聚羟基乙酸与口腔粘膜成纤维细胞的生物相容性研究
【摘要】 目的 研究聚羟基乙酸(PGA)与口腔粘膜成纤维细胞的生物相容性，为PGA为支架构建组织工程化口腔粘膜提供基础。方法 倒置显微镜和电镜动态观察口腔粘膜成纤维细胞与PGA的粘附生长及基质分泌情况;MTT法绘制有无PGA时成纤维细胞生长曲线，并比较两者差别。结果 口腔粘膜成纤维细胞与PGA复合培养后生长良好，基质分泌旺盛，生长曲线显示增殖时段延长，未复合培养的细胞增殖相对缓慢，第6天开始进入平台期。结论 PGA与口腔粘膜成纤维细胞具有良好的生物相容性，有可能作为支架材料构建组织工程化口腔粘膜。
关键词 口腔粘膜成纤维细胞 PGA 组织工程 生物相容性
Experimental study on bio-compatibility of polyglycolic acids with cultured oral fibroblast in vitro
Wang Haiyan，Zhou Zengtong
Department of Stomatology，Affilliation of the9th People’s Hospital of the2nd Medical University of Shanghai，200011.
【Abstract】 Objective To study the bio-compatibility of PGA with oral fibroblast aiming to reconstruct tisˉsue engineered oral mucosa.Methods Oral fibroblasts were observed dynamically to adhere to PGA and to secret substrate;Growth curves of oral fibroblasts cultured with and without PGA were protracted by MTT.Results Cultured with PGA，oral fibroblast grew rapidly and secreted more substrate，with growth phase prolonged;without PGA，fibrobˉlasts grew comparative slowly and entered stagnate phase at6d.Conclusion The results showed that PGA had good bio-compatibility with oral fibroblast，so may be used as potential scaffold to reconstruct tissue engineered oral muˉcosa.
Key words oral fibroblast PGA tissue engineering bio-compatibility
聚羟基乙酸(Polyglycolic Acid，PGA)作为生物支架材料，其吸收和代谢机制已经明确并具有可靠的生物安全性，因而广泛用于组织工程化软骨，骨、肌腱和皮肤等的研究 [1] ，但未见用于组织工程化口腔粘膜的研究报告。本试验旨在研究PGA与口腔粘膜成纤维细胞的生物相容性，为采用PGA作为支架材料，构建组织工程化口腔粘膜提供依据。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 聚羟基乙酸由上海东华大学王文竹教授提供，Ⅰ型胶原酶(Gibco)，DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司提供)，咪唑兰(Thiazolylˉblue，MTT，Sigma)，二甲基苯砜(DMSO，华美公司提供)，酶联免疫吸附测定仪(ELISA)(华东电子集团产品)。
1.2 组织来源 试验标本为龈切术和唇裂修复术切除的正常口腔粘膜组织。
1.3 实验方法
1.3.1 口腔粘膜成纤维细胞培养 两种标本经PBS冲洗后保留固有层，剪成2～3mm 3 的小块，0.03%Ⅰ型胶原酶37℃恒温振荡器内振荡消化3h，过滤，收集细胞，加入含10%FBS的DMEM培养液，37℃5%CO 2 分压下培养，每3d换液1次，细胞长至培养皿的80%时传代。HE及免疫组织化学染色鉴定细胞来源，实验选用3～5代成纤维细胞。
1.3.2 PGA制备 PGA为均质棉絮状(纤维直径15μm，孔径100～150μm)，称量20mg小片状，使其覆盖96孔板的孔底壁，75%乙醇浸泡30min后，PBS反复冲洗5次，DMEM液冲洗2次，吸干水分备用。
