39±57.01，1 025.54±29.17，996.03±53.68 nkat，加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后，其培养上清中AST活性(998.70±30.67，885.51±44.82，753.48±35.17 nkat)显著降低(P<0.05，P<0.01).消瘢方药物血清对CCl4损伤后肝细胞增殖的影响、下调肝细胞caspase-3mRNA的表达及降低肝细胞培养上清中AST活性的作用，均呈明显的血清浓度依赖关系.
, http://www.100md.com
结论:消瘢方抗肝纤维化机理与其保护肝细胞免受损害、抑制肝细胞凋亡有关.
吴亚云, 程明亮, 李宏, 陆彤, 耿晓霞. 消瘢方对体外CCl4损伤大鼠原代肝细胞保护作用的研究. 世界华人消化杂志 2005;13(9):1139-1141
表1 不同浓度血清对CCl4损伤后肝细胞增殖、caspase-3mRNA表达及AST的影响(mean±SD，n= 5)
组别 | 浓度(%) | , http://www.100md.com 吸光度(A值) | caspase-3mRNA(ng) | AST(nkat/L) |
CCl4损伤模型组 | - | 0.26±0.03 | 6.96±0.69 | 1 203.91±86.85 |
正常大鼠血清组 | 5 | , 百拇医药 0.28±0.04 | 6.31±0.64 | 1 092.39±57.01 |
10 | 0.31±0.03 | 6.01±0.68 | 1 025.54±29.17 | |
20 | 0.32±0.02a | 5.54±0.58a | , http://www.100md.com 996.03±53.68a | |
消瘢方药物血清组 | 5 | 0.29±0.03 | 5.51±0.72a | 998.70±30.67ad |
10 | 0.38±0.04be | 4.87±0.45be | , 百拇医药 885.51±44.82bf | |
20 | 0.41±0.02de | 3.08±0.82bf | 753.48±35.17df |
aP<0.05，t= 3.25-4.55; bP<0.01，t= 5.45-8.12; dP<0.01，t= 9.38和10.76vs CCl4损伤模型组.eP<0.05，t= 3.12-3.23; fP<0.01，t= 5.87-8.46 vs同浓度正常大鼠血清.
, 百拇医药
3 讨论培养体系中的肝细胞可以很好地模拟体内肝脏生理环境，可作为研究肝特异代谢过程和肝脏功能的重要工具[7].我们采用二步灌流联合Ficoll密度梯度离心方法分离肝细胞，其纯度高达98%以上，细胞活力达90%以上.CCl4为不溶于水的无色液体，是经典的亲肝毒物.利用其极易挥发的特点而设计的CCl4蒸熏法制造肝细胞损伤模型，方法简单易行，成功率高[5].
我们通过用MTT法对消瘢方药物血清干预的体外培养CCl4损伤后大鼠肝细胞的增殖进行测定，结果显示:消瘢方药物血清较正常大鼠血清显著地能促进肝细胞的增殖，随血清浓度增高，对肝细胞增殖的促进作用增强，呈浓度依赖关系，说明消瘢方具有促进肝细胞再生作用，有助于肝损伤时肝细胞的修复.在凋亡过程中的caspase联级反应中，caspase-3是主要的效应性caspase，是细胞凋亡中公共的下游效应因子，即凋亡下游的关键执行者，在细胞凋亡中扮演重要角色.激活的caspase-3可进一步切割各种蛋白底物蛋白使细胞最终走向死亡[8-9]，因此，检测细胞内caspase-3的变化可作为判断细胞凋亡干预措施是否有效的可靠指标.caspase-3mRNA的表达与细胞凋亡呈正相关，caspase-3的定量检测还可克服形态学方法不能精确定量、亦不能很好地区别细胞的凋亡和坏死，具有一定的假阳性等的不足[10].我们的结果表明:随血清浓度增高，消瘢方药物血清较正常大鼠血清能显著下调肝细胞caspase-3mRNA的表达，影响了蛋白酶的切割过程，进而防止肝细胞凋亡和坏死的发生.细胞凋亡过程中的caspase激活涉及到两条途径，即细胞表面死亡受体途径及线粒体途径，有关消瘢方是如何调控肝细胞信号转导，还有待进一步研究.
, 百拇医药
转氨酶活性是肝细胞损伤的敏感指标.肝细胞损伤时，其细胞膜通透性发生改变，AST从肝细胞内泄漏至培养基中，其活性的高低与肝实质细胞受损的程度一致.我们的结果显示:随消瘢方药物血清浓度增高，肝细胞培养上清的AST下降，提示消瘢方具有防止肝细胞炎症、坏死及抗肝细胞损伤作用，与整体动物实验结果吻合[3].总之，我们从细胞水平证明消瘢方具有保护肝细胞、防止其凋亡、变性和坏死作用，阐明消瘢方抗肝纤维化作用是通过减少引起肝纤维化的始动刺激因素而发挥的.
致谢:本实验细胞培养部分在贵阳医学院免疫与干细胞中心完成，得到左丽教授、舒利平讲师、赵星助教等同志的大力帮助，在此一并致谢!
4 参考文献1 Canbay A, Friedman S, Gores GJ. Apoptosis:the nexus of liver injuryand fibrosis. Hepatology 2004;39:273-278
, http://www.100md.com
2 张东伟, 牛建昭, 陈家旭, 王冠一. 异病同治理论在中医研究中应用的思考.
世界科学技术—中医药现代化 3002;5:16-21
3 吴亚云, 姚玉梅, 熊涛, 刘琴, 邓开盛, 程明亮. 苗族草药“消疤草”预防猪血清免疫性肝纤维化的实验研究.
第十三次全国中西医结合肝病学术会议会编 2003:276-278
4 谢华福, 甘淋, 李娟, 刘小燕, 宋杰, 李洪. 一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法.
泸洲医学院学报 2003;26:306-307
5 孙燕荣, 董俊兴, 吕秋军, 吴曙光. 二咖啡酰奎宁酸对大鼠肝原代细胞保护作用的研究.
, http://www.100md.com
解放军药学学报 2004;20:80-84
6 Liu WH, Saint DA. A new quantitative method of real time reversetranscription polymerase chain reaction assay based
on simulation of polymerase chain reactionkinetics. Anal Biochem 2002;302:52-59
7 张莉萍, 康格非. 原代肝细胞培养的研究现状. 国外医学临床生物化学与检验学分册 2004;25:193-196
8 Rust C, Gores GJ. Apoptosis and liver disease. Am J Med 2000;108:567-574
9 张晓田. Caspase-3与细胞凋亡的研究. 医学综述 2002;8:621-623
10 张勇, 沈佰华, 余奇文, 马安伦, 李宁丽, 张冬青. 用荧光定量检测caspase-3的活性.
细胞与分子免疫学杂志 2001;17:188-190
编辑 张海宁, 百拇医药( 吴亚云,程明亮, 李 宏, 陆 彤, 耿晓霞)
