硫代硫酸钠在体内、外辅佐抗癌药药效学初步研究
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采用导管经皮穿刺股动脉到肝固有动脉灌注大剂量化疗药，多以顺氯氨铂为首选药物〔1〕,它已成为晚期肝癌患者非手术疗法的首选方案。大剂量、多种抗癌药的动脉导管介入可提高疗效,但也使患者产生严重的毒副作用。铂类抗癌药如顺氯氨铂(CDDP)与阿霉素(ADM)、丝裂霉素C(MMC)等药合用时,除引起心脏、肾脏和周围神经等毒性外,常引起胃肠道剧烈反应,如恶心、呕吐等〔2〕。国外已报告动脉插管用大剂量CDDP，结合STS“双路化疗”1991年国内陈明津等〔3〕报告治疗晚期肝癌亦取得较好疗效。硫代硫酸钠(STS)会拮抗CDDP抗肿瘤活性，但合理应用能减轻毒副反应。鉴于CDDP常与其他抗癌药联合应用,而STS与CDDP以外的其他抗癌药合用是否有拮抗作用国内外尚未见详细报告〔4〕。我们应用细胞活性MTT检测法和小鼠肝癌(H22)腹水瘤模型抑瘤实验，研究STS与ADM、MMC、CDDP等6种抗癌药合用的药效学,现报告如下。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂
, 百拇医药
阿霉素为意大利FarmitaliaCarloErba,丝裂霉素C为日本KYOWA公司,顺氯氨铂为云南个旧生物制药厂,5-氟尿嘧啶(5-FU)为广州明兴制药厂,甲氨喋呤(MTX)为上海第十二制药厂,长春新碱(VCR)为天津和平制药厂，平阳霉素(PYM)为江苏海门制药厂产品。这7种抗癌药均为临床上注射用的针剂,母液按各药血浆峰值浓度的一千倍配制(1000×PPC/ml),-20℃储存备用(保存一周或现配现用)。硫代硫酸钠为上海新亚制药厂产品。3-(4,5)-二甲基-2-唑噻(2.5)-苯基溴化四唑氮蓝(MTT)为Sigma产品,二甲基亚砜(DMSO)为上海金山化工厂产品，RPMI1640为Gibco产品,其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 药物对瘤细胞生长作用的MTT法测定：
按前文献〔5〕方法培养人肝癌BEL-7402和人胃癌MGc80-3细胞。细胞消化后,活细胞计数以1×104/孔(180μl)接种于96孔培养板,5%CO2常规细胞培养,次日加入不同浓度STS,终浓度分别为10μg～20000μg/ml,每个浓度设3个样品孔,3天后用光密度比色法(570nm)于DG3022(南京电子管厂)酶标仪上计读〔5〕。取不同浓度STS分别加入10倍血浆峰值浓度(10×PPC/ml)和1倍血浆峰值浓度(1×PPC/ml)的ADM、MMC、CDDP抗癌单药,作用于培养的两种癌细胞,3天后用MTT法检测。从实验中找出STS与ADM、MMC，特别是CDDP合用后仍有一定(40%)抑癌作用的最佳STS药物浓度(≤500μg/ml)。取STS(终浓度500μg/ml)分别与ADM、MMC、CDDP、5-FU、MTX和VCR(药物终浓度分别为1×PPC/ml)合用,作用于肝癌和胃癌2种癌细胞,依上述法测定OD值,实验各重复三次。
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1.2.2 小鼠肝癌腹水瘤模型：小鼠腹水型肝癌(H22)(上海药物研究所引进)以1.2×107量接种于5～6周龄BALB/C小鼠(清洁Ⅰ级,抗癌中心医学实验动物室提供)。实验分6组(7只/组,见表1)。次日,抗癌药组按小鼠体重分别从腹腔注入ADM(6mg/kg)、MMC(1.4mg/kg)和CDDP(4.5mg/kg)或卡铂(CAP)(12.5mg/kg);抗癌药与STS合用组的小鼠则提前45分钟从腹腔内分别注射不同浓度的STS(35mg/kg或350mg/kg)后再按上述抗癌药剂量给药,观察计算小鼠存活期。实验重复两次。实验结果和数据采用均数抽样误差t检验处理。
