!""# $%%&’(&)( 细胞与分子免疫学杂志* + ,-.. /0. !11230. 45%%$6 $& *7 4 858

    文章编号： $%%&’(&)( *5%%$ 4%7’858’%)

    柯萨奇病毒 B3通过 caspase依赖途径诱导 HeLa细胞凋亡

    袁建平，王洪涛，赵 蔚，吴凯宇，李 涛，郭晓奎，童善庆 *上海第二医科大学病原生物学教研室， 上海 5%%%57 4

    关键词：柯萨奇病毒 9)；细胞凋亡；:;<=;<- > )

    中图分类号：?577 文献标识码：@

    摘 要：目的 评价柯萨奇病毒 9) *,A9) 4 致 B-C; 细胞死亡的方式

    及分子机制。方法 用 ,A9) 作用于 B-C; 细胞， 在不同时间收集细

    胞，通过相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪以及分子生物学手

    段，检测 B-C; 细胞的病变及 :;<=;<- > ) 基因 1D#@ 和蛋白质的表

    达。结果 ,A9) 作用于 B-C; 细胞后，细胞很快发生变性和坏死，58E 后较多细胞凋亡；:;<=;<- 基因在病毒作用早期即被活化，表现

    在 :;<=;<- > ) 1D#@ 在病毒作用后 FE 内， 迅速增高达峰值。在 58E

    内， 又降至接近病毒作用前的水平。 :;<=;<- > ) 蛋白表达在 85E 内逐

    渐增高。 结论 ,A9) 可诱导 B-C; 细胞发生坏死和凋亡两种反应，坏死早于凋亡， 细胞凋亡与 :;<=;<- > ) 的表达密切相关。

    Coxsackievirus B3-Induced Apoptosis in HeLa

    Cells Dependent of Caspase

    GH@# +I;3’=I3JK L@#M B03J’N;0K OB@P L-IK LH Q;I’R2K

    CI S;0K MHP TI;0’U2IK SP#M "E;3’VI3J

    W-=;XN1-3N 0Y /I:X0ZI0.0JR ;3[ \;X;
    H3I]-X
    Keywords: ,0^<;:UI-]IX2< 9) *,A9) 4 6 ;=0=N0 )

    Abstract: Aim S0 -];.2;N- NE- 1;33-X ;3[ 10.-:2.;X 1-:E;3I<1 0Y

    B-C; :-.. [-;NE I3[2:-[ ZR ,0^<;:UI-]IX2< 9) *,A9) 4 _ Methods @YN-X

    :0 > :2.NI];N-[ ‘INE ,A9)K B-C; :-..< ‘-X- E;X]-
    10.-:2.;X ZI0.0JI:;. 1-;<2X-< 0Y :RN0=;NEI: :E;3J- ) J-3-_ Results W-J-3-X;NI03 ;3[

    3-:X0
    58 E02X< ;YN-X NE- :-..< ‘-X- :0 > :2.NI];N-[ ‘INE ,A9)6 ‘INEI3 F E02X<;YN-X NE- :0 > :2.NI];NI03K :;<=;<- > ) 1D#@ I3:X-;<-[ X;=I[.RK X-;:EI3J; =-;U ];.2-K ;3[ NE-3 Y-.. N0 ;==X0;:E NE- .-]-. Z-Y0X- NE- :0 > :2.NI’

    ];NI036 :;<=;<- > ) =X0N-I3 JX;[2;..R I3:X-;<-[ ‘INEI3 85 E02X<_ Con-

    clusion ,A9) 1;R I3[2:- ;=0=N0
    .;NN-X ;==-;X< 12:E -;X.I-X_ @=0=N0
    ‘INE NE- -^=X-< )_

    近来研究表明，:;<=;<- 家族的各种半胱氨酸蛋白酶是

    细胞凋亡过程中的关键效应分子， 一旦被激活， :;<=;<-< 即可

    切割多聚 @W\ >核糖聚合酶*\@D\4和 W#@ 片段因子*Waa4

    等多种底物，导致细胞正常自稳过程的改变，并发生相应的

    形态与结构的变化， 直至凋亡。 ,;XNER 等b $ c

    观察了 ,A9) 作用

    于 B-C; 细胞后，:;<=;<- > ) 蛋白表达水平的改变及其活性

    的变化，提出 :;<=;<- 的激活和切割底物的效应与细胞自稳

    状况及结构完整性的改变密切相关。 本文拟利用不同方法研

    究 ,A9) 作用于 B-C; 细胞后， :;<=;<- > ) 在致细胞凋亡过程

    中的重要作用。

    $ 材料和方法

    $_ $ 材料 ,A9) 和 B-C; 细胞为本室保存。D\/!$F8% 细胞

    培养液 *含庆大霉素 8 万 H d C，=B F_ ( e &_ % 4 及 SD!OPC 均

    为 M!9,P 公司产品。:;<=;<- > ) 上游引物：7f’,@M @MM

    MM@ S,M SSM S@M @@M’)f， 下游引物： 7f’MSS M,, @,, SSS

    ,M SS@ @,,’)f；M@\WB 上游引物：7f’@SM M,@ ,,M S,@

    @MM ,SM @M’)f， 下游引物7f’,M, ,SM ,SS ,@, ,@, ,SS ,S’)f。 兔抗 :;<=;<-’) 多克隆抗体及抗兔!JM > BD\ 为 ";3N; ,X2g

    9I0N-:E30.0JR 公司的产品。W@9 显色液为武汉博士德公司的

    产品。

    $_ 5 方法

    $_ 5_ $ B-C; 细胞培养和收集 B-C; 细胞培养于含 $%%1. d C

    小牛血清的 D\/!$F8% 培养液中，5[ 后，将贴壁良好的细胞

    与 ,A9) 液 * S,!W7% h $% > &_ &

    4 共育后， 培养于含 )%1. d C 小牛

    血清的 D!/\$F8% 培养液中， 分别于 %、 $、 F、 $5、 58、 )%、 )F 及

    85E， 以不同的方式收集细胞。

    $_ 5_ 5 细胞凋亡的检测 按电镜观察要求处理细胞，观察不

    同时间细胞的形态；再按流式细胞仪检测要求处理细胞，检

    测细胞凋亡。

    $_ 5_ ) DS > \,D 根据 SD!OPC 试剂盒中的说明书，从细胞

    中抽提 D#@， 进行 DS > \,D 及 W#@ 电泳。

    $_ 5_ 8 L-
    胞中抽提蛋白质， 进行 "W"’\@Mi。 然后电转移， 与兔抗 :;<’

    =;<-’)多克隆抗体及抗兔 !JM’BD\ 孵育后， 以 W@9 液显色。

    5 结 果

    5_ $ 相差显微镜观察 在 ,A9) 作用后 FE 起， 细胞开始发生

    明显的形态学改变， 细胞固缩、 变圆， 随着时间的推移， 胞质

    内颗粒增多， 最后细胞从瓶壁脱落。

    5_ 5 电镜观察 在 ,A9) 作用后 FE 起 ......