1.3.3 细胞接种 取生长状态良好的3～5代的唇粘膜和牙龈部位成纤维细胞，以1×10 4 个细胞/孔接种于96孔板的48孔中，其中24孔底壁覆盖PGA(A)，24孔无PGA(B)。另备24孔PGA(C)，加入等量培养液而无细胞。置于培养箱中培养。
1.3.4 MMT法测定细胞数目 细胞接种后每隔24h，A、B、C随机各取3孔分别加入20μlMTT液，继续培养4h后，吸弃液体，加150μl/孔DMSO，震荡1min，使结晶充分溶解，在ELISA仪上测490nm波长下各孔OD值，并计算出接种于PGA上的成纤维细胞数。
1.3.5 电镜观察 透射电镜观察接种后口腔粘膜成纤维细胞对PGA纤维的粘附、细胞内降解颗粒变化及基质分泌情况。
2 结果
2.1 口腔粘膜成纤维细胞的鉴定 经形态学观察，所培养的OFC呈梭形或星形，免疫组化抗波形蛋白染色阳性(图1)，与标准OFC对照一致，证实为OFC。
2.2 倒置相差显微镜观察 刚接种的成纤维细胞呈圆形或椭圆形，均匀分布于各孔及PGA材料中(图2-A);4h后，大部分细胞贴壁或附着于材料上，细胞呈短梭型或星型;培养48h后，粘附在生物支架上的细胞沿PGA纤维纵轴方向向两极伸展，细胞形态变为长梭形，并有少量基质分泌(图2-B);培养4天后，细胞分泌基质增多，在局部形成拉网状结构(图2-C);6天后，网状结构增多，逐渐融合，并有增厚趋势(图2-D)。两种口腔粘膜成纤维细胞粘附生长及基质分泌无肉眼可见变化。
2.3 MTT法描绘的生长曲线 培养前3天的口腔粘膜成纤维细胞生长曲线基本重叠。第4天开始，与PGA复合培养的成纤维细胞生长加快，吸光度值明显增加，至第7天仍有微弱的上升趋势。而单独培养的细胞生长相对缓慢，在第6天即进入平台期(图3)。
2.4 透射电镜结果 随复合培养时间延长，成纤维细胞与PGA纤维粘附增多，并有基质分泌，6天时纤维已基本被成纤维细胞包裹，细胞内线粒体嵴出现肿胀现象(图4)。
3 讨论
聚羟基乙酸(PGA)是合成可降解聚合物，由乙交酯开环聚合制取，降解后生成羟基乙酸，参与体内三羧酸循环，具有可靠的生物安全性 [2] ，已广泛用于组织工程化软骨、骨、肌腱和皮肤等的研究。有学者 [3] 将扩增的人牙髓成纤维细胞接种于PGA三维支架上，发现细胞接种24h后开始贴附于PGA纤维上，然后开始伸展增殖。PGA对肌成纤维细胞的粘附生长也具有积极的促进作用 [4] 。有学者 [5] 对口腔软硬组织成纤维细胞与可溶性磷酸玻璃复合培养后的生物学特性作了比较，发现成纤维细胞的特性与后者的浓度有关。但对口腔粘膜成纤维细胞与PGA的生物相容性却未有研究报道。
本实验中，形态学动态观察发现口腔粘膜成纤维细胞容易与PGA纤维粘附，生长较快，分泌基质旺盛，1周时间基质融合增多增厚。说明二者的生物相容性良好，生长曲线结果也证实了这一点:从接种的第2天开始，复合培养的细胞就有缓慢的增殖趋势，第3天～第6天呈直线上升，而未复合的细胞前2天处于静止阶段，第3天才进入对数增长期，其增殖幅度明显低于前者。未复合的成纤维细胞贴壁生长时，由于细胞间接触抑制调控机制，当细胞全部融合覆盖培养皿底壁时即停止增殖，而与PGA复合培养后，PGA纤维的三维结构为细胞生长提供了广阔的伸展空间，纤维之间的空隙还有利于细胞与外界的物质交换，使其处于良好的生长环境，增殖期延长，细胞胶原基质分泌活跃。但细胞内线粒体嵴肿胀，空泡增多这一现象有何生理意义，需深入研究。应用PGA构建组织工程化组织器官的报道已有很多，如肌 [6] 、血管 [7] 、软骨 [8] 等。皮肤和口腔粘膜关系密切，国内曹谊林等人以PGA为支架成功构建出组织工程化皮肤 [9，10] ，但缺少毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肤附属器官。国外 有学者使用胶原膜 [11] 和脱细胞真皮基质(如Alloˉderm) [12，13] 为支架构建组织工程化口腔粘膜，但该材料会受到供体来源限制。而以PGA作为人工合成的支架材料却有着这方面的优势，但未见用此构建口腔粘膜的报道。本实验发现口腔粘膜成纤维细胞与PGA有良好的生物相容性，能促进细胞的增殖，成纤维细胞可以分泌生长因子及一些与上皮细胞分化增殖信号传导有关的细胞基质成分，从而提示在此基础上接种口腔粘膜角化细胞，将有助于后者的生长增殖和组织工程化口腔粘膜的构建。
(本文图片见附页2)(略)
参考文献
1 Saxena AK，Willital GH，Vacanti JP Vascularized three-dimensional skeletal muscle tissue-engineering.Biomed Mater Eng，2001，11(4):275-281.
