应用聚合酶链反应技术检测重症感染患者血中细菌DNA的临床评价
魏宏建 赵有成 段勇 刘华【关键词】 感染； 聚合酶链反应； 细菌16SrRNA基因
重症感染病死率高，目前其临床确诊主要依据细菌学培养，而现行的血培养阳性率较低。本研究拟探讨采用规范的聚合酶链反应(PCR)技术，从基因水平直接检测细菌16SrRNA基因〔1〕，为感染的准确诊断提供依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象：重症感染组40例均为本院住院患者，其中男22例，女18例；年龄19~83岁，平均(49.18±6.26)岁。感染性休克15例，肺炎10例，胆道感染10例，伤口感染5例。均符合以下条件：①急性生理学和慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)>12分。②符合美国胸科医师学会/危重病医学会共同制定的脓毒症诊断标准〔2〕。正常对照组为随机留取的30例正常体检者血标本，其中男19例，女11例；年龄22~57岁，平均(47.32±5.32)岁。
1.2 实验方法：用BacT Alert 120型全自动培养仪进行血培养。取待测血浆，用20 g/L蛋白酶K和质量分数为10%的十二烷基硫酸钠(SDS)将细菌破壁，酚/氯仿/异戊醇萃取，异丙醇沉淀和体积分数为70%的乙醇洗涤，将沉淀物重溶于揣酮盐酸(TE)缓冲液中作为DNA模板备用。细菌16SrRNA基因通用引物根据文献〔3〕方法合成(上海生工生物工程公司)，序列如下：引物1:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，所在基因位置为8~27；引物2：5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′，所在基因位置为1510~1492。PCR循环条件:预变性95 ℃，5 min；94 ℃，40 s；56 ℃，40 s；72 ℃，延伸2 min，循环40次。最后72 ℃ ......
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