菘蓝不同栽培居群的等位酶分析
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王寅 乔传卓 王中仁 侯鑫 刘盛
摘 要 目的：对菘蓝Isatis indigotica Fort.不同栽培居群进行等位酶分析研究。方法：在全国各地采集菘蓝13个二倍体栽培居群的种子，异地栽培于上海市崇明岛同一块试验田。以水平切片淀粉凝胶电泳方法，对菘蓝等位酶多态性进行研究，分析了8个酶系统的15个等位酶位点。结果：等位酶多态位点百分数P为13.3%～33.3%，每个位点的等位基因平均数A为1.1～1.5，预期杂合度He为0.027～0.109，菘蓝二倍体居群间基因分化比率为8.2%。结论：菘蓝不同栽培居群的等位酶谱有明显差别，表明菘蓝种内存在遗传变异。
关键词：菘蓝；栽培居群；等位酶分析
十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.为常用中药材大青叶、板蓝根的主要来源，是我国南北各地大宗栽培的重要药用植物，历版中国药典均有收载。研究表明不同栽培居群的菘蓝在药材性状、理化特征、有效成分含量和药理效用等方面存在显著差异[1,2]。生态环境的差异以及物种遗传变异是导致药材品质差异的主要影响因素[3,4]。
, 百拇医药
等位基因酶(allozyme，简称等位酶)，是同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式，作为结构基因编码的产物，其变化能很好地代表DNA分子水平上的变化，表明等位基因变化的存在。等位酶的遗传和表达遵循孟德尔定律，酶位点的不同等位基因都是等显表达的，从酶谱上可以直接分析识别出编码它们的等位基因，且能统计出等位基因频率和基因型频率；作为一种稳定的基因组标志比形态特征更直接地反映了遗传信息，通过众多位点的抽样分析可以推断或代表整个基因组的遗传学情况。等位酶分析方法目前是了解天然居群的遗传结构、基因丰富程度以及栽培作物种质资源遗传多样性的重要手段[5]。
我们将各地不同栽培居群菘蓝移栽于上海市崇明岛同一块试验田内，采用水平切片淀粉凝胶电泳方法对异地栽培的不同居群菘蓝进行等位酶分析，考察菘蓝种内居群间的遗传结构差异，旨在为深入研究种质遗传资源因素对菘蓝药材优良品种形成的作用及调控机制提供依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 药材和仪器 在全国各地采集不同栽培居群的菘蓝种子，异地栽培于上海市崇明岛同一块试验田，经鉴定为Isatis indigotica Fort.，编号见表1。通过细胞学观察，确证均为二倍体植株，染色体数目2 n＝14[6]。实验所用试剂均为Sigma公司产品。“SG-ZW”型水平切片电泳仪(北京六一仪器厂)，玻璃门冰箱(青岛海尔公司)，-80℃低温冰箱(美国Frigor公司)。
表1 菘蓝不同栽培居群的遗传变异指标
Tab 1 Genetic variability in 13 populations of Isatis indigotica Fort.
Population A P Ho He
1 Fuyang, Anhui
1.4 (0.2) 26.7 0.067(0.031) 0.078(0.039)
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2 Sixian, Anhui 1.4 (0.2) 13.3 0.030(0.020) 0.040(0.023)
3 Bozhou, Anhui 1.2 (0.1) 13.3 0.028(0.019) 0.031(0.022)
4 Yuzhou, Henan 1.3 (0.2) 26.7 0.053(0.026) 0.073(0.045)
5 Chifeng, Neimonggol 1.4 (0.2) 20.0 0.047(0.027) 0.079(0.042)
6 Taigu, Shanxi 1.1 (0.1) 13.3 0.015(0.015) 0.027(0.018)
7 Sheyang, Jiangshu 1.2 (0.1) 20.0 0.040(0.022) 0.037(0.020)
, 百拇医药
8 Shengyang, Liaoning 1.3 (0.2) 26.7 0.030(0.014) 0.035(0.017)
9 Lingquan, Anhui 1.3 (0.2) 13.3 0.063(0.038) 0.068(0.040)
10 Anguo, Hebei 1.4 (0.2) 26.7 0.047(0.021) 0.059(0.026)
11 Xingtai, Hebei 1.3 (0.2) 26.7 0.037(0.017) 0.056(0.027)
12 Xianyang, Shanxi 1.5 (0.2) 33.3 0.070(0.033) 0.109(0.043)
13 Taixing, Jiangshu 1.4 (0.2) 26.7 0.070(0.039) 0.059(0.031)
, 百拇医药
Standard deviation in parentheses
1.2 方法 按照文献[5]的配方配制复杂提取缓冲液，电泳、凝胶缓冲液。将移栽的菘蓝以居群为单位，各随机取样20株，连根新鲜保存，取各株的新鲜幼嫩绿叶1～2 cm2，加3～5滴复杂磷酸盐缓冲液研磨均匀，用新华1号滤纸剪成2.5 cm×6.5 cm的沁子，蘸取提取液，于-80℃冰箱保存备用。
