深低温冷冻保存同种异体气管移植的实验研究 Δ
【摘要】 目的 探讨深低温冷冻保存同种异体气管移植的可行性。方法 通过MRI检查、病理学检查以及存活率和通畅度的计算，研究了以兔单侧胸锁乳突肌瓣和双侧胸骨舌骨肌瓣联合包裹自体移植气管和未冻储以及冻储4周的同种异体移植气管术后的存活情况。结果 冻储4周的气管移植后与自体移植的气管无明显差别，可长期存活。未冻储的同种异体气管移植后大部分术后短期内坏死。结论 气管经深低温冷冻保存后可以消减其抗原性，同种异体移植后不发生免疫排斥反应，移植气管能够长期存活。
关键词 气管 同种异体移植 冷冻
The experiment of the tracheal allografts after cryopreservation
Zhang Feng，Hou Shengcai，Hu Bin，et al.
Dept.of Thoracic Surgery，Beijin Chao-Yang Hospital Affliated the Capital Me
dical University，Beijin100020.
【Abstract】 Objective To elucidate that cryopreserved tracheal allograft can be used to allotransplant. Methods By the examination of MRI，histopathology，the calculation of survival rate and percentage of patency，the viability of graft status of autograft tracheas and allograft tracheas without cryopreservation or cryopreservated for 4 weeks wrapped in one-sided sternocleidomastoid muscle flap and two-sided sternohyoid muscle flap were evaluated in rabbits. Results There was no significant difference between autograft and allograft cryopreservated for 4 weeks. The allografts without cryopreservation showed necrosis shortly after the transplantation. Conclusion The allogenicity of preserved allografts can be decreased by cryopreservation. No allograft rejection takes place in these allotransplantations.
Key words trachea allograft cryopreservation
深低温冷冻保存的组织可以保持其原有的活性和组织完整性，且抗原性降低，同种异体移植后，排斥反应轻，不必应用免疫抑制剂，避免了许多副作用和并发症 [1] 。目前，该技术已在多种组织、器官移植中应用 [2～4] ，但在气管移植中的应用还很少。我们通过对深低温冻储兔同种异体气管移植的实验研究，探讨将该技术引入气管移植领域的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料 实验动物为成年健康新西兰大白兔(体重2.5～3.0kg)。实验用药包括二甲基亚砜(DMSO)、海藻糖、小牛血清、M199。实验器材有程控降温仪、医用无损伤缝合针线、GESigna1.5T Horizon echo-speed超导磁共振扫描机。
1.2 方法
1.2.1 冷冻保护液的配制 [5] 在洁净工作台内配制冷冻保护液，以M199为介质，分别加入20%胎牛血清、10%DMSO、0.1mol/L海藻糖、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素、2.5μg/ml二性霉素B。4℃冰箱中保存备用。
1.2.2 同种异体移植气管段的获取、冷冻、保存及复温静脉注射异戊巴比妥钠(2.5mg/kg)将兔麻醉，沿颈部正中线作切口，无菌切取所需长度的颈段气管(从环状软骨下第5个气管环起向下切取5个气管环的气管段)。将气管段移入盛有冷冻保护剂的无菌生物冷冻袋中，每袋装1个气管段，程控降温仪程序降温，降温速率1℃/min，降至-80℃后投入液氮中保存。保存4周后，将冷冻袋从液氮中取出，置于37℃恒温水浴箱中，使气管段均匀快速解冻复温。复温后的气管段用于移植实验。