2 Robert CT.Polymer Scaffold Processing.Principles of tissue engineerˉing.Edited by Langer R and Chick W.Landes Company，1997，R.G.
3 郭红延，吴补领，陈富林，等.用组织工程的方法建立人牙髓细胞体外三维立体培养模型.牙体牙髓牙周病学杂志，2001，11(3):146.
4 董念国，孙宗全，傅平，等.聚二乙醇酸与Degrapol对肌成纤维细胞粘附、生长的影响.华中医科大学学报，2003，32(1):71-73.
5 Bitar M，Salih V，Mudera V，et al.Soluble phosphate glasses:in vitro studies using human cells of hard and soft tissue origin.Biomaterials，2004，25(12):2283-2292.
6 Fuchs JR，Pomerantseva，I，Ochoa ER，et al.Fetal tissue engineering:In vitro analysis of muscle constructs.J Pediatr Surg，2003，38(9):1348-1353.
7 Dvorin EL，Wylie-Sears J，Kaushal S，et al.Quantitative evaluation of endothelial progenitors and cardiac valve endothelial cells:proliferation and differentiation on poly-glycolic acid/poly-4-hydroxybutyrate scaffold in response to vascular endothelial growth factor and transformˉing growth factor betal.Tissue Eng，2003，9(3):487-493.
8 崔鹏程，陈文弦，罗家胜.鼻中隔软骨细胞工程法构建预定形态软骨.中华耳鼻咽喉科杂志，2001，36(1):22-24.
9 曹益林，蔡霞，崔磊，等.自体组织工程化全层皮肤缺损修复实验研究.中华外科杂志，2002，40(1):24-27.
10 杨光辉，崔磊，刘伟，等.利用聚羟基乙酸构建组织工程皮肤的实验研究.中华实验外科杂志，2003，20(11):984-986.
11 Costea DE，Loro LL，Dimba EA，et al.Crucial effects of fibroblasts and keratinocyte growth factor on morphogenesis of reconstituted human oral epithelium.J Invest Dermatol，2003，121(6):1479-1486.
12 Izumi K，Feinberg SE，Terashi H，et al.Evaluation of transplanted tisˉsue-engineered oral mucosa equivalents in severe combined immunodeˉficient mice.Tissue Eng，2003，9(1):163-174.
13 Izumi K，Feinberg SE，Iida A，et al.Intraoral grafting of an ex vivo proˉduced oral mucosa equivalent:a preliminary report.Int J Oral Maxillofac Surg，2003，32(2):188-197.
(收稿日期:2004-05-12)
基金项目:上海市科委基金资助项目(编号:01411900)
作者单位:200011上海第二医科大学附属第九人民医院口腔内科
(编辑罗 彬), 百拇医药(王海燕 周曾同)
关键词 口腔粘膜成纤维细胞 PGA 组织工程 生物相容性
Experimental study on bio-compatibility of polyglycolic acids with cultured oral fibroblast in vitro
Wang Haiyan，Zhou Zengtong
Department of Stomatology，Affilliation of the9th People’s Hospital of the2nd Medical University of Shanghai，200011.
【Abstract】 Objective To study the bio-compatibility of PGA with oral fibroblast aiming to reconstruct tisˉsue engineered oral mucosa.Methods Oral fibroblasts were observed dynamically to adhere to PGA and to secret substrate;Growth curves of oral fibroblasts cultured with and without PGA were protracted by MTT.Results Cultured with PGA，oral fibroblast grew rapidly and secreted more substrate，with growth phase prolonged;without PGA，fibrobˉlasts grew comparative slowly and entered stagnate phase at6d.Conclusion The results showed that PGA had good bio-compatibility with oral fibroblast，so may be used as potential scaffold to reconstruct tissue engineered oral muˉcosa.
