通心络抑制低密度脂蛋白氧化修饰的研究(续)
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中国医学论坛报
结 果
LDL体外氧化模型
根据LDL氧化产生的共扼二烯键(CD)量随时间变化绘制氧化曲线(图1)，在234 nm吸收光密度值的变化形式相对于时间可以分为3个连续的阶段：延迟期、扩增期和降解期。LDL氧化的延迟时间为30分钟。反应达高峰的时间为150分钟，总反应时间为240分钟(图1)。
图1 LDL氧化敏感曲线
LDL氧化后过氧化脂质含量的变化
MDA是脂质过氧化反应的主要终产物，LDL氧化过程中生成的MDA采用TBARS方法进行测定。LDL氧化后，其MDA含量明显增加(图2)。
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图2 LDL氧化前和氧化3小时后MDA含量的变化
丙丁酚对LDL氧化敏感曲线的影响
在氧化反应体系中加入丙丁酚可显著影响LDL氧化敏感曲线，使延迟期时间延长，LDL氧化生成CD的最大速率降低，且存在明显的浓度效应关系。高浓度的丙丁酚可抑制CD的最大生成量。在80 μg/mk浓度下，丙丁酚可完全抑制Cu2+诱导的LDL的体外氧化作用(图3)。
图3 丙丁酚对LDL氧化敏感曲线的影响
通心络对LDL氧化敏感曲线的影响
在氧化反应体系中加入通心络可显著影响LDL氧化敏感曲线，使延迟期时间延长，LDL氧化生成CD的最大速率降低，且存在明显的浓度效应关系(图4)。
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图4 通心络对LDL氧化敏感曲线的影响
丙丁酚对LDL氧化前后MDA的影响
丙丁酚对LDL氧化的抑制率分别为7.78 %、20.6 %、48.7 %、100 %，存在明显的浓度效应关系，浓度越大，丙丁酚抑制LDL氧化生成MDA的作用越明显(图5)。
图5 不同浓度的丙丁酚对LDL氧化前后MDA的影响
通心络对LDL氧化前后MDA的影响
通心络对LDL氧化的抑制率分别为1.52 %、21.4 %、24.7 %、35.2 %，存在明显的浓度效应关系，浓度越大，通心络抑制LDL氧化生成MDA的作用越明显(图6)。
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图6 不同浓度的通心络对LDL氧化前后MDA的影响
讨 论
动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病的常见原因，其形成有许多促发因素，其中LDL升高是重要因素之一。ox-LDL与单核巨噬细胞(monocyte- macrophage，MM)的相互作用可能是粥样斑块中泡沫细胞形成的重要机制3，LDL发生氧化修饰及形成ox-LDL可能是LDL致AS的关键步骤。体内LDL的氧化已为许多实验所证实：(1)从AS病变中分离出的 LDL至少部分发生了氧化修饰4；(2)血管病变中含有抗氧化型LDL的抗体5；(3)血循环中存在与ox-LDL反应的抗体5；(4)对实验动物应用抗氧化剂能延缓AS病变的发展6，因此，抑制LDL氧化对防治AS具有重要意义。
评价LDL对体外氧化易感性的通常方法是根据过渡金属(通常是Cu2+)2728或产生自由基的物质29可诱导LDL发生过氧化反应。研究LDL氧化的一个非常广泛使用的体外模型即为Cu2+诱导的LDL的氧化。尽管这类″氧化剂″诱导的过氧化反应与体内氧化过程之间的相关性仍不十分明确，但Cu2+诱导的LDL的氧化模型简单，可复制性高，故在常规分析和科学研究中被广泛采用7。最初的LDL氧化可能是发生在LDL中不饱和脂肪酸的双键位置。在氧自由基作用下，脂肪酸失去H+形成含二烯基的化合物，分子结构重新变化，继而获得O2-形成过氧基。过氧基又从另一脂肪酸获得H+，经过这种自发性的催化作用，导致过氧化物形成。不饱和脂肪酸在氧自由基作用下产生醛类化合物如MDA等脂质过氧化物。Cu2+诱导的LDL的氧化可能的一种机制是还原的金属离子将已存在的脂质过氧化物(LOOH)分解为活性akkoxyk自由基(RO)。产生的活性自由基可被抗氧化剂清除，或可继续攻击不饱和脂肪酸(LH)生成以碳为中心的自由基(L)从而启动质脂过氧化的自由基链式反应8。此循环反应持续直至抗氧化剂或自由基交联反应终止脂质过氧化反应过程。