PTEN MMAC1 TEP1基因蛋白及E-钙粘蛋白在喉癌组织中的表达
【摘要】 目的 应用流式细胞术(FCM)分析了喉癌组织及喉正常粘膜中PTEN基因蛋白、E-钙粘蛋白的表达变化并对喉癌的发生、进展、转移的分子生物学机制进行初步的探讨。方法 喉鳞状细胞癌石蜡包埋固定手术标本40例，喉正常粘膜15例(取自非恶性肿瘤手术)作为对照组，采用流式细胞术检测喉癌组织及正常粘膜的PTEN基因蛋白、E-钙粘蛋白的含量并进行分析。结果 喉癌组织中PTEN基因蛋白的阳性表达率仅为5%，其FI值均明显低于正常粘膜(P<0.05)。E-钙粘蛋白的阳性表达率为44%，其FI值亦明显低于正常粘膜(P<0.0.5)。临床Ⅲ～Ⅳ期和T 3 、T 4 级病变癌组织中PTEN基因蛋白、E-钙粘蛋白的FI值明显低于Ⅰ～Ⅱ期组和T 1 、T 2 级病变者(P<0.05)，淋巴结转移组的PTEN基因蛋白，E-Cadherin的FI值明显低于无淋巴结转移组。结论 PTEN基因蛋白、E-钙粘蛋白在喉癌组织中的表达明显低于喉正常粘膜，且与临床分期、T分级及淋巴结转移呈负相关，与病理分级呈正相关。
关键词 喉癌 鳞状细胞癌 PTEN E-钙粘蛋白 流式细胞术 进展 转移
The expression of PTEN epithelial-cadherin in laryngeal squamous carcinoma
Xu Yaosheng，Wu Haichun，Wang Jingwen，et al.
Dept.of ENT，International Peace Hospital，Hengshui，Hebei053000.
【Abstract】 Objective This research analyzed the expression changes of PTEN and E-cadherion in laryngeal squamous carcinoma and normal laryngeal mucosa，and the correlation between them.We investigated the molecular biˉologic mechanism of the development and progression invasion and metastasis of laryngeal carcinoma.Methods 40laˉryngeal carcinoma samples were analyzed and meanwhile15normal laryngeal mucosa samples were studied as the conˉtrols.We measured the expression of PTEN and E-cadherin of all samples with the flow cytometer.Results The positive rate of PTEN protein expression in laryngeal carcinoma was5%and the FI of it significantly lower than that of normal mucosa(all P<0.01).The positive rate of E-cadherion expression in laryngeal carcinoma was44%and the FI of it alsoobvious lower than that of normal mucosa(all P<0.01)，The FI of PTEN and E-Cadherin in the staging ofⅢ-Ⅳand T 3 .T 4 classification were significantly lower than those inⅠ-Ⅱand T 1 -T 2 (P<0.01).The FI of PTEN and E-catherine in metastatic group was significantly lower than that in non-metastatic group(P<0.01).Conclusion The expression of PTEN protein and E-cadherion in laryngeal carcinoma was significantly lower than that in normal muscosa and negatively correlated with the clinical staging，TNM classification and metastasis.