1.2.3 深低温冷冻同种异体气管移植实验
1.2.3.1 实验分组 实验分A、B、C组，分别为自体气管原位移植组、冷冻同种异体气管移植组以及新鲜未冷冻同种异体气管移植组。每组动物均为10只，移植气管的长度均为5个环。
1.2.3.2 手术方法 [6] 将麻醉好的兔仰放于手术台上，行颈部正中纵形切口，切开皮肤、皮下组织，显露胸锁乳突肌和双侧胸骨舌骨肌。游离一侧胸锁乳突肌和双侧胸骨舌骨肌，形成以上方为蒂的胸锁乳突肌瓣和以下方为蒂的双侧胸骨舌骨肌瓣。切开气管前筋膜，切取5个环的气管段，其上端切口位于环状软骨下第4和第5个气管环间。根据实验分组，分别将自体气管、冷冻气管及新鲜气管原位移植于缺损气管处。用6/0无损伤缝合线间断缝合，将一侧胸锁乳突肌瓣和双侧胸骨舌骨肌瓣联合包裹移植气管段，缝合固定于气管环上，形成稳定牢固的肌肉套包裹移植气管段。缝合切口。
1.2.4 术后观察和处置
1.2.4.1 生存状况及动物的生存率 每日观察并纪录动物的生存状况及生存时间。计算各组3个月的生存率。
1.2.4.2 磁共振成像(MRI)检查 术后4周对存活的兔行MRI检查，观察移植气管的形态和结构。使用GE Signa1.5T Horizon echo-speed超导磁共振扫描机，将麻醉好的兔仰卧于扫描台上，3.5英寸乳腺线圈固定于兔颈部两侧。常规轴面或矢状面T2 WI扫描。
1.2.4.3 气管通畅度的测定 对所有处死或死亡的动物均行气管通畅度测定。气管通畅度指移植气管最狭窄处的横断面面积与环状软骨下第2个气管环处横断面面积的比值。横断面面积的计算公式为:CSA=(a/2)×(b/2)×π，其中a为气管横向的直径，b为矢向的直径 [7] 。
1.2.4.4 病理学检查 对所有处死或死亡的动物均行大体和镜下病理学检查。标本在福尔马林溶液中固定，切片后行HE染色。光镜下对以下4个方面进行检查:①上皮的破坏情况;②气管腺的破坏情况;③软骨环的破坏情况;④间质组织的破坏情况，包括炎症细胞的浸润、肉芽组织样反应、坏死和单核细胞浸润。并按照Nakanishi [8] 的半定量法对读片结果进行分级。
1.3 统计学方法 采用Wilcoxson秩和检验方法(Wilcoxson rank-sum test)对结果进行统计学处理(SAS6.12统计分析软件)。
2 结果
2.1 生存状况和存活率 A和B组中除各有1只兔因腹泻厌食于术后4周、6周死亡外，所有兔均存活至3个月时被处死，存活率90%。C组兔均在术后2～4周死亡，死前均有明显的呼吸困难，存活率0。
2.2 磁共振成像(MRI)检查 A、B两组气管腔通畅，移植气管粘膜与受体气管连续，软骨沿管腔呈结节状排列，管腔通畅，结构完整，吻合口轻微突入管腔。C组表现为移植气管狭窄，气管壁塌陷。
2.3 移植气管的通畅度 A、B组40%发生轻度狭窄，轻微狭窄系吻合口瘢痕增生所致。C组所有兔均发生不同程度的狭窄(100%)。
2.4 病理学检查结果 A和B组中长期存活兔的移植气管标本大体观察与正常气管无明显差别，镜下为正常气管组织表现，移植气管粘膜为假复层纤毛柱状上皮所覆盖，软骨细胞无变性坏死，未见单核细胞浸润。C组大体见移植气管粘膜消失，软骨环脱落于管腔，管腔塌陷严重狭窄。镜下见粘膜消失，软骨变性、坏死，淋巴细胞和单核细胞浸润。半定量法病理评分结果如表1所示，统计学分析(表2)表明B与A组间差异无显著性(P>0.05)，而C组病理评分明显高于A和B组(P<0.05)，差异具有显著性。
表1 A、B和C组的病理评分(略)注:所列数值为均数±标准误
表2 A、B、C组病理评分行Wilcoxson秩和检验的P值(略)注:Δ表示P值过小，SAS未给出具体数值。
3 讨论
气管移植是粘膜、软骨和血管的复合移植。学者们大多认为气管是一种弱抗原，异体气管移植能够引起排斥反应，故在气管移植中仍需要免疫抑制 [7～9] 。环孢素作为有效的免疫抑制剂，已广泛应用于器官移植领域，同样也应用于气管移植实验中，并获得成功 [10] 。但使用免疫抑制剂有 许多副作用和并发症，如感染机会增加，免疫力下降，肿瘤复发，高血压、肾脏损害等。因此，降低移植物自身的抗原性才是控制免疫排斥反应的最佳选择。随着深低温冷冻技术的发展，冷冻后的组织可以保持其原有的活性和组织完整性，并能消减其抗原性，这既解决了供体的保存问题，又解决了移植后免疫排斥反应问题，深低温冻储的同种异体瓣膜和软骨的移植已成功应用于临床[3～4] 。