称取水解淀粉31.5 g，加1 000 ml蒸馏水，搅匀，煮沸，抽气，注入模盘内，待冷却后,表面加盖玻璃板，室温下冷凝过夜，使凝胶浓度为12.5%。
每次电泳前在冷冻保存的沁子上加1滴2%的2-巯基乙醇，使其解冻后上样。在4℃冰箱中，使用“SG-ZW”型250 ml水平切片电泳槽进行电泳，控制电流为30～35 mA。以溴酚蓝钠盐为凝胶前锋线标记，跑出10～15 cm，即可停止电泳，将凝胶切片染色。共测定了8个酶系统(表2)，其中AAT和LAP酶采用液染法，PGD，PGI，PGM，IDH，HEX和MDH酶采用胶染法。
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对酶谱进行记录时，若有多个位点，从阳极到阴极，依次用1,2,……表示各个位点，对每个位点的不同等位基因，从阳极到阴极，依次用a,b,c,……表示。在跑每一块胶时，控制电泳条件，温度和电泳时间基本相同，使不同胶上的酶谱具有可比性，最后对不同基因型的材料，再选出具代表性的放在同一块胶上电泳，以确定等位基因的数目。
表2 检测的酶系统和电泳、凝胶缓冲系统
Tab 2 Enzyme assayed and buffers systems used
Enzyme systems Abbr. E C No. Buffers systems
Phosphoglucomutase PGM EC 5.4.2.2 Sodium borate/Tris-Citric acid (pH 8.6)
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Phosphoglucoisomerase PGI EC 5.3.1.9 Sodium borate/Tris-Citric acid (pH 8.6)
Phosphogluconate dehydrogenase PGD EC 1.1.1.44 Lithium borate/Tris-Citric acid (pH 8.0)
Hexokinase HEX EC 2.7.1.1 Sodium borate/Tris-Citric acid (pH 8.6)
Isocitric dehydrogenase IDH EC 1.1.1.42 Lithium borate/Tris-Citric acid (pH 8.0)
Malate dehydrogenase MDH EC 1.1.1.37 Lithium borate/Tris-Citric acid (pH 8.0)
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Leucine aminopeptidase LAP EC 3.4.11.1 Morpholine-Citric acid
Aspartate aminotransferase AAT EC 2.6.1.1 Morpholine-Citric acid
根据各个居群等位基因的组成和频率，计算下列遗传变异度量指标：多态位点百分数P(采用具两个以上等位基因，且最常见等位基因频率等于或小于0.99的标准)；每个位点的等位基因平均数(A)；平均预期杂合度He，平均观察杂合度Ho，统计量F，包括亚群体的固定指数FIS，总群体的固定指数FIT，亚群体间的基因分化比率FST(相当于基因分化系数GST)；以p-distance公式计算遗传距离D。
2 结 果
实验获取了8个酶系统共15个等位基因位点的资料，其中6个为多态位点，编码多态位点的等位基因和居群中的各种基因型模式见图1。
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图1 等位酶谱带的多态位点、等位基因(X)及居群中的各种基因型(XX)模式
Fig 1 Allozyme bands and the relevant polymorphic loci and alleles and the genotypes from populations samples
菘蓝种内不同栽培居群的多态位点百分数P为13.3%～33.3%，每个位点的等位基因平均数A为1.1～1.5，平均观察杂合度Ho为0.015～0.070，平均预期杂合度He为0.027～0.109。He又叫基因多样性指数，可反映群体等位基因的丰富程度，表明如果随机交配，存在2.7%～10.9 %的杂合体(表1)。
基因分化系数(表3)可以衡量群体的分化程度。亚群体基因分化比率的平均值为0.082，表明二倍体菘蓝群体间存在8.2%的变异，居群间的分化程度较低。Pgi-2，Lap-1 两位点的FIS, FIT值为负，表明位点杂合度过量及整个种内此位点杂合度大于期望值。菘蓝不同栽培居群的等位酶多态性反映了其种内遗传多样性及遗传结构的变异。遗传距离计算表明内蒙古赤峰居群和江苏射阳居群之间的遗传距离最大，为0.012，而地理位置相近的菘蓝栽培居群，如河北邢台与河北安国，内蒙古赤峰与辽宁沈阳，安徽泗县与安徽临泉，安徽阜阳与河南禹州，遗传距离较小。表明菘蓝种内的遗传变异在地理分布上有一定的趋向性。
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表3 菘蓝不同栽培居群多态位点的F统计量
Tab 3 F-statistics of the polymorphic loci in different
cultivated populations of Isatis indigotica Fort.