Key words laryngeal carcinoma PTEN E-cadherim flow cytometry progression metastasis
PTEN/MMAC1/TEP1基因是由Steck等三个研究小组1997年分别发现的(以下简称PTEN) [1] 。其表达产物参与细胞生长调节，并在肿瘤细胞的浸润、血管发生及肿瘤转移中起一定作用。喉癌的侵袭转移，肿瘤细胞间粘附能力下降，肿瘤细胞从原发部位脱落，是肿瘤浸润转移的第一步。上皮型钙粘蛋白(Epithelial Cadherin，E-cadherin即E-钙粘蛋白)在维持细胞粘附过程中起重要作用，其表达降低或功能异常都会造成细胞间粘附能力的下降 [2] 。本研究应用流式细胞术(FCM)分析了40例喉癌标本中PTEN基因蛋白、E-钙粘蛋白的表达并对他们进行分组对比，并分析其相关性，以期能揭示PTEN、E-钙粘蛋白在喉癌的发生、发展、转移的分子生物学机制中的作用，并对喉癌的临床治疗提供一定的理论依据。
1 资料和方法
1.1 临床资料 所有病例来自1997年1月～2001年1月哈励逊国际和平医院耳鼻喉-头颈外科的住院病人，术前均未经放化疗，经常规石蜡包埋的手术标本，其中男37例，女3例，年龄38～72岁(中位年龄62岁)。病理分级:Ⅰ级8例，Ⅱ级28例，Ⅲ级4例。根据UICC1997年国际TNM分期标准:T 1 N 0 M 0 6例、T 2 N 0 M 0 12例、T 2 N 1 M 0 3例、T 3 N 1 M 0 12例、T 3 N 2 M0 3例、T 4 N 1 M 0 3例、T 4 N 0 M 0 1例。临床分期:Ⅰ期6例、Ⅱ期12例、Ⅲ期15例、Ⅳ期7例。另取经10%福尔马林固定，石蜡包埋的正常喉粘膜标本15例作为正常对照(标本取自非恶性肿瘤患者的喉粘膜)，其病理均为正常喉组织或慢性炎症。在每例石蜡包埋组织上切取厚约4mm的组织切片，经HE染色和病理学检查以核实诊断。对已行颈廓清术的病例，将其颈廓清标本重新进行细致切片以确定最后的N分级。一抗:鼠抗人PTEN蛋白单克隆抗体(Mouse Anti-PTEN美国Zymed公司产品)。鼠抗人E-Cadherin克隆系(Mono clonal mouse Ant-E-Cadherin)二抗:羊抗鼠:FiTc-LgG(Jackson Immuno Keaseaech公司产品)。
1.2 FCM检测方法 采用BD公司FAC-420型流式细胞仪进行检测，光源为2W氩离子激光器，激发波波长为488nm输出功率300W，测量数据、图形，同步输入HP-300ConSort30计算机应用相应的软件程序进行数据处理，以鸡红细胞作为标准样品，调整CV值在5%以内。
1.3 结果的判定
1.3.1 基因蛋白表达的定量分析 按照Morkve等提出的荧光指数(Fluorescence Index FI)表示PTEN基因蛋白、E-钙粘蛋白及基质金属蛋白酶2-表达的相对含量公式为FI=实验样品的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度正常喉粘膜细胞的平均荧光强度
1.3.2 阳性结果的判定 肿瘤细胞的FI值大于正常粘膜FI值的X±2s为阳性，反之为阴性。
1.4 统计学处理 所有数据经Access数据库整理，应用SAS公司的SAS统计软件6.12TSo2ofor Windows。进行配对t检验，成组t检验，Fisher精确概率检验，单因素分析应用时序检验，X 2 检验，以双侧P≤0.05为差异有显著性，P≤0.01为差异有非常显著性。
2 结果
喉癌组织中PTEN基因蛋白的FI值明显低于正常喉粘膜，其差异有非常显著性(P<0.01)，癌组织中E-钙粘蛋白的FI值明显低于正常喉粘膜组织，其差异有显著性(P<0.05)。淋巴结转移组PTEN基因蛋白FI值明显低于非淋巴结转移组其差异有显著性(P<0.05)。淋巴结转移组的E-钙粘蛋白FI值明显低于非淋巴结转移组，其差异有非常显著性(P<0.01)。PTEN基因蛋白在临床Ⅲ～Ⅳ期的喉癌组织中的表达明显低于Ⅰ～Ⅱ期，其差异有显著性(P<0.05)。E-钙粘蛋白在临床Ⅲ～Ⅳ期的喉癌组织中的表达明显低于Ⅰ～Ⅱ期，其差异有非常显著性(P<0.01)。PTEN基因蛋白在N + 和N 0 两组中呈低表达。阳性表达率两组分别为0%和10.5%。两组间差异无显著性(P>0.05)，而E-cadherin在两组中也有较低表达率，其阳性表达率分别为18.9%和52.6%，其差异有非常显著性(P<0.01)。本组病例中病理分级以中等分化为主，占70%。可以观察到肿瘤分化程度越低其PTEN基因蛋白、E-钙粘蛋白FI值越低(即成正相关趋势)，但统计学检测差异无显著性。
3 讨论
恶性肿瘤具有转移、浸润特性，是与良性肿瘤区别的最重要特点。肿瘤的发生、发展、浸润、转移是一个十分复杂的生物学现象。分子生物学表明肿瘤的发生、发展与抑癌基因功能的丧失以及癌细胞之间及基质间的粘附作用减弱均有利于肿瘤的生长和转移。PTEN是新近发现的抑癌基因。其杂和性丢失(LOH)与许多肿瘤的发生、发展有密切关系，而E-cadherin的表达量降低能降低细胞间的粘附作用，因此二者被认为在肿瘤的发生、浸润、转移中起了非常重要的作用。PTEN基因定位于第10q23染色体。具有9个外显子。PTEN基因蛋白定位于胞浆，在胞浆信号传递中起着复杂而重要的作用。PTEN对细胞内肌醇第二信使磷酸酯肌醇(3，4，5)三磷酸(PIP 3 )去磷酸化，抑制依赖PIP 3 激活的丝苏氨酸激酶PKB/AKT活性，影响其下激通路的作用靶包括BAD、G 1 期CDK抑制因子、P27翻译抑制因子、4E-BP1等的磷酸化水平从而诱导凋亡，并介导G 1 期停顿。