1.2.3 肝癌肝动脉栓塞化疗：本组病例共40例性别：男38例,女2例。年龄29～85岁。所有病例经临床生化,B超和CT诊断为无手术指征的中晚期肝癌,其中Ⅱ期27例、Ⅲ期13例。病人肝动脉灌注化疗(部分病例加明胶海棉栓塞)前经肝、肾功能,血像检查,正常者才进行化疗。采用Seldinger技术,经皮股动脉穿刺插管,选择性进入肝固有动脉,碘油造影证实肝肿块充盈,灌注ADM50mg/m2、MMC5mg/m2和CDDP50mg/m2。40例病人随机分成两组：一组在介入化疗前30分钟从静脉推注1.25～2.5g/m2STS;另一组在介入化疗前30分钟肌注灭吐灵(0.4mg/kg)。治疗疗效评判标准参照文献〔3〕进行。病人发生恶心、呕吐程度的评判标准参照1979年世界卫生组织WHO关于抗癌药毒副反应的分级标准〔4〕进行。
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2 结果
2.1 瘤细胞数与MTT法测定OD值的关系
BEL-7402和MGc80-3癌细胞在7×103/孔～5×104/孔时与所测得OD值呈较好得线性关系(资料未显示)。
2.2 STS对癌细胞活性的影响
人肝癌BEL-7402和人胃癌MGc80-3细胞以7×103/孔接种于96孔板培养，次日加入不同浓度STS再培养3天。当STS浓度≤500μg/ml时，STS对两种癌细胞的生长无明显抑制(P>0.05)。
2.3 STS与ADM、MMC和CDDP等药合用时对癌细胞的影响
不同浓度STS(1μg/ml～10000μg/ml)分别与ADM、MMC和CDDP(1×PPC/ml、10×PPC/ml)合用对MGc80-3和BEL-7402细胞(7×103/孔)作用3天后,显示不同程度的生长抑制作用(图2)。在体外,当STS(500μg/ml)，除与CDDP合用有影响外(P<0.001),与ADM等6种单药(1×PPC/ml)合用对MGc80-3细胞的生长作用无明显影响(P>0.05)；对BEL-7402癌细胞也有相似的作用结果(资料未显示)。
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2.4 STS与抗癌药合用小鼠肝癌腹水瘤模型的作用
小鼠腹水型肝癌(H22)细胞以1.2×107量接种BALB/C小鼠腹腔后,小鼠迅速产生腹水,第10～13天开始死亡。采用ADM、MMC和CDDP联合用药或它们与不同浓度STS(35mg/kg或350mg/kg，提前给药)合用,这3组小鼠存活期比对照组明显延长(表1),但3组之间无显著差别(P>0.05)，联合用药下的小鼠体重无明显减轻，无体毛脱落等现象。以CAP代替CDDP的联合用药亦取得同样的治疗效果。
2.5 STS与ADM、MMC和CDDP合用对肝癌病人治疗的影响
20例肝癌病人肝动脉介入化疗采用STS与ADM、MMC和CDDP药物合用后病情有不同程度的缓解,肿瘤缩小，其中完全缓解者有3例,部分缓解有9例,稳定5例,进展3例,总有效率为60%(12/20)。这结果与不加STS治疗组(20例)相仿(资料未显示)。根据临床护理观察,肝动脉介入化疗前应用1.25～2.5g/m2的STS对减轻病人的恶心、呕吐的程度效果显著。
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3 讨论 1980年Howell和Taetle首先在小鼠动物实验中证实：STS与CDDP合用能有效地防止CDDP对肾脏的毒性作用。嗣后,他们对人卵巢癌从腹腔内给予大剂量CDDP,从静脉内给予STS能有效地防止肾脏〔6〕和周围神经的毒性。肝癌的肝动脉灌注或加栓塞化疗常用ADM和/或MMC加上CDDP等多种抗癌药,STS与CDDP以外的其他抗癌药合用有无拮抗或相加作用,国内外尚未见到详细报道。