Locus FIS FIT FST
Pgi-2 -0.062
-0.009
0.050
Pgm-2 0.579 0.626 0.111
Pgd-1 0.377 0.431 0.086
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Pgd-2 0.140 0.212 0.084
Lap-1 -0.095 -0.055 0.036
Mdh-1 0.029 0.121 0.094
Mean 0.189 0.256 0.082
3 讨 论
居群生物学研究认为物种是由一个或若干个多少间断的居群所组成的，居群则是由共享一个基因库(gene pool)的许多个体所组成的，这些个体在遗传上存在着差异，构成种的各个居群的遗传组成在空间和时间上并不是绝对均匀、随机分布的，而常常是非随机分布、存在着变化的。物种及其多样性的居群内存在个体变异和居群变异。一个物种具有广泛的分布区时，它的各个不同地区的居群往往具有不同的基因型，或称地方特化基因型(local specialized genotype)，这些基因型是由于不同的生态或地理的条件长期作用塑造而成的[7]。
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菘蓝原产我国，是临床常用的清热解毒中药，对其药材道地性研究深受关注。经文献查考及产地原植物调查未发现存在野生居群，因栽培历史长久，地理间隔大，彼此间交配机会少，形成了一些地方繁育居群，在进化中遗传发生漂变，表现在形态上则为茎生叶的基部有箭形和圆形的不同，果实的大小和形状不一致[6]。
对异地栽培菘蓝药材的研究结果表明，在相同生态环境中生长的不同居群菘蓝在化学成分、药理作用等方面依然存在显著差别；同一个居群菘蓝的品质在移栽前后没有明显变化。等位酶分析结果又证实了菘蓝种内不同栽培居群在遗传结构上确实存在差异。这表明物种遗传因素较生态环境因素在菘蓝药材品质形成中起更大作用，菘蓝种内遗传变异是导致不同来源药材质量有差别的主要原因之一。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670878)
作者简介：王寅(1974-)，男(汉族)，博士生
, 百拇医药
王寅(第二军医大学药学院一药学教研室，上海 200433)
乔传卓(第二军医大学药学院一药学教研室，上海 200433)
刘盛(第二军医大学药学院一药学教研室，上海 200433)
王中仁(中国科学院植物研究所系统与进化开放实验室)
侯鑫(中国科学院植物研究所系统与进化开放实验室)
参考文献
[1] 刘 盛，乔传卓. 不同栽培居群板蓝根性状及显微特征的变异研究[J]. 中草药,1999, 30(5):368-371.
[2] 王 寅,尹 茶,乔传卓,等.不同栽培居群菘蓝叶中5种有机酸成分的含量差异[J].第二军医大学学报,1999,20(6):374-376.
, 百拇医药
[3] 肖小河,夏文娟,陈善墉.中国道地药材研究概论[J].中国中药杂志,1995,20(6):323-326.
[4] 黄璐琦,张瑞贤.“道地药材”的生物学探讨[J].中国中药杂志,1997,22(9):563-566.
[5] 王中仁 主编. 植物等位酶分析[M].北京：科学出版社,1996.1-6.
[6] 乔传卓,崔 熙.菘蓝和欧洲菘蓝的鉴别研究[J].植物分类学报,1984,22(3):237-242.