影响基因 的表达，对细胞生长具有负性调节作用 [3] 。此外PTEN还直接使局部粘附激酶(FAK)及SRC脱磷酸，影响细胞迁移、浸润、整合素介导的细胞铺展及局部粘附的形成。PTEN丢失细胞会丢失这种负调节作用，无疑促进肿瘤的进行性生长。有研究表明肿瘤细胞过表达PTEN抑制细胞移动，反之PTEN则增强移动。此外对整合素介导的细胞扩展和局灶粘附的形成PTEN均起下调作用，这是通过抑制局灶粘附激酶(FAK)的磷酸化实现的，据此PTEN是抑制侵袭转移的基因。钙粘附素(Cadherin，CF)是一组钙依赖性、细胞粘附分子，主要介导细胞与细胞的粘附 [4] 。其中上皮型E-钙粘蛋白(E-Cadherin)是一类介导同种细胞互相粘附的钙依赖性跨膜糖蛋白，参与形成和维护正常细胞间的联结，是介导细胞间连接最重要的一类分子。它通过连结素与细胞骨架形成一复合物，它的活性也可影响紧密连接、缝隙连结和桥粒连结。肿瘤从原发部位脱落是肿瘤转移的第一步，这与细胞粘附性减低有关。钙离子依赖性细胞粘附分子，E-Cadherin是跨膜蛋白，不表达或异位表达的E-Cadherin为表达异常的E-Cadherin，失去正常功能导致细胞和细胞间的粘附功能降低或消失，使肿瘤细胞移动性增强 [5] ，造成肿瘤细胞从原发部位脱落并向远处转移。因此E-Cadherin表达异常在肿瘤的转移形成过程中起重要作用。本研究应用FCM对喉癌组织和对照组喉粘膜的PTEN基因蛋白进行了定量和定性分析，结果表明PTEN基因蛋白在喉癌组织中的表达量随临床分期和T分期的增高及淋巴结转移的出现而增加，即呈负相关，但其阳性表达率很低。这提示PTEN不仅与喉癌的发生有关，而且与喉癌的浸润转移有关。尹红玲等利用SP免疫组化技术检测PTEN蛋白在乳腺癌的表达，结果乳腺癌PT, 百拇医药(许尧生 武海春 王景文 杨树华)
关键词 喉癌 鳞状细胞癌 PTEN E-钙粘蛋白 流式细胞术 进展 转移
The expression of PTEN epithelial-cadherin in laryngeal squamous carcinoma
Xu Yaosheng，Wu Haichun，Wang Jingwen，et al.
Dept.of ENT，International Peace Hospital，Hengshui，Hebei053000.
【Abstract】 Objective This research analyzed the expression changes of PTEN and E-cadherion in laryngeal squamous carcinoma and normal laryngeal mucosa，and the correlation between them.We investigated the molecular biˉologic mechanism of the development and progression invasion and metastasis of laryngeal carcinoma.Methods 40laˉryngeal carcinoma samples were analyzed and meanwhile15normal laryngeal mucosa samples were studied as the conˉtrols.We measured the expression of PTEN and E-cadherin of all samples with the flow cytometer.Results The positive rate of PTEN protein expression in laryngeal carcinoma was5%and the FI of it significantly lower than that of normal mucosa(all P<0.01).The positive rate of E-cadherion expression in laryngeal carcinoma was44%and the FI of it alsoobvious lower than that of normal mucosa(all P<0.01)，The FI of PTEN and E-Cadherin in the staging ofⅢ-Ⅳand T 3 .T 4 classification were significantly lower than those inⅠ-Ⅱand T 1 -T 2 (P<0.01).The FI of PTEN and E-catherine in metastatic group was significantly lower than that in non-metastatic group(P<0.01).Conclusion The expression of PTEN protein and E-cadherion in laryngeal carcinoma was significantly lower than that in normal muscosa and negatively correlated with the clinical staging，TNM classification and metastasis.