Key words oral fibroblast PGA tissue engineering bio-compatibility
聚羟基乙酸(Polyglycolic Acid，PGA)作为生物支架材料，其吸收和代谢机制已经明确并具有可靠的生物安全性，因而广泛用于组织工程化软骨，骨、肌腱和皮肤等的研究 [1] ，但未见用于组织工程化口腔粘膜的研究报告。本试验旨在研究PGA与口腔粘膜成纤维细胞的生物相容性，为采用PGA作为支架材料，构建组织工程化口腔粘膜提供依据。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 聚羟基乙酸由上海东华大学王文竹教授提供，Ⅰ型胶原酶(Gibco)，DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司提供)，咪唑兰(Thiazolylˉblue，MTT，Sigma)，二甲基苯砜(DMSO，华美公司提供)，酶联免疫吸附测定仪(ELISA)(华东电子集团产品)。
1.2 组织来源 试验标本为龈切术和唇裂修复术切除的正常口腔粘膜组织。
1.3 实验方法
1.3.1 口腔粘膜成纤维细胞培养 两种标本经PBS冲洗后保留固有层，剪成2～3mm 3 的小块，0.03%Ⅰ型胶原酶37℃恒温振荡器内振荡消化3h，过滤，收集细胞，加入含10%FBS的DMEM培养液，37℃5%CO 2 分压下培养，每3d换液1次，细胞长至培养皿的80%时传代。HE及免疫组织化学染色鉴定细胞来源，实验选用3～5代成纤维细胞。
1.3.2 PGA制备 PGA为均质棉絮状(纤维直径15μm，孔径100～150μm)，称量20mg小片状，使其覆盖96孔板的孔底壁，75%乙醇浸泡30min后，PBS反复冲洗5次，DMEM液冲洗2次，吸干水分备用。
1.3.3 细胞接种 取生长状态良好的3～5代的唇粘膜和牙龈部位成纤维细胞，以1×10 4 个细胞/孔接种于96孔板的48孔中，其中24孔底壁覆盖PGA(A)，24孔无PGA(B)。另备24孔PGA(C)，加入等量培养液而无细胞。置于培养箱中培养。
1.3.4 MMT法测定细胞数目 细胞接种后每隔24h，A、B、C随机各取3孔分别加入20μlMTT液，继续培养4h后，吸弃液体，加150μl/孔DMSO，震荡1min，使结晶充分溶解，在ELISA仪上测490nm波长下各孔OD值，并计算出接种于PGA上的成纤维细胞数。
1.3.5 电镜观察 透射电镜观察接种后口腔粘膜成纤维细胞对PGA纤维的粘附、细胞内降解颗粒变化及基质分泌情况。
2 结果
2.1 口腔粘膜成纤维细胞的鉴定 经形态学观察，所培养的OFC呈梭形或星形，免疫组化抗波形蛋白染色阳性(图1)，与标准OFC对照一致，证实为OFC。
2.2 倒置相差显微镜观察 刚接种的成纤维细胞呈圆形或椭圆形，均匀分布于各孔及PGA材料中(图2-A);4h后，大部分细胞贴壁或附着于材料上，细胞呈短梭型或星型;培养48h后，粘附在生物支架上的细胞沿PGA纤维纵轴方向向两极伸展，细胞形态变为长梭形，并有少量基质分泌(图2-B);培养4天后，细胞分泌基质增多，在局部形成拉网状结构(图2-C);6天后，网状结构增多，逐渐融合，并有增厚趋势(图2-D)。两种口腔粘膜成纤维细胞粘附生长及基质分泌无肉眼可见变化。
2.3 MTT法描绘的生长曲线 培养前3天的口腔粘膜成纤维细胞生长曲线基本重叠。第4天开始，与PGA复合培养的成纤维细胞生长加快，吸光度值明显增加，至第7天仍有微弱的上升趋势。而单独培养的细胞生长相对缓慢，在第6天即进入平台期(图3)。
2.4 透射电镜结果 随复合培养时间延长，成纤维细胞与PGA纤维粘附增多，并有基质分泌，6天时纤维已基本被成纤维细胞包裹，细胞内线粒体嵴出现肿胀现象(图4)。
3 讨论
聚羟基乙酸(PGA)是合成可降解聚合物，由乙交酯开环聚合制取，降解后生成羟基乙酸，参与体内三羧酸循环，具有可靠的生物安全性 [2] ，已广泛用于组织工程化软骨、骨、肌腱和皮肤等的研究。有学者 [3] 将扩增的人牙髓成纤维细胞接种于PGA三维支架上，发现细胞接种24h后开始贴附于PGA纤维上，然后开始伸展增殖。PGA对肌成纤维细胞的粘附生长也具有积极的促进作用 [4] 。有学者 [5] 对口腔软硬组织成纤维细胞与可溶性磷酸玻璃复合培养后的生物学特性作了比较，发现成纤维细胞的特性与后者的浓度有关。但对口腔粘膜成纤维细胞与PGA的生物相容性却未有研究报道。
本实验中，形态学动态观察发现口腔粘膜成纤维细胞容易与PGA纤维粘附，生长较快，分泌基质旺盛，1周时间基质融合增多增厚。说明二者的生物相容性良好，生长曲线结果也证实了这一点:从接种的第2天开始，复合培养的细胞就有缓慢的增殖趋势，第3天～第6天呈直线上升，而未复合的细胞前2天处于静止阶段，第3天才进入对数增长期，其增殖幅度明显低于前者。未复合的成纤维细胞贴壁生长时，由于细胞间接触抑制调控机制，当细胞全部融合覆盖培养皿底壁时即停止增殖，而与PGA复合培养后，PGA纤维的三维结构为细胞生长提供了广阔的伸展空间，纤维之间的空隙还有利于细胞与外界的物质交换，使其处于良好的生长环境，增殖期延长，细胞胶原基质分泌活跃。但细胞内线粒体嵴肿胀，空泡增多这一现象有何生理意义，需深入研究。应用PGA构建组织工程化组织器官的报道已有很多，如肌 [6] 、血管 [7] 、软骨 [8] 等。