在体外，高浓度STS(>1000μg/ml)对肿瘤细胞的生长有抑制作用，而500μg/ml的STS则无明显影响(P>0.05)。低浓度的STS(500μg/ml)与ADM,MMC等5种化疗药(1×PPC/ml)合用时，各自的抗肿瘤活性无明显影响(P>0.05),但对CDDP有显著的影响(P<0.001，但仍有36%～42%抑瘤作用)。我们的体外试验表明：ADM、MMC、CDDP和5-FU有较好的抗胃癌、肝癌细胞生长的作用，与临床研究介入化疗报道的常用药物基本相似〔7〕。我们选其中的ADM、MMC和CDDP与STS合用进一步做动物实验。H22小鼠腹水瘤模型的实验表明：提前给予不同浓度的STS(35mg/kg或350mg/kg，相当于成人用药量的0.14g/m2和1.4g/m2)〔8〕后,再与ADM、MMC和CDDP联合用药和仅这3种抗癌药合用，这3组小鼠的生存期与对照组者有显著性差别(P<0.001)，而这3组间小鼠的生存期无显著性差别(P>0.05)。
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Howell〔6〕等对STS药物代谢动力学研究表明：从静脉推注STS4g/m2后加每小时2.13g/m2静脉滴注能使正常人血浆中STS浓度保持在410μg/ml左右,并可维持4小时。我们在肝动脉介入化疗前静脉推注STS1.25～2.5g/m2,推断病人血浆STS水平将大大低于500μg/ml,不会影响以ADM、MMC为主，包括CDDP的多种抗癌药联合应用。STS的应用,特别是不同途径、伴有较大剂量的CDDP联合用药,能防止介入后CDDP抗癌药外流到体循环引起的肾脏、肝脏和心脏损伤。
我们初步的临床研究表明：介入化疗前静脉推注STS(1.25～2.5g/m2)能使肝癌治疗的总有效率达60%，又能有效地控制70%病人的恶心、呕吐及化疗后迟缓发作的胃肠道反应。STS价格低廉,副作用小,它作为导管化疗中的抗癌药辅助剂值得进一步推广试用。有关STS能减轻胃肠道反应的机理尚未明了。以CDDP(500mg/m2)为主的抗癌药联合应用常引起患者剧烈呕吐,严重者导致脱水,食道破裂等〔9〕。化疗药使小肠嗜铬细胞释放出5-羟色胺在动物实验中已得到证实〔10〕。5-羟色胺的过多释放剌激了内脏迷走神经的传入纤维的5-羟色胺受体,导致恶心、呕吐。近年来STS曾被作为细胞膜稳定剂来抑制实验性胰腺炎的发生,推测它可能稳定肠道嗜铬细胞质膜,减少5-羟色胺的释放，其机理有待进一步研究。
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基金项目：福建省“八五”肝癌攻关课题(850003-0115)
参考文献
1 汤钊猷.原发性肝癌〔A〕,汤钊猷主编：现代肿瘤学〔M〕.上海：上海医科大学出版社,1993：553.
2 Graves t. Emesis as complication of cancer chemotherapy：pathophysiology, importance, and treatment 〔J〕. pharmacotherapy, 1992,12：337.
3 陈明津，张灿珍，蒋绍诚，等.肝动脉插管大剂量顺铂“双路化疗”治疗晚期肝癌〔J〕.中国肿瘤临床，1991，18：343.
4 周际昌.抗肿瘤药物的毒副作用及其处理〔A〕.韩锐主编：肿瘤化学预防与治疗〔M〕.北京：北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1991：707
, 百拇医药
5 杨善民，郑耘，颜江华，等.MTT法检测裸鼠实体瘤药物敏感试验研究〔J〕.中国实验动物学报，1996,4：21.
6 Howell sB, Pfeifle CE,Wung WE,et al. Intraperitoneal cis-diamminedichloroplatinum with systemic thiosulfate protection〔J〕. cancer Res, 1983,43：1426.
7 石木兰，史仲华.肝癌的介入化疗〔A〕.张荫昌主编：中国癌症研究〔M〕.北京：北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1996：14.