[7] 陈家宽.居群生物学与进化生物学.见：陈家宽,杨 继 主编.植物进化生物学[M]. 武汉：武汉大学出版社,1994. 9-13., 百拇医药
摘 要 目的：对菘蓝Isatis indigotica Fort.不同栽培居群进行等位酶分析研究。方法：在全国各地采集菘蓝13个二倍体栽培居群的种子，异地栽培于上海市崇明岛同一块试验田。以水平切片淀粉凝胶电泳方法，对菘蓝等位酶多态性进行研究，分析了8个酶系统的15个等位酶位点。结果：等位酶多态位点百分数P为13.3%～33.3%，每个位点的等位基因平均数A为1.1～1.5，预期杂合度He为0.027～0.109，菘蓝二倍体居群间基因分化比率为8.2%。结论：菘蓝不同栽培居群的等位酶谱有明显差别，表明菘蓝种内存在遗传变异。
关键词：菘蓝；栽培居群；等位酶分析
十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.为常用中药材大青叶、板蓝根的主要来源，是我国南北各地大宗栽培的重要药用植物，历版中国药典均有收载。研究表明不同栽培居群的菘蓝在药材性状、理化特征、有效成分含量和药理效用等方面存在显著差异[1,2]。生态环境的差异以及物种遗传变异是导致药材品质差异的主要影响因素[3,4]。
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等位基因酶(allozyme，简称等位酶)，是同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式，作为结构基因编码的产物，其变化能很好地代表DNA分子水平上的变化，表明等位基因变化的存在。等位酶的遗传和表达遵循孟德尔定律，酶位点的不同等位基因都是等显表达的，从酶谱上可以直接分析识别出编码它们的等位基因，且能统计出等位基因频率和基因型频率；作为一种稳定的基因组标志比形态特征更直接地反映了遗传信息，通过众多位点的抽样分析可以推断或代表整个基因组的遗传学情况。等位酶分析方法目前是了解天然居群的遗传结构、基因丰富程度以及栽培作物种质资源遗传多样性的重要手段[5]。
我们将各地不同栽培居群菘蓝移栽于上海市崇明岛同一块试验田内，采用水平切片淀粉凝胶电泳方法对异地栽培的不同居群菘蓝进行等位酶分析，考察菘蓝种内居群间的遗传结构差异，旨在为深入研究种质遗传资源因素对菘蓝药材优良品种形成的作用及调控机制提供依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 药材和仪器 在全国各地采集不同栽培居群的菘蓝种子，异地栽培于上海市崇明岛同一块试验田，经鉴定为Isatis indigotica Fort.，编号见表1。通过细胞学观察，确证均为二倍体植株，染色体数目2 n＝14[6]。实验所用试剂均为Sigma公司产品。“SG-ZW”型水平切片电泳仪(北京六一仪器厂)，玻璃门冰箱(青岛海尔公司)，-80℃低温冰箱(美国Frigor公司)。
表1 菘蓝不同栽培居群的遗传变异指标
Tab 1 Genetic variability in 13 populations of Isatis indigotica Fort.
Population A P Ho He
1 Fuyang, Anhui
1.4 (0.2) 26.7 0.067(0.031) 0.078(0.039)
, 百拇医药
2 Sixian, Anhui 1.4 (0.2) 13.3 0.030(0.020) 0.040(0.023)
3 Bozhou, Anhui 1.2 (0.1) 13.3 0.028(0.019) 0.031(0.022)
4 Yuzhou, Henan 1.3 (0.2) 26.7 0.053(0.026) 0.073(0.045)
5 Chifeng, Neimonggol 1.4 (0.2) 20.0 0.047(0.027) 0.079(0.042)
6 Taigu, Shanxi 1.1 (0.1) 13.3 0.015(0.015) 0.027(0.018)
7 Sheyang, Jiangshu 1.2 (0.1) 20.0 0.040(0.022) 0.037(0.020)
, 百拇医药
8 Shengyang, Liaoning 1.3 (0.2) 26.7 0.030(0.014) 0.035(0.017)
9 Lingquan, Anhui 1.3 (0.2) 13.3 0.063(0.038) 0.068(0.040)
10 Anguo, Hebei 1.4 (0.2) 26.7 0.047(0.021) 0.059(0.026)
11 Xingtai, Hebei 1.3 (0.2) 26.7 0.037(0.017) 0.056(0.027)
12 Xianyang, Shanxi 1.5 (0.2) 33.3 0.070(0.033) 0.109(0.043)
13 Taixing, Jiangshu 1.4 (0.2) 26.7 0.070(0.039) 0.059(0.031)
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Standard deviation in parentheses
1.2 方法 按照文献[5]的配方配制复杂提取缓冲液，电泳、凝胶缓冲液。将移栽的菘蓝以居群为单位，各随机取样20株，连根新鲜保存，取各株的新鲜幼嫩绿叶1～2 cm2，加3～5滴复杂磷酸盐缓冲液研磨均匀，用新华1号滤纸剪成2.5 cm×6.5 cm的沁子，蘸取提取液，于-80℃冰箱保存备用。