Key words laryngeal carcinoma PTEN E-cadherim flow cytometry progression metastasis
PTEN/MMAC1/TEP1基因是由Steck等三个研究小组1997年分别发现的(以下简称PTEN) [1] 。其表达产物参与细胞生长调节，并在肿瘤细胞的浸润、血管发生及肿瘤转移中起一定作用。喉癌的侵袭转移，肿瘤细胞间粘附能力下降，肿瘤细胞从原发部位脱落，是肿瘤浸润转移的第一步。上皮型钙粘蛋白(Epithelial Cadherin，E-cadherin即E-钙粘蛋白)在维持细胞粘附过程中起重要作用，其表达降低或功能异常都会造成细胞间粘附能力的下降 [2] 。本研究应用流式细胞术(FCM)分析了40例喉癌标本中PTEN基因蛋白、E-钙粘蛋白的表达并对他们进行分组对比，并分析其相关性，以期能揭示PTEN、E-钙粘蛋白在喉癌的发生、发展、转移的分子生物学机制中的作用，并对喉癌的临床治疗提供一定的理论依据。
1 资料和方法
1.1 临床资料 所有病例来自1997年1月～2001年1月哈励逊国际和平医院耳鼻喉-头颈外科的住院病人，术前均未经放化疗，经常规石蜡包埋的手术标本，其中男37例，女3例，年龄38～72岁(中位年龄62岁)。病理分级:Ⅰ级8例，Ⅱ级28例，Ⅲ级4例。根据UICC1997年国际TNM分期标准:T 1 N 0 M 0 6例、T 2 N 0 M 0 12例、T 2 N 1 M 0 3例、T 3 N 1 M 0 12例、T 3 N 2 M0 3例、T 4 N 1 M 0 3例、T 4 N 0 M 0 1例。临床分期:Ⅰ期6例、Ⅱ期12例、Ⅲ期15例、Ⅳ期7例。另取经10%福尔马林固定，石蜡包埋的正常喉粘膜标本15例作为正常对照(标本取自非恶性肿瘤患者的喉粘膜)，其病理均为正常喉组织或慢性炎症。在每例石蜡包埋组织上切取厚约4mm的组织切片，经HE染色和病理学检查以核实诊断。对已行颈廓清术的病例，将其颈廓清标本重新进行细致切片以确定最后的N分级。一抗:鼠抗人PTEN蛋白单克隆抗体(Mouse Anti-PTEN美国Zymed公司产品)。鼠抗人E-Cadherin克隆系(Mono clonal mouse Ant-E-Cadherin)二抗:羊抗鼠:FiTc-LgG(Jackson Immuno Keaseaech公司产品)。
1.2 FCM检测方法 采用BD公司FAC-420型流式细胞仪进行检测，光源为2W氩离子激光器，激发波波长为488nm输出功率300W，测量数据、图形，同步输入HP-300ConSort30计算机应用相应的软件程序进行数据处理，以鸡红细胞作为标准样品，调整CV值在5%以内。
1.3 结果的判定
1.3.1 基因蛋白表达的定量分析 按照Morkve等提出的荧光指数(Fluorescence Index FI)表示PTEN基因蛋白、E-钙粘蛋白及基质金属蛋白酶2-表达的相对含量公式为FI=实验样品的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度正常喉粘膜细胞的平均荧光强度
1.3.2 阳性结果的判定 肿瘤细胞的FI值大于正常粘膜FI值的X±2s为阳性，反之为阴性。
1.4 统计学处理 所有数据经Access数据库整理，应用SAS公司的SAS统计软件6.12TSo2ofor Windows。进行配对t检验，成组t检验，Fisher精确概率检验，单因素分析应用时序检验，X 2 检验，以双侧P≤0.05为差异有显著性，P≤0.01为差异有非常显著性。
2 结果
