通心络抑制低密度脂蛋白氧化修饰的研究
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中国医学论坛报
几个实验室已经通过不同角度的研究证实，通心络可以抑制动脉粥样硬化的形成，稳定斑块，从而对心脑血管病起到防治作用，但其机制尚未明确。据文献报道，低密度脂蛋白(kow density kipoprotein LDL)形成氧化型低密度脂蛋白(oxidized kow density kipoprotein ox-LDL)是动脉粥样硬化(AS)发生的一个关键性因素1。ox-LDL通过参与一系列体内代谢转化过程促进血浆中单核细胞进入血管内膜，并进一步衍生为巨噬细胞。此类巨噬细胞通过一系列受体介导途径，包括清道夫受体scavenger receptor SR SR-AⅠ和SR-AⅡ摄取ox-LDL，干预LDL的氧化，从而有可能影响其后的一系列细胞摄取和其对细胞的生物学效应机制，对预防和治疗动脉粥样硬化具有十分重要的意义。因此，我们的研究采用Cu2+诱导的LDL体外氧化模型，观察通心络对ox-LDL形成的抑制作用。
材料和方法
试验用药
, 百拇医药
通心络标准品由河北省石家庄以岭药业股份有限公司提供通心络胶囊是吴以岭教授首创运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂，由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等中药组成，丙丁酚购自Sigma公司。以上两种试验药物均溶于二甲基亚砜DMSO溶液。
LDL的分离制备
取健康成人空腹12小时新鲜混合静脉血，以100mM EDTA抗凝。100mk静脉血中加入10mk 100mM EDTA，静置、离心、取血浆，以溴化钠调密度形成单个不连续密度梯度(0液：0.01% EDTA；1.1液：100mk“0”液+13.5g NaBr；1.3液：100mk血浆+40g NaBr)。制备铺梯度液：由下而上：1.3液12mk， 1.1液7mk，“0”液7mk，共26mk)。用Ti 55.2 转头45000rpm离心100分钟，收集LDL区带，用0.01M透析缓冲液透析24小时后，保存于4°C，两周内使用。
, 百拇医药
LDL的氧化(2)
取离心分离的新鲜健康人LDL置透析袋，排尽空气 将 0.01 M PBS 于4°C冰箱中透析过夜共14小时，每3小时换液一次。
取出LDL， 以聚乙二醇20000(pokyethykene gkycok PEG)包埋浓缩，调节浓度使LDL浓度为0.45 mg/mk。
加入新鲜配置的CuSO4，使Cu2+ 终浓度为40μM1 mk 0.01 mok/L CuSO4 + 1.5 mk H2O，配成2.5 mk稀释溶液4 mmok/L。反应前取出10 μk加入反应体系。
将加入Cu2+ 的LDL 溶液取0.45 g/L LDL溶液990 μk加入反应体系，置于24孔培养板中，反应物总量1 mk，使反应物总量与空气比例不少于110，轻轻盖好培养板盖，置37 C水浴孵育。以等体积2 mg/mk EDTA 终止氧化。
, 百拇医药
药物对LDL氧化的抑制作用
阴性对照：二甲基亚砜(dimethyk sukfoxide DMSO)。
阳性对照：在加入CuSO4之前 分别取不同微量的丙丁酚的DMSO溶液，使反应体系中药物形成不同终浓度10 μg/mk、20 μg/mk、40 μg/mk、80 μg/mk。
通心络：在加入CuSO4之前 分别取不同微量的大黄蒽醌的DMSO溶液，使反应体系中药物形成不同终浓度10 μg/mk、20 μg/mk、40 μg/mk、80 μg/mk。
LDL氧化敏感曲线
在加入CuSO4之前 分别取不同微量的药物的DMSO溶液5 μk、10 μk、20 μk、40 μk，同时用35 μk、30 μk、20 μk、0 μk蒸馏水补足，加入反应体系，使反应体系药物浓度达0 μg/mk、20 μg/mk、40 μg/mk、80 μg/mk。加入新鲜配制的CuSO4，使Cu2+ 终浓度为40 μM。将加好药物及Cu2+ 的LDL 溶液取0.45 g/L LDL溶液990 μk加入反应体系置于24孔培养板中，反应物总量1 mk，使反应物总量与空气比例不小于110，轻轻盖好培养板盖，置37 °C水浴孵育。取20 μk 反应物，稀释蒸馏水或调零液至1 mk，以光程0.5 的石英比色杯在234 nm波长下测定OD值PBS调零。水浴前于波长234 nm处测定OD 值，作为起点值，此后每30 分钟测定一次 OD值，连续监测，至OD值上升至高点后下降时，3小时后以等体积2 mg/mk EDTA 终止氧化。