8 于庆海.实验动物与人用药量的换算〔A〕.陈奇主编：中药药理学研究方法学〔M〕.北京：人民卫生出版社,1993：1103.
9 Markham a, Sorkin E M.Ondansetron. An update of its therapeutic use in chemotherapy-induced and postoperative nausea and vomiting 〔J〕. drugs, 1993, 45：931.
10 Schworer h, Racke K, Kilbinger H.Cisplatin increases the release of 5-hydroxytryptamine(5-HT)from the isolated vascularly perfused small intestine of the guinea pig ：involvement of 5-HT3 receptors 〔J〕. naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1991, 344：143., 百拇医药
1 材料和方法
1.1 药品与试剂
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阿霉素为意大利FarmitaliaCarloErba,丝裂霉素C为日本KYOWA公司,顺氯氨铂为云南个旧生物制药厂,5-氟尿嘧啶(5-FU)为广州明兴制药厂,甲氨喋呤(MTX)为上海第十二制药厂,长春新碱(VCR)为天津和平制药厂，平阳霉素(PYM)为江苏海门制药厂产品。这7种抗癌药均为临床上注射用的针剂,母液按各药血浆峰值浓度的一千倍配制(1000×PPC/ml),-20℃储存备用(保存一周或现配现用)。硫代硫酸钠为上海新亚制药厂产品。3-(4,5)-二甲基-2-唑噻(2.5)-苯基溴化四唑氮蓝(MTT)为Sigma产品,二甲基亚砜(DMSO)为上海金山化工厂产品，RPMI1640为Gibco产品,其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 药物对瘤细胞生长作用的MTT法测定：
按前文献〔5〕方法培养人肝癌BEL-7402和人胃癌MGc80-3细胞。细胞消化后,活细胞计数以1×104/孔(180μl)接种于96孔培养板,5%CO2常规细胞培养,次日加入不同浓度STS,终浓度分别为10μg～20000μg/ml,每个浓度设3个样品孔,3天后用光密度比色法(570nm)于DG3022(南京电子管厂)酶标仪上计读〔5〕。取不同浓度STS分别加入10倍血浆峰值浓度(10×PPC/ml)和1倍血浆峰值浓度(1×PPC/ml)的ADM、MMC、CDDP抗癌单药,作用于培养的两种癌细胞,3天后用MTT法检测。从实验中找出STS与ADM、MMC，特别是CDDP合用后仍有一定(40%)抑癌作用的最佳STS药物浓度(≤500μg/ml)。取STS(终浓度500μg/ml)分别与ADM、MMC、CDDP、5-FU、MTX和VCR(药物终浓度分别为1×PPC/ml)合用,作用于肝癌和胃癌2种癌细胞,依上述法测定OD值,实验各重复三次。
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1.2.2 小鼠肝癌腹水瘤模型：小鼠腹水型肝癌(H22)(上海药物研究所引进)以1.2×107量接种于5～6周龄BALB/C小鼠(清洁Ⅰ级,抗癌中心医学实验动物室提供)。实验分6组(7只/组,见表1)。次日,抗癌药组按小鼠体重分别从腹腔注入ADM(6mg/kg)、MMC(1.4mg/kg)和CDDP(4.5mg/kg)或卡铂(CAP)(12.5mg/kg);抗癌药与STS合用组的小鼠则提前45分钟从腹腔内分别注射不同浓度的STS(35mg/kg或350mg/kg)后再按上述抗癌药剂量给药,观察计算小鼠存活期。实验重复两次。实验结果和数据采用均数抽样误差t检验处理。
1.2.3 肝癌肝动脉栓塞化疗：本组病例共40例性别：男38例,女2例。年龄29～85岁。所有病例经临床生化,B超和CT诊断为无手术指征的中晚期肝癌,其中Ⅱ期27例、Ⅲ期13例。病人肝动脉灌注化疗(部分病例加明胶海棉栓塞)前经肝、肾功能,血像检查,正常者才进行化疗。采用Seldinger技术,经皮股动脉穿刺插管,选择性进入肝固有动脉,碘油造影证实肝肿块充盈,灌注ADM50mg/m2、MMC5mg/m2和CDDP50mg/m2。40例病人随机分成两组：一组在介入化疗前30分钟从静脉推注1.25～2.5g/m2STS;另一组在介入化疗前30分钟肌注灭吐灵(0.4mg/kg)。治疗疗效评判标准参照文献〔3〕进行。病人发生恶心、呕吐程度的评判标准参照1979年世界卫生组织WHO关于抗癌药毒副反应的分级标准〔4〕进行。