喉癌组织中PTEN基因蛋白的FI值明显低于正常喉粘膜，其差异有非常显著性(P<0.01)，癌组织中E-钙粘蛋白的FI值明显低于正常喉粘膜组织，其差异有显著性(P<0.05)。淋巴结转移组PTEN基因蛋白FI值明显低于非淋巴结转移组其差异有显著性(P<0.05)。淋巴结转移组的E-钙粘蛋白FI值明显低于非淋巴结转移组，其差异有非常显著性(P<0.01)。PTEN基因蛋白在临床Ⅲ～Ⅳ期的喉癌组织中的表达明显低于Ⅰ～Ⅱ期，其差异有显著性(P<0.05)。E-钙粘蛋白在临床Ⅲ～Ⅳ期的喉癌组织中的表达明显低于Ⅰ～Ⅱ期，其差异有非常显著性(P<0.01)。PTEN基因蛋白在N + 和N 0 两组中呈低表达。阳性表达率两组分别为0%和10.5%。两组间差异无显著性(P>0.05)，而E-cadherin在两组中也有较低表达率，其阳性表达率分别为18.9%和52.6%，其差异有非常显著性(P<0.01)。本组病例中病理分级以中等分化为主，占70%。可以观察到肿瘤分化程度越低其PTEN基因蛋白、E-钙粘蛋白FI值越低(即成正相关趋势)，但统计学检测差异无显著性。
3 讨论
恶性肿瘤具有转移、浸润特性，是与良性肿瘤区别的最重要特点。肿瘤的发生、发展、浸润、转移是一个十分复杂的生物学现象。分子生物学表明肿瘤的发生、发展与抑癌基因功能的丧失以及癌细胞之间及基质间的粘附作用减弱均有利于肿瘤的生长和转移。PTEN是新近发现的抑癌基因。其杂和性丢失(LOH)与许多肿瘤的发生、发展有密切关系，而E-cadherin的表达量降低能降低细胞间的粘附作用，因此二者被认为在肿瘤的发生、浸润、转移中起了非常重要的作用。PTEN基因定位于第10q23染色体。具有9个外显子。PTEN基因蛋白定位于胞浆，在胞浆信号传递中起着复杂而重要的作用。PTEN对细胞内肌醇第二信使磷酸酯肌醇(3，4，5)三磷酸(PIP 3 )去磷酸化，抑制依赖PIP 3 激活的丝苏氨酸激酶PKB/AKT活性，影响其下激通路的作用靶包括BAD、G 1 期CDK抑制因子、P27翻译抑制因子、4E-BP1等的磷酸化水平从而诱导凋亡，并介导G 1 期停顿。影响基因 的表达，对细胞生长具有负性调节作用 [3] 。此外PTEN还直接使局部粘附激酶(FAK)及SRC脱磷酸，影响细胞迁移、浸润、整合素介导的细胞铺展及局部粘附的形成。PTEN丢失细胞会丢失这种负调节作用，无疑促进肿瘤的进行性生长。有研究表明肿瘤细胞过表达PTEN抑制细胞移动，反之PTEN则增强移动。此外对整合素介导的细胞扩展和局灶粘附的形成PTEN均起下调作用，这是通过抑制局灶粘附激酶(FAK)的磷酸化实现的，据此PTEN是抑制侵袭转移的基因。钙粘附素(Cadherin，CF)是一组钙依赖性、细胞粘附分子，主要介导细胞与细胞的粘附 [4] 。其中上皮型E-钙粘蛋白(E-Cadherin)是一类介导同种细胞互相粘附的钙依赖性跨膜糖蛋白，参与形成和维护正常细胞间的联结，是介导细胞间连接最重要的一类分子。它通过连结素与细胞骨架形成一复合物，它的活性也可影响紧密连接、缝隙连结和桥粒连结。肿瘤从原发部位脱落是肿瘤转移的第一步，这与细胞粘附性减低有关。钙离子依赖性细胞粘附分子，E-Cadherin是跨膜蛋白，不表达或异位表达的E-Cadherin为表达异常的E-Cadherin，失去正常功能导致细胞和细胞间的粘附功能降低或消失，使肿瘤细胞移动性增强 [5] ，造成肿瘤细胞从原发部位脱落并向远处转移。因此E-Cadherin表达异常在肿瘤的转移形成过程中起重要作用。本研究应用FCM对喉癌组织和对照组喉粘膜的PTEN基因蛋白进行了定量和定性分析，结果表明PTEN基因蛋白在喉癌组织中的表达量随临床分期和T分期的增高及淋巴结转移的出现而增加，即呈负相关，但其阳性表达率很低。这提示PTEN不仅与喉癌的发生有关，而且与喉癌的浸润转移有关。尹红玲等利用SP免疫组化技术检测PTEN蛋白在乳腺癌的表达，结果乳腺癌PT, 百拇医药(许尧生 武海春 王景文 杨树华)