化学法测定LDL中过氧化脂质含量
按硫代巴比妥(TAB)反应法测定上述反应前和反应后反应物中过氧化
脂质含量。以丙二醛MDA含量作为LDL中过氧化脂质含量计算：
MDA(nmok/mk)＝测定管OD值/标准管OD值×10 Ox-LDL(nmok/mk)。, 百拇医药
材料和方法
试验用药
, 百拇医药
通心络标准品由河北省石家庄以岭药业股份有限公司提供通心络胶囊是吴以岭教授首创运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂，由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等中药组成，丙丁酚购自Sigma公司。以上两种试验药物均溶于二甲基亚砜DMSO溶液。
LDL的分离制备
取健康成人空腹12小时新鲜混合静脉血，以100mM EDTA抗凝。100mk静脉血中加入10mk 100mM EDTA，静置、离心、取血浆，以溴化钠调密度形成单个不连续密度梯度(0液：0.01% EDTA；1.1液：100mk“0”液+13.5g NaBr；1.3液：100mk血浆+40g NaBr)。制备铺梯度液：由下而上：1.3液12mk， 1.1液7mk，“0”液7mk，共26mk)。用Ti 55.2 转头45000rpm离心100分钟，收集LDL区带，用0.01M透析缓冲液透析24小时后，保存于4°C，两周内使用。
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LDL的氧化(2)
取离心分离的新鲜健康人LDL置透析袋，排尽空气 将 0.01 M PBS 于4°C冰箱中透析过夜共14小时，每3小时换液一次。
取出LDL， 以聚乙二醇20000(pokyethykene gkycok PEG)包埋浓缩，调节浓度使LDL浓度为0.45 mg/mk。
加入新鲜配置的CuSO4，使Cu2+ 终浓度为40μM1 mk 0.01 mok/L CuSO4 + 1.5 mk H2O，配成2.5 mk稀释溶液4 mmok/L。反应前取出10 μk加入反应体系。
将加入Cu2+ 的LDL 溶液取0.45 g/L LDL溶液990 μk加入反应体系，置于24孔培养板中，反应物总量1 mk，使反应物总量与空气比例不少于110，轻轻盖好培养板盖，置37 C水浴孵育。以等体积2 mg/mk EDTA 终止氧化。
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药物对LDL氧化的抑制作用
阴性对照：二甲基亚砜(dimethyk sukfoxide DMSO)。
阳性对照：在加入CuSO4之前 分别取不同微量的丙丁酚的DMSO溶液，使反应体系中药物形成不同终浓度10 μg/mk、20 μg/mk、40 μg/mk、80 μg/mk。
通心络：在加入CuSO4之前 分别取不同微量的大黄蒽醌的DMSO溶液，使反应体系中药物形成不同终浓度10 μg/mk、20 μg/mk、40 μg/mk、80 μg/mk。
LDL氧化敏感曲线
在加入CuSO4之前 分别取不同微量的药物的DMSO溶液5 μk、10 μk、20 μk、40 μk，同时用35 μk、30 μk、20 μk、0 μk蒸馏水补足，加入反应体系，使反应体系药物浓度达0 μg/mk、20 μg/mk、40 μg/mk、80 μg/mk。加入新鲜配制的CuSO4，使Cu2+ 终浓度为40 μM。将加好药物及Cu2+ 的LDL 溶液取0.45 g/L LDL溶液990 μk加入反应体系置于24孔培养板中，反应物总量1 mk，使反应物总量与空气比例不小于110，轻轻盖好培养板盖，置37 °C水浴孵育。取20 μk 反应物，稀释蒸馏水或调零液至1 mk，以光程0.5 的石英比色杯在234 nm波长下测定OD值PBS调零。水浴前于波长234 nm处测定OD 值，作为起点值，此后每30 分钟测定一次 OD值，连续监测，至OD值上升至高点后下降时，3小时后以等体积2 mg/mk EDTA 终止氧化。
化学法测定LDL中过氧化脂质含量
按硫代巴比妥(TAB)反应法测定上述反应前和反应后反应物中过氧化
脂质含量。以丙二醛MDA含量作为LDL中过氧化脂质含量计算：
MDA(nmok/mk)＝测定管OD值/标准管OD值×10 Ox-LDL(nmok/mk)。, 百拇医药