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2 结果
2.1 瘤细胞数与MTT法测定OD值的关系
BEL-7402和MGc80-3癌细胞在7×103/孔～5×104/孔时与所测得OD值呈较好得线性关系(资料未显示)。
2.2 STS对癌细胞活性的影响
人肝癌BEL-7402和人胃癌MGc80-3细胞以7×103/孔接种于96孔板培养，次日加入不同浓度STS再培养3天。当STS浓度≤500μg/ml时，STS对两种癌细胞的生长无明显抑制(P>0.05)。
2.3 STS与ADM、MMC和CDDP等药合用时对癌细胞的影响
不同浓度STS(1μg/ml～10000μg/ml)分别与ADM、MMC和CDDP(1×PPC/ml、10×PPC/ml)合用对MGc80-3和BEL-7402细胞(7×103/孔)作用3天后,显示不同程度的生长抑制作用(图2)。在体外,当STS(500μg/ml)，除与CDDP合用有影响外(P<0.001),与ADM等6种单药(1×PPC/ml)合用对MGc80-3细胞的生长作用无明显影响(P>0.05)；对BEL-7402癌细胞也有相似的作用结果(资料未显示)。
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2.4 STS与抗癌药合用小鼠肝癌腹水瘤模型的作用
小鼠腹水型肝癌(H22)细胞以1.2×107量接种BALB/C小鼠腹腔后,小鼠迅速产生腹水,第10～13天开始死亡。采用ADM、MMC和CDDP联合用药或它们与不同浓度STS(35mg/kg或350mg/kg，提前给药)合用,这3组小鼠存活期比对照组明显延长(表1),但3组之间无显著差别(P>0.05)，联合用药下的小鼠体重无明显减轻，无体毛脱落等现象。以CAP代替CDDP的联合用药亦取得同样的治疗效果。
2.5 STS与ADM、MMC和CDDP合用对肝癌病人治疗的影响
20例肝癌病人肝动脉介入化疗采用STS与ADM、MMC和CDDP药物合用后病情有不同程度的缓解,肿瘤缩小，其中完全缓解者有3例,部分缓解有9例,稳定5例,进展3例,总有效率为60%(12/20)。这结果与不加STS治疗组(20例)相仿(资料未显示)。根据临床护理观察,肝动脉介入化疗前应用1.25～2.5g/m2的STS对减轻病人的恶心、呕吐的程度效果显著。
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3 讨论 1980年Howell和Taetle首先在小鼠动物实验中证实：STS与CDDP合用能有效地防止CDDP对肾脏的毒性作用。嗣后,他们对人卵巢癌从腹腔内给予大剂量CDDP,从静脉内给予STS能有效地防止肾脏〔6〕和周围神经的毒性。肝癌的肝动脉灌注或加栓塞化疗常用ADM和/或MMC加上CDDP等多种抗癌药,STS与CDDP以外的其他抗癌药合用有无拮抗或相加作用,国内外尚未见到详细报道。
在体外，高浓度STS(>1000μg/ml)对肿瘤细胞的生长有抑制作用，而500μg/ml的STS则无明显影响(P>0.05)。低浓度的STS(500μg/ml)与ADM,MMC等5种化疗药(1×PPC/ml)合用时，各自的抗肿瘤活性无明显影响(P>0.05),但对CDDP有显著的影响(P<0.001，但仍有36%～42%抑瘤作用)。我们的体外试验表明：ADM、MMC、CDDP和5-FU有较好的抗胃癌、肝癌细胞生长的作用，与临床研究介入化疗报道的常用药物基本相似〔7〕。我们选其中的ADM、MMC和CDDP与STS合用进一步做动物实验。H22小鼠腹水瘤模型的实验表明：提前给予不同浓度的STS(35mg/kg或350mg/kg，相当于成人用药量的0.14g/m2和1.4g/m2)〔8〕后,再与ADM、MMC和CDDP联合用药和仅这3种抗癌药合用，这3组小鼠的生存期与对照组者有显著性差别(P<0.001)，而这3组间小鼠的生存期无显著性差别(P>0.05)。