皮肤和口腔粘膜关系密切，国内曹谊林等人以PGA为支架成功构建出组织工程化皮肤 [9，10] ，但缺少毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肤附属器官。国外 有学者使用胶原膜 [11] 和脱细胞真皮基质(如Alloˉderm) [12，13] 为支架构建组织工程化口腔粘膜，但该材料会受到供体来源限制。而以PGA作为人工合成的支架材料却有着这方面的优势，但未见用此构建口腔粘膜的报道。本实验发现口腔粘膜成纤维细胞与PGA有良好的生物相容性，能促进细胞的增殖，成纤维细胞可以分泌生长因子及一些与上皮细胞分化增殖信号传导有关的细胞基质成分，从而提示在此基础上接种口腔粘膜角化细胞，将有助于后者的生长增殖和组织工程化口腔粘膜的构建。
(本文图片见附页2)(略)
参考文献
1 Saxena AK，Willital GH，Vacanti JP Vascularized three-dimensional skeletal muscle tissue-engineering.Biomed Mater Eng，2001，11(4):275-281.
2 Robert CT.Polymer Scaffold Processing.Principles of tissue engineerˉing.Edited by Langer R and Chick W.Landes Company，1997，R.G.
3 郭红延，吴补领，陈富林，等.用组织工程的方法建立人牙髓细胞体外三维立体培养模型.牙体牙髓牙周病学杂志，2001，11(3):146.
4 董念国，孙宗全，傅平，等.聚二乙醇酸与Degrapol对肌成纤维细胞粘附、生长的影响.华中医科大学学报，2003，32(1):71-73.
5 Bitar M，Salih V，Mudera V，et al.Soluble phosphate glasses:in vitro studies using human cells of hard and soft tissue origin.Biomaterials，2004，25(12):2283-2292.
6 Fuchs JR，Pomerantseva，I，Ochoa ER，et al.Fetal tissue engineering:In vitro analysis of muscle constructs.J Pediatr Surg，2003，38(9):1348-1353.
7 Dvorin EL，Wylie-Sears J，Kaushal S，et al.Quantitative evaluation of endothelial progenitors and cardiac valve endothelial cells:proliferation and differentiation on poly-glycolic acid/poly-4-hydroxybutyrate scaffold in response to vascular endothelial growth factor and transformˉing growth factor betal.Tissue Eng，2003，9(3):487-493.
8 崔鹏程，陈文弦，罗家胜.鼻中隔软骨细胞工程法构建预定形态软骨.中华耳鼻咽喉科杂志，2001，36(1):22-24.
9 曹益林，蔡霞，崔磊，等.自体组织工程化全层皮肤缺损修复实验研究.中华外科杂志，2002，40(1):24-27.
10 杨光辉，崔磊，刘伟，等.利用聚羟基乙酸构建组织工程皮肤的实验研究.中华实验外科杂志，2003，20(11):984-986.
11 Costea DE，Loro LL，Dimba EA，et al.Crucial effects of fibroblasts and keratinocyte growth factor on morphogenesis of reconstituted human oral epithelium.J Invest Dermatol，2003，121(6):1479-1486.
12 Izumi K，Feinberg SE，Terashi H，et al.Evaluation of transplanted tisˉsue-engineered oral mucosa equivalents in severe combined immunodeˉficient mice.Tissue Eng，2003，9(1):163-174.
13 Izumi K，Feinberg SE，Iida A，et al.Intraoral grafting of an ex vivo proˉduced oral mucosa equivalent:a preliminary report.Int J Oral Maxillofac Surg，2003，32(2):188-197.
(收稿日期:2004-05-12)
基金项目:上海市科委基金资助项目(编号:01411900)
作者单位:200011上海第二医科大学附属第九人民医院口腔内科
(编辑罗 彬), 百拇医药(王海燕 周曾同)