称取水解淀粉31.5 g，加1 000 ml蒸馏水，搅匀，煮沸，抽气，注入模盘内，待冷却后,表面加盖玻璃板，室温下冷凝过夜，使凝胶浓度为12.5%。
每次电泳前在冷冻保存的沁子上加1滴2%的2-巯基乙醇，使其解冻后上样。在4℃冰箱中，使用“SG-ZW”型250 ml水平切片电泳槽进行电泳，控制电流为30～35 mA。以溴酚蓝钠盐为凝胶前锋线标记，跑出10～15 cm，即可停止电泳，将凝胶切片染色。共测定了8个酶系统(表2)，其中AAT和LAP酶采用液染法，PGD，PGI，PGM，IDH，HEX和MDH酶采用胶染法。
, 百拇医药
对酶谱进行记录时，若有多个位点，从阳极到阴极，依次用1,2,……表示各个位点，对每个位点的不同等位基因，从阳极到阴极，依次用a,b,c,……表示。在跑每一块胶时，控制电泳条件，温度和电泳时间基本相同，使不同胶上的酶谱具有可比性，最后对不同基因型的材料，再选出具代表性的放在同一块胶上电泳，以确定等位基因的数目。
表2 检测的酶系统和电泳、凝胶缓冲系统
Tab 2 Enzyme assayed and buffers systems used
Enzyme systems Abbr. E C No. Buffers systems
Phosphoglucomutase PGM EC 5.4.2.2 Sodium borate/Tris-Citric acid (pH 8.6)
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Phosphoglucoisomerase PGI EC 5.3.1.9 Sodium borate/Tris-Citric acid (pH 8.6)
Phosphogluconate dehydrogenase PGD EC 1.1.1.44 Lithium borate/Tris-Citric acid (pH 8.0)
Hexokinase HEX EC 2.7.1.1 Sodium borate/Tris-Citric acid (pH 8.6)
Isocitric dehydrogenase IDH EC 1.1.1.42 Lithium borate/Tris-Citric acid (pH 8.0)
Malate dehydrogenase MDH EC 1.1.1.37 Lithium borate/Tris-Citric acid (pH 8.0)
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Leucine aminopeptidase LAP EC 3.4.11.1 Morpholine-Citric acid
Aspartate aminotransferase AAT EC 2.6.1.1 Morpholine-Citric acid
根据各个居群等位基因的组成和频率，计算下列遗传变异度量指标：多态位点百分数P(采用具两个以上等位基因，且最常见等位基因频率等于或小于0.99的标准)；每个位点的等位基因平均数(A)；平均预期杂合度He，平均观察杂合度Ho，统计量F，包括亚群体的固定指数FIS，总群体的固定指数FIT，亚群体间的基因分化比率FST(相当于基因分化系数GST)；以p-distance公式计算遗传距离D。
2 结 果
实验获取了8个酶系统共15个等位基因位点的资料，其中6个为多态位点，编码多态位点的等位基因和居群中的各种基因型模式见图1。
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图1 等位酶谱带的多态位点、等位基因(X)及居群中的各种基因型(XX)模式
Fig 1 Allozyme bands and the relevant polymorphic loci and alleles and the genotypes from populations samples
菘蓝种内不同栽培居群的多态位点百分数P为13.3%～33.3%，每个位点的等位基因平均数A为1.1～1.5，平均观察杂合度Ho为0.015～0.070，平均预期杂合度He为0.027～0.109。He又叫基因多样性指数，可反映群体等位基因的丰富程度，表明如果随机交配，存在2.7%～10.9 %的杂合体(表1)。
基因分化系数(表3)可以衡量群体的分化程度。亚群体基因分化比率的平均值为0.082，表明二倍体菘蓝群体间存在8.2%的变异，居群间的分化程度较低。Pgi-2，Lap-1 两位点的FIS, FIT值为负，表明位点杂合度过量及整个种内此位点杂合度大于期望值。菘蓝不同栽培居群的等位酶多态性反映了其种内遗传多样性及遗传结构的变异。遗传距离计算表明内蒙古赤峰居群和江苏射阳居群之间的遗传距离最大，为0.012，而地理位置相近的菘蓝栽培居群，如河北邢台与河北安国，内蒙古赤峰与辽宁沈阳，安徽泗县与安徽临泉，安徽阜阳与河南禹州，遗传距离较小。表明菘蓝种内的遗传变异在地理分布上有一定的趋向性。
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表3 菘蓝不同栽培居群多态位点的F统计量
Tab 3 F-statistics of the polymorphic loci in different
cultivated populations of Isatis indigotica Fort.