气管的结构相对简单，对深低温冷冻条件的要求也相对较低:实验研究表明全部未经冷冻的供体气管(C组)移植术后均发生气管粘膜和软骨的坏死，管腔狭窄或塌陷。而冻储4周(B组)的供体气管移植术后能够长期存活，与自体气管移植组基本相同。
我们在气管移植中应用了MRI检查，国内外文献还未见报道，这种方法简单易行，无创伤性。MRI显示A、B两组管腔通畅，气管粘膜连续，结构完整。新鲜未冷冻同种异体气管移植组(C组)表现为移植气管狭窄，气管壁塌陷。病理检查显示A、B组与正常气管无明显差别，而C组移植气管粘膜消失，管腔塌陷，单核细胞浸润。这证明了深低温冻储达4周的气管行单侧胸胸锁乳突肌瓣和双侧胸骨舌骨肌瓣联合包裹同种异体气管移植后完全成活，与自体移植的气管无明显差别。
通过此实验研究，我们认为气管与其它器官一样也具有抗原性，同种异体移植后会发生免疫排斥反应，影响其成活。这种免疫排斥反应是细胞介导的，其结局是引起气管上皮和软骨的缺血坏死。程控降温、液氮深低温长期冻储和快速复温，不但可以完整保存气管的活性，而且其抗原性被消减，同种异体移植术后可以长期存活。这对将来深低温冷冻气管库的建立以及同种异体气管移植在临床上的应用具有十分重要的意义。
参考文献
1 Takahiro M，Nobuyoshi S，et al. Experimental study of tracheal allotrans plantation with cryopreserved grafts. J Thorac Cardiovasc Surg，1998，116:262-266.
2 田立杰，王彦生，等.同种异体肌腱移植的临床应用.中华手外科杂志，1999，15(2):93-94.
3 王吉秋，荣佑宝.活性同种带瓣主动脉补片在法乐氏四联症右室流出道矫形中的应用.青岛医学院学报，1996，32(1):19-21.
4 程新德，赵天兰.低温冷冻同种异体软骨在整形外科的应用.蚌埠医学院学报，1998，23(4):225-226.
5, http://www.100md.com(张锋 侯生才 胡滨 王洋 李彤 张振葵 苗劲柏)
关键词 气管 同种异体移植 冷冻
The experiment of the tracheal allografts after cryopreservation
Zhang Feng，Hou Shengcai，Hu Bin，et al.
Dept.of Thoracic Surgery，Beijin Chao-Yang Hospital Affliated the Capital Me
dical University，Beijin100020.
【Abstract】 Objective To elucidate that cryopreserved tracheal allograft can be used to allotransplant. Methods By the examination of MRI，histopathology，the calculation of survival rate and percentage of patency，the viability of graft status of autograft tracheas and allograft tracheas without cryopreservation or cryopreservated for 4 weeks wrapped in one-sided sternocleidomastoid muscle flap and two-sided sternohyoid muscle flap were evaluated in rabbits. Results There was no significant difference between autograft and allograft cryopreservated for 4 weeks. The allografts without cryopreservation showed necrosis shortly after the transplantation. Conclusion The allogenicity of preserved allografts can be decreased by cryopreservation. No allograft rejection takes place in these allotransplantations.