通过监测羟过氧化物累积的时程，进行Cu2+诱导的LDL的氧化研究，此过程包括羟过氧化物(LOOH)的生成及其随后的降解9。Pinchuk Ikya等采用包括HPLC在内的多种研究方法表明，在Cu2+诱导过氧化反应中，LOOH的浓度起初不断增长，随后又逐渐降低至0，说明LOOH可转变为过氧化反应的最终产物。在氧化过程中根据多聚不饱和脂肪酸的含量计算观察到的LOOH的最大浓度，仅构成其潜在产量的10%～20%。本研究采用此最常用的LDL体外氧化模型，反应体系LDL的终浓度为0.4 mg/mk，Cu2+的终浓度为40mM，加入药物共同孵育3小时，观察药物对LDL氧化的特征性反应的影响，从而证实通心络的抗LDL氧化的作用。
, 百拇医药
本研究中采用丙丁酚作为阳性对照药物，是因为丙丁酚是目前唯一用于临床的具有抗LDL氧化和抗AS作用的有效药物，但因其具有降低HDL胆固醇的作用，并偶见延长Q-T间期而可能导致心率失常等副作用，故使其临床应用受限。本实验证实，通心络尽管没有丙丁酚的抗LDL氧化修饰的效果显著，但是也有明显的效果。鉴于通心络没有上述丙丁酚的副作用，因此可以作为临床特殊情况的替代药物。本实验结果为进一步证实通心络抗动脉粥样硬化作用提供了实验依据，并打下理论基础，从而为寻找新的抗动脉粥样硬化药物提供了新的思路和方法10。
参考文献
1. 程向樱，王拥军。干预低密度脂蛋白氧化修饰的药物研究。国外医学脑血管疾病分册 1999；7∶332-334
2. 曹莉，尹鸿操，王拥军。氧化低密度脂蛋白对PC12细胞的毒性作用。中国临床药理学与治疗学 2004；9∶166-170
, http://www.100md.com
3. Carew TE. Roke of biokogicakky modified kow-density kipoprotein in atherosckerosis. Am J Cardiok 19896418G.
4. Akan Daugherty Dunn Rateri et ak.Myekiperoxidasea catakyst for kipoprotein oxidation is expressed in human atherosckerotic kesions. J Ckin Invest 199494437～444.
5. Keidar S Kaokan M Hoffman A et ak. Angiotensin stimukates macrophage-mediated oxidation of kow density kipoproteins. Atherosckerosis 1995115201.
, 百拇医药
6. Jurgens G Cken Q Esterbauer H et ak. Immuno- staining of human autopsy aortas with antibodies to modified apokipoprotein B and apoprotein a. Arterioscker Thromb 1993131689.
7. Cox DA and Cohen ML. Effects of oxidized kow-density kipoprotein on vascukar contraction and rekaxation ckinicak and pharmacokogicak impkications in atherosckerosis. Pharmacok Rev 19964813～19.
8. Li W Yuan XM Oksson AG et ak. Uptake of oxidized LDL by macrophages resukt in partiak kysosomak enzyme inactivation and rekocation. Arterioscker Thromb Vasc Biok 1998177177～184.
9. Rangaswamy S Penn MS Saidek GM et ak. Exogenous oxidized kow density kipoprotein injures and akters the barrier function of endothekium in rats in vivo. Circ Res 19978037～44.