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Howell〔6〕等对STS药物代谢动力学研究表明：从静脉推注STS4g/m2后加每小时2.13g/m2静脉滴注能使正常人血浆中STS浓度保持在410μg/ml左右,并可维持4小时。我们在肝动脉介入化疗前静脉推注STS1.25～2.5g/m2,推断病人血浆STS水平将大大低于500μg/ml,不会影响以ADM、MMC为主，包括CDDP的多种抗癌药联合应用。STS的应用,特别是不同途径、伴有较大剂量的CDDP联合用药,能防止介入后CDDP抗癌药外流到体循环引起的肾脏、肝脏和心脏损伤。
我们初步的临床研究表明：介入化疗前静脉推注STS(1.25～2.5g/m2)能使肝癌治疗的总有效率达60%，又能有效地控制70%病人的恶心、呕吐及化疗后迟缓发作的胃肠道反应。STS价格低廉,副作用小,它作为导管化疗中的抗癌药辅助剂值得进一步推广试用。有关STS能减轻胃肠道反应的机理尚未明了。以CDDP(500mg/m2)为主的抗癌药联合应用常引起患者剧烈呕吐,严重者导致脱水,食道破裂等〔9〕。化疗药使小肠嗜铬细胞释放出5-羟色胺在动物实验中已得到证实〔10〕。5-羟色胺的过多释放剌激了内脏迷走神经的传入纤维的5-羟色胺受体,导致恶心、呕吐。近年来STS曾被作为细胞膜稳定剂来抑制实验性胰腺炎的发生,推测它可能稳定肠道嗜铬细胞质膜,减少5-羟色胺的释放，其机理有待进一步研究。
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参考文献
1 汤钊猷.原发性肝癌〔A〕,汤钊猷主编：现代肿瘤学〔M〕.上海：上海医科大学出版社,1993：553.
2 Graves t. Emesis as complication of cancer chemotherapy：pathophysiology, importance, and treatment 〔J〕. pharmacotherapy, 1992,12：337.
3 陈明津，张灿珍，蒋绍诚，等.肝动脉插管大剂量顺铂“双路化疗”治疗晚期肝癌〔J〕.中国肿瘤临床，1991，18：343.
4 周际昌.抗肿瘤药物的毒副作用及其处理〔A〕.韩锐主编：肿瘤化学预防与治疗〔M〕.北京：北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1991：707
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5 杨善民，郑耘，颜江华，等.MTT法检测裸鼠实体瘤药物敏感试验研究〔J〕.中国实验动物学报，1996,4：21.
6 Howell sB, Pfeifle CE,Wung WE,et al. Intraperitoneal cis-diamminedichloroplatinum with systemic thiosulfate protection〔J〕. cancer Res, 1983,43：1426.
7 石木兰，史仲华.肝癌的介入化疗〔A〕.张荫昌主编：中国癌症研究〔M〕.北京：北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1996：14.
8 于庆海.实验动物与人用药量的换算〔A〕.陈奇主编：中药药理学研究方法学〔M〕.北京：人民卫生出版社,1993：1103.
9 Markham a, Sorkin E M.Ondansetron. An update of its therapeutic use in chemotherapy-induced and postoperative nausea and vomiting 〔J〕. drugs, 1993, 45：931.
10 Schworer h, Racke K, Kilbinger H.Cisplatin increases the release of 5-hydroxytryptamine(5-HT)from the isolated vascularly perfused small intestine of the guinea pig ：involvement of 5-HT3 receptors 〔J〕. naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1991, 344：143., 百拇医药