极低密度脂蛋白对内皮细胞t-PA和PAI-1 mRNA表达的影响
http://www.100md.com
黄春 陈晓春 蓝玉福
关键词：极低密度脂蛋白(VLDL) ；内皮细胞；t-PA PAI-1；mRNA
近年来，极低密度脂蛋白(VLDL)与血浆纤溶系统平衡紊乱在动脉粥样硬化(AS)中的作用受到广泛的重视。临床研究表明，血浆VLDL水平升高与血浆纤溶活性密切相关，我们的体外研究亦发现,一定浓度的VLDL能刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分泌Ⅰ型纤溶酶原抑制剂(PA I-1)抗原,而不影响组织型纤溶酶原激活物(t-PA)抗原含量〔1〕。为进一步探讨V LDL干扰纤溶系统平衡的机制，我们于1998年3月至1999年1月从基因转录水平探讨VLDL对HUVECs t -PA和PAI-1 mRNA表达的影响。
一、材料与方法
1.HUVECs的分离培养与鉴定：参照我们以往采用的胰蛋白酶消化法收集HUVECs，用免疫细胞化学(ICC)染色鉴定〔1〕。
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2.实验分组与干预：VLDL(美国Sigma公司产品)在实验前用含5%胎牛血清的IMDM培养液配成不同浓度，以不含VLDL的培养液作对照。(1)不同浓度组：不同浓度(0、5、10、20 、30、40 mg/L)VLDL与内皮细胞(EC)孵育24 h；(2)不同时间组：以含20 mg/L的VLDL的 培养液分别与EC孵育8、24、48 h，每一时点均设相应的对照组。每组重复5孔,每孔加培养液2 ml，在试验终点提取细胞总RNA。
3.目的片断的扩增和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物的半定量分析：参照我们建立的单 管RT-PCR半定量法〔2〕，分别逆转录、扩增t-PA、PAI-1和内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA。各取10 μl扩增终产物在溴化乙锭(EB)染色的2%琼脂糖凝胶上电泳分离，用凝胶图像分析仪扫描分析各条带，并测定其荧光密度值(IDV)，分别用t-PA或PAI-1与GAPDH的IDV比值表示其 mRNA的相对表达水平。
4.统计处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS软件进行统计分析。多组间均数的两两比较用One-way ANOVA(S-N-K)分析；同一时点的实验组与对照组比较用配对t检验分 析；显著性水平为α=0.05。
, 百拇医药
在一定浓度范围内，VLDL诱导PAI-1 mRNA呈剂量依赖性增长(图1)； t-PA、PAI-1 mRNA的相对表达水平：取对照组的表达量为1，各实验组的表达量用其与对照组比较的倍数表示。20 mg/L的VLDL诱导PAI-1 mRNA增加呈时间依赖性，为同时点对照组的2.8±0.18倍(图2)。t-PA mRNA的表达不受VLDL的影响。
与0 mg/L组比较，P<0.05
图1 不同浓度VLDL与EC孵育24 h对t-PA、PAI-1 mRNA表达的影响
与各自的对照组比较，P<0.05
图2 20 mg/L的VLDL与EC孵育不同时间对t-PA、 PAI-1 mRNA表达的影响
三、讨论
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VLDL是富含甘油三脂(TG)的脂蛋白之一。近年来的临床研究发现，血浆VLDL-TG水平增高与纤溶活性降低呈正相关，提示其可能通过促血栓形成而参与AS的发生发展。
我们的研究发现，VLDL可刺激EC PAI-1 mRNA表达和培养上清液(CM)中PAI-1抗原聚积，而不影响t-PA mRNA表达及抗原含量，导致EC表面纤溶活性下降，易形成血栓。VLDL诱导PAI-1 mRNA高表达的机制尚不明确。过氧化酶增殖因子活化受体(PPAR)属于细胞核受体超家族的一员，与配基的结合具有高亲和力和高特异性，并能通过与目标基因启动子区的特异激素反应元件结合，活化基因转录；研究表明，各种脂肪酸能活化PPAR，PPAR参与调节脂肪酸的体内平衡。EC表面存在与脂蛋白代谢相关的受体，当脂蛋白与EC在37℃一起孵育时，脂蛋白被受体结合、内移，并在溶酶体内降解。据此推测，来源于VLDL-TG的各种脂肪酸可能活化PPAR，调节PAI-1基因的表达。
由此可见，降低血浆PAI-1水平以及导致前血栓状态的VLDL水平，应作为AS及血栓性疾病防治的目标。由于许多促血栓形成的因子作用于PAI-1基因的转录水平，因此，寻找相应的转录应答元件、反式作用因子及其在PAI-1基因上的作用位点，有助于进一步揭示PAI-1基因的转录调控机制，对AS及其血栓并发症的防治有重要的临床意义。
, 百拇医药
基金项目：福建省卫生厅科学研究项目资助(97030)
作者单位:黄春(350001 福州市，福建医科大学附属协和医院 福建省老年医学研究所)
陈晓春(350001 福州市，福建医科大学附属协和医院 福建省老年医学研究所)
蓝玉福(350001 福州市，福建医科大学附属协和医院 福建省老年医学研究所)
参考文献
1，陈晓春,黄春,蓝玉福.极低密度脂蛋白对培养HUVECs分泌t-PA及PAI-1抗原的影响.中 国病理生理杂志，1999，15：1063,1073.