Key words trachea allograft cryopreservation
深低温冷冻保存的组织可以保持其原有的活性和组织完整性，且抗原性降低，同种异体移植后，排斥反应轻，不必应用免疫抑制剂，避免了许多副作用和并发症 [1] 。目前，该技术已在多种组织、器官移植中应用 [2～4] ，但在气管移植中的应用还很少。我们通过对深低温冻储兔同种异体气管移植的实验研究，探讨将该技术引入气管移植领域的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料 实验动物为成年健康新西兰大白兔(体重2.5～3.0kg)。实验用药包括二甲基亚砜(DMSO)、海藻糖、小牛血清、M199。实验器材有程控降温仪、医用无损伤缝合针线、GESigna1.5T Horizon echo-speed超导磁共振扫描机。
1.2 方法
1.2.1 冷冻保护液的配制 [5] 在洁净工作台内配制冷冻保护液，以M199为介质，分别加入20%胎牛血清、10%DMSO、0.1mol/L海藻糖、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素、2.5μg/ml二性霉素B。4℃冰箱中保存备用。
1.2.2 同种异体移植气管段的获取、冷冻、保存及复温静脉注射异戊巴比妥钠(2.5mg/kg)将兔麻醉，沿颈部正中线作切口，无菌切取所需长度的颈段气管(从环状软骨下第5个气管环起向下切取5个气管环的气管段)。将气管段移入盛有冷冻保护剂的无菌生物冷冻袋中，每袋装1个气管段，程控降温仪程序降温，降温速率1℃/min，降至-80℃后投入液氮中保存。保存4周后，将冷冻袋从液氮中取出，置于37℃恒温水浴箱中，使气管段均匀快速解冻复温。复温后的气管段用于移植实验。
1.2.3 深低温冷冻同种异体气管移植实验
1.2.3.1 实验分组 实验分A、B、C组，分别为自体气管原位移植组、冷冻同种异体气管移植组以及新鲜未冷冻同种异体气管移植组。每组动物均为10只，移植气管的长度均为5个环。
1.2.3.2 手术方法 [6] 将麻醉好的兔仰放于手术台上，行颈部正中纵形切口，切开皮肤、皮下组织，显露胸锁乳突肌和双侧胸骨舌骨肌。游离一侧胸锁乳突肌和双侧胸骨舌骨肌，形成以上方为蒂的胸锁乳突肌瓣和以下方为蒂的双侧胸骨舌骨肌瓣。切开气管前筋膜，切取5个环的气管段，其上端切口位于环状软骨下第4和第5个气管环间。根据实验分组，分别将自体气管、冷冻气管及新鲜气管原位移植于缺损气管处。用6/0无损伤缝合线间断缝合，将一侧胸锁乳突肌瓣和双侧胸骨舌骨肌瓣联合包裹移植气管段，缝合固定于气管环上，形成稳定牢固的肌肉套包裹移植气管段。缝合切口。
1.2.4 术后观察和处置
1.2.4.1 生存状况及动物的生存率 每日观察并纪录动物的生存状况及生存时间。计算各组3个月的生存率。
1.2.4.2 磁共振成像(MRI)检查 术后4周对存活的兔行MRI检查，观察移植气管的形态和结构。使用GE Signa1.5T Horizon echo-speed超导磁共振扫描机，将麻醉好的兔仰卧于扫描台上，3.5英寸乳腺线圈固定于兔颈部两侧。常规轴面或矢状面T2 WI扫描。
1.2.4.3 气管通畅度的测定 对所有处死或死亡的动物均行气管通畅度测定。气管通畅度指移植气管最狭窄处的横断面面积与环状软骨下第2个气管环处横断面面积的比值。横断面面积的计算公式为:CSA=(a/2)×(b/2)×π，其中a为气管横向的直径，b为矢向的直径 [7] 。
1.2.4.4 病理学检查 对所有处死或死亡的动物均行大体和镜下病理学检查。标本在福尔马林溶液中固定，切片后行HE染色。光镜下对以下4个方面进行检查:①上皮的破坏情况;②气管腺的破坏情况;③软骨环的破坏情况;④间质组织的破坏情况，包括炎症细胞的浸润、肉芽组织样反应、坏死和单核细胞浸润。并按照Nakanishi [8] 的半定量法对读片结果进行分级。
1.3 统计学方法 采用Wilcoxson秩和检验方法(Wilcoxson rank-sum test)对结果进行统计学处理(SAS6.12统计分析软件)。
2 结果