Locus FIS FIT FST
Pgi-2 -0.062
-0.009
0.050
Pgm-2 0.579 0.626 0.111
Pgd-1 0.377 0.431 0.086
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Pgd-2 0.140 0.212 0.084
Lap-1 -0.095 -0.055 0.036
Mdh-1 0.029 0.121 0.094
Mean 0.189 0.256 0.082
3 讨 论
居群生物学研究认为物种是由一个或若干个多少间断的居群所组成的，居群则是由共享一个基因库(gene pool)的许多个体所组成的，这些个体在遗传上存在着差异，构成种的各个居群的遗传组成在空间和时间上并不是绝对均匀、随机分布的，而常常是非随机分布、存在着变化的。物种及其多样性的居群内存在个体变异和居群变异。一个物种具有广泛的分布区时，它的各个不同地区的居群往往具有不同的基因型，或称地方特化基因型(local specialized genotype)，这些基因型是由于不同的生态或地理的条件长期作用塑造而成的[7]。
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菘蓝原产我国，是临床常用的清热解毒中药，对其药材道地性研究深受关注。经文献查考及产地原植物调查未发现存在野生居群，因栽培历史长久，地理间隔大，彼此间交配机会少，形成了一些地方繁育居群，在进化中遗传发生漂变，表现在形态上则为茎生叶的基部有箭形和圆形的不同，果实的大小和形状不一致[6]。
对异地栽培菘蓝药材的研究结果表明，在相同生态环境中生长的不同居群菘蓝在化学成分、药理作用等方面依然存在显著差别；同一个居群菘蓝的品质在移栽前后没有明显变化。等位酶分析结果又证实了菘蓝种内不同栽培居群在遗传结构上确实存在差异。这表明物种遗传因素较生态环境因素在菘蓝药材品质形成中起更大作用，菘蓝种内遗传变异是导致不同来源药材质量有差别的主要原因之一。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670878)
作者简介：王寅(1974-)，男(汉族)，博士生
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王寅(第二军医大学药学院一药学教研室，上海 200433)
乔传卓(第二军医大学药学院一药学教研室，上海 200433)
刘盛(第二军医大学药学院一药学教研室，上海 200433)
王中仁(中国科学院植物研究所系统与进化开放实验室)
侯鑫(中国科学院植物研究所系统与进化开放实验室)
参考文献
[1] 刘 盛，乔传卓. 不同栽培居群板蓝根性状及显微特征的变异研究[J]. 中草药,1999, 30(5):368-371.
[2] 王 寅,尹 茶,乔传卓,等.不同栽培居群菘蓝叶中5种有机酸成分的含量差异[J].第二军医大学学报,1999,20(6):374-376.
, 百拇医药
[3] 肖小河,夏文娟,陈善墉.中国道地药材研究概论[J].中国中药杂志,1995,20(6):323-326.
[4] 黄璐琦,张瑞贤.“道地药材”的生物学探讨[J].中国中药杂志,1997,22(9):563-566.
[5] 王中仁 主编. 植物等位酶分析[M].北京：科学出版社,1996.1-6.
[6] 乔传卓,崔 熙.菘蓝和欧洲菘蓝的鉴别研究[J].植物分类学报,1984,22(3):237-242.
[7] 陈家宽.居群生物学与进化生物学.见：陈家宽,杨 继 主编.植物进化生物学[M]. 武汉：武汉大学出版社,1994. 9-13., 百拇医药