2，黄春,陈晓春,蓝玉福.建立RT-PCR半定量法检测HUVECs t-PA和PAI-1 mRNA 表达.福建医科大学学报，1999，33：271-273., 百拇医药
关键词：极低密度脂蛋白(VLDL) ；内皮细胞；t-PA PAI-1；mRNA
近年来，极低密度脂蛋白(VLDL)与血浆纤溶系统平衡紊乱在动脉粥样硬化(AS)中的作用受到广泛的重视。临床研究表明，血浆VLDL水平升高与血浆纤溶活性密切相关，我们的体外研究亦发现,一定浓度的VLDL能刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分泌Ⅰ型纤溶酶原抑制剂(PA I-1)抗原,而不影响组织型纤溶酶原激活物(t-PA)抗原含量〔1〕。为进一步探讨V LDL干扰纤溶系统平衡的机制，我们于1998年3月至1999年1月从基因转录水平探讨VLDL对HUVECs t -PA和PAI-1 mRNA表达的影响。
一、材料与方法
1.HUVECs的分离培养与鉴定：参照我们以往采用的胰蛋白酶消化法收集HUVECs，用免疫细胞化学(ICC)染色鉴定〔1〕。
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2.实验分组与干预：VLDL(美国Sigma公司产品)在实验前用含5%胎牛血清的IMDM培养液配成不同浓度，以不含VLDL的培养液作对照。(1)不同浓度组：不同浓度(0、5、10、20 、30、40 mg/L)VLDL与内皮细胞(EC)孵育24 h；(2)不同时间组：以含20 mg/L的VLDL的 培养液分别与EC孵育8、24、48 h，每一时点均设相应的对照组。每组重复5孔,每孔加培养液2 ml，在试验终点提取细胞总RNA。
3.目的片断的扩增和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物的半定量分析：参照我们建立的单 管RT-PCR半定量法〔2〕，分别逆转录、扩增t-PA、PAI-1和内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA。各取10 μl扩增终产物在溴化乙锭(EB)染色的2%琼脂糖凝胶上电泳分离，用凝胶图像分析仪扫描分析各条带，并测定其荧光密度值(IDV)，分别用t-PA或PAI-1与GAPDH的IDV比值表示其 mRNA的相对表达水平。
4.统计处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS软件进行统计分析。多组间均数的两两比较用One-way ANOVA(S-N-K)分析；同一时点的实验组与对照组比较用配对t检验分 析；显著性水平为α=0.05。
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在一定浓度范围内，VLDL诱导PAI-1 mRNA呈剂量依赖性增长(图1)； t-PA、PAI-1 mRNA的相对表达水平：取对照组的表达量为1，各实验组的表达量用其与对照组比较的倍数表示。20 mg/L的VLDL诱导PAI-1 mRNA增加呈时间依赖性，为同时点对照组的2.8±0.18倍(图2)。t-PA mRNA的表达不受VLDL的影响。
与0 mg/L组比较，P<0.05
图1 不同浓度VLDL与EC孵育24 h对t-PA、PAI-1 mRNA表达的影响
与各自的对照组比较，P<0.05
图2 20 mg/L的VLDL与EC孵育不同时间对t-PA、 PAI-1 mRNA表达的影响
三、讨论
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VLDL是富含甘油三脂(TG)的脂蛋白之一。近年来的临床研究发现，血浆VLDL-TG水平增高与纤溶活性降低呈正相关，提示其可能通过促血栓形成而参与AS的发生发展。
我们的研究发现，VLDL可刺激EC PAI-1 mRNA表达和培养上清液(CM)中PAI-1抗原聚积，而不影响t-PA mRNA表达及抗原含量，导致EC表面纤溶活性下降，易形成血栓。VLDL诱导PAI-1 mRNA高表达的机制尚不明确。过氧化酶增殖因子活化受体(PPAR)属于细胞核受体超家族的一员，与配基的结合具有高亲和力和高特异性，并能通过与目标基因启动子区的特异激素反应元件结合，活化基因转录；研究表明，各种脂肪酸能活化PPAR，PPAR参与调节脂肪酸的体内平衡。EC表面存在与脂蛋白代谢相关的受体，当脂蛋白与EC在37℃一起孵育时，脂蛋白被受体结合、内移，并在溶酶体内降解。据此推测，来源于VLDL-TG的各种脂肪酸可能活化PPAR，调节PAI-1基因的表达。
由此可见，降低血浆PAI-1水平以及导致前血栓状态的VLDL水平，应作为AS及血栓性疾病防治的目标。由于许多促血栓形成的因子作用于PAI-1基因的转录水平，因此，寻找相应的转录应答元件、反式作用因子及其在PAI-1基因上的作用位点，有助于进一步揭示PAI-1基因的转录调控机制，对AS及其血栓并发症的防治有重要的临床意义。
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基金项目：福建省卫生厅科学研究项目资助(97030)
作者单位:黄春(350001 福州市，福建医科大学附属协和医院 福建省老年医学研究所)
陈晓春(350001 福州市，福建医科大学附属协和医院 福建省老年医学研究所)
蓝玉福(350001 福州市，福建医科大学附属协和医院 福建省老年医学研究所)
参考文献
1，陈晓春,黄春,蓝玉福.极低密度脂蛋白对培养HUVECs分泌t-PA及PAI-1抗原的影响.中 国病理生理杂志，1999，15：1063,1073.
2，黄春,陈晓春,蓝玉福.建立RT-PCR半定量法检测HUVECs t-PA和PAI-1 mRNA 表达.福建医科大学学报，1999，33：271-273., 百拇医药