2.1 生存状况和存活率 A和B组中除各有1只兔因腹泻厌食于术后4周、6周死亡外，所有兔均存活至3个月时被处死，存活率90%。C组兔均在术后2～4周死亡，死前均有明显的呼吸困难，存活率0。
2.2 磁共振成像(MRI)检查 A、B两组气管腔通畅，移植气管粘膜与受体气管连续，软骨沿管腔呈结节状排列，管腔通畅，结构完整，吻合口轻微突入管腔。C组表现为移植气管狭窄，气管壁塌陷。
2.3 移植气管的通畅度 A、B组40%发生轻度狭窄，轻微狭窄系吻合口瘢痕增生所致。C组所有兔均发生不同程度的狭窄(100%)。
2.4 病理学检查结果 A和B组中长期存活兔的移植气管标本大体观察与正常气管无明显差别，镜下为正常气管组织表现，移植气管粘膜为假复层纤毛柱状上皮所覆盖，软骨细胞无变性坏死，未见单核细胞浸润。C组大体见移植气管粘膜消失，软骨环脱落于管腔，管腔塌陷严重狭窄。镜下见粘膜消失，软骨变性、坏死，淋巴细胞和单核细胞浸润。半定量法病理评分结果如表1所示，统计学分析(表2)表明B与A组间差异无显著性(P>0.05)，而C组病理评分明显高于A和B组(P<0.05)，差异具有显著性。
表1 A、B和C组的病理评分(略)注:所列数值为均数±标准误
表2 A、B、C组病理评分行Wilcoxson秩和检验的P值(略)注:Δ表示P值过小，SAS未给出具体数值。
3 讨论
气管移植是粘膜、软骨和血管的复合移植。学者们大多认为气管是一种弱抗原，异体气管移植能够引起排斥反应，故在气管移植中仍需要免疫抑制 [7～9] 。环孢素作为有效的免疫抑制剂，已广泛应用于器官移植领域，同样也应用于气管移植实验中，并获得成功 [10] 。但使用免疫抑制剂有 许多副作用和并发症，如感染机会增加，免疫力下降，肿瘤复发，高血压、肾脏损害等。因此，降低移植物自身的抗原性才是控制免疫排斥反应的最佳选择。随着深低温冷冻技术的发展，冷冻后的组织可以保持其原有的活性和组织完整性，并能消减其抗原性，这既解决了供体的保存问题，又解决了移植后免疫排斥反应问题，深低温冻储的同种异体瓣膜和软骨的移植已成功应用于临床[3～4] 。
气管的结构相对简单，对深低温冷冻条件的要求也相对较低:实验研究表明全部未经冷冻的供体气管(C组)移植术后均发生气管粘膜和软骨的坏死，管腔狭窄或塌陷。而冻储4周(B组)的供体气管移植术后能够长期存活，与自体气管移植组基本相同。
我们在气管移植中应用了MRI检查，国内外文献还未见报道，这种方法简单易行，无创伤性。MRI显示A、B两组管腔通畅，气管粘膜连续，结构完整。新鲜未冷冻同种异体气管移植组(C组)表现为移植气管狭窄，气管壁塌陷。病理检查显示A、B组与正常气管无明显差别，而C组移植气管粘膜消失，管腔塌陷，单核细胞浸润。这证明了深低温冻储达4周的气管行单侧胸胸锁乳突肌瓣和双侧胸骨舌骨肌瓣联合包裹同种异体气管移植后完全成活，与自体移植的气管无明显差别。
通过此实验研究，我们认为气管与其它器官一样也具有抗原性，同种异体移植后会发生免疫排斥反应，影响其成活。这种免疫排斥反应是细胞介导的，其结局是引起气管上皮和软骨的缺血坏死。程控降温、液氮深低温长期冻储和快速复温，不但可以完整保存气管的活性，而且其抗原性被消减，同种异体移植术后可以长期存活。这对将来深低温冷冻气管库的建立以及同种异体气管移植在临床上的应用具有十分重要的意义。
参考文献
1 Takahiro M，Nobuyoshi S，et al. Experimental study of tracheal allotrans plantation with cryopreserved grafts. J Thorac Cardiovasc Surg，1998，116:262-266.
2 田立杰，王彦生，等.同种异体肌腱移植的临床应用.中华手外科杂志，1999，15(2):93-94.
3 王吉秋，荣佑宝.活性同种带瓣主动脉补片在法乐氏四联症右室流出道矫形中的应用.青岛医学院学报，1996，32(1):19-21.
4 程新德，赵天兰.低温冷冻同种异体软骨在整形外科的应用.蚌埠医学院学报，1998，23(4):225-226.
5, http://www.100md.com(张锋 侯生才 胡滨 王洋 李彤 张振葵 苗劲柏)