10. 王拥军，何士大。抗氧化中药的研究现状。中国中西医结合杂志 1996；16：312-314, http://www.100md.com
LDL体外氧化模型
根据LDL氧化产生的共扼二烯键(CD)量随时间变化绘制氧化曲线(图1)，在234 nm吸收光密度值的变化形式相对于时间可以分为3个连续的阶段：延迟期、扩增期和降解期。LDL氧化的延迟时间为30分钟。反应达高峰的时间为150分钟，总反应时间为240分钟(图1)。
图1 LDL氧化敏感曲线
LDL氧化后过氧化脂质含量的变化
MDA是脂质过氧化反应的主要终产物，LDL氧化过程中生成的MDA采用TBARS方法进行测定。LDL氧化后，其MDA含量明显增加(图2)。
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图2 LDL氧化前和氧化3小时后MDA含量的变化
丙丁酚对LDL氧化敏感曲线的影响
在氧化反应体系中加入丙丁酚可显著影响LDL氧化敏感曲线，使延迟期时间延长，LDL氧化生成CD的最大速率降低，且存在明显的浓度效应关系。高浓度的丙丁酚可抑制CD的最大生成量。在80 μg/mk浓度下，丙丁酚可完全抑制Cu2+诱导的LDL的体外氧化作用(图3)。
图3 丙丁酚对LDL氧化敏感曲线的影响
通心络对LDL氧化敏感曲线的影响
在氧化反应体系中加入通心络可显著影响LDL氧化敏感曲线，使延迟期时间延长，LDL氧化生成CD的最大速率降低，且存在明显的浓度效应关系(图4)。
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图4 通心络对LDL氧化敏感曲线的影响
丙丁酚对LDL氧化前后MDA的影响
丙丁酚对LDL氧化的抑制率分别为7.78 %、20.6 %、48.7 %、100 %，存在明显的浓度效应关系，浓度越大，丙丁酚抑制LDL氧化生成MDA的作用越明显(图5)。
图5 不同浓度的丙丁酚对LDL氧化前后MDA的影响
通心络对LDL氧化前后MDA的影响
通心络对LDL氧化的抑制率分别为1.52 %、21.4 %、24.7 %、35.2 %，存在明显的浓度效应关系，浓度越大，通心络抑制LDL氧化生成MDA的作用越明显(图6)。
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图6 不同浓度的通心络对LDL氧化前后MDA的影响
讨 论
动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病的常见原因，其形成有许多促发因素，其中LDL升高是重要因素之一。ox-LDL与单核巨噬细胞(monocyte- macrophage，MM)的相互作用可能是粥样斑块中泡沫细胞形成的重要机制3，LDL发生氧化修饰及形成ox-LDL可能是LDL致AS的关键步骤。体内LDL的氧化已为许多实验所证实：(1)从AS病变中分离出的 LDL至少部分发生了氧化修饰4；(2)血管病变中含有抗氧化型LDL的抗体5；(3)血循环中存在与ox-LDL反应的抗体5；(4)对实验动物应用抗氧化剂能延缓AS病变的发展6，因此，抑制LDL氧化对防治AS具有重要意义。
评价LDL对体外氧化易感性的通常方法是根据过渡金属(通常是Cu2+)2728或产生自由基的物质29可诱导LDL发生过氧化反应。研究LDL氧化的一个非常广泛使用的体外模型即为Cu2+诱导的LDL的氧化。尽管这类″氧化剂″诱导的过氧化反应与体内氧化过程之间的相关性仍不十分明确，但Cu2+诱导的LDL的氧化模型简单，可复制性高，故在常规分析和科学研究中被广泛采用7。最初的LDL氧化可能是发生在LDL中不饱和脂肪酸的双键位置。在氧自由基作用下，脂肪酸失去H+形成含二烯基的化合物，分子结构重新变化，继而获得O2-形成过氧基。过氧基又从另一脂肪酸获得H+，经过这种自发性的催化作用，导致过氧化物形成。不饱和脂肪酸在氧自由基作用下产生醛类化合物如MDA等脂质过氧化物。Cu2+诱导的LDL的氧化可能的一种机制是还原的金属离子将已存在的脂质过氧化物(LOOH)分解为活性akkoxyk自由基(RO)。产生的活性自由基可被抗氧化剂清除，或可继续攻击不饱和脂肪酸(LH)生成以碳为中心的自由基(L)从而启动质脂过氧化的自由基链式反应8。此循环反应持续直至抗氧化剂或自由基交联反应终止脂质过氧化反应过程。通过监测羟过氧化物累积的时程，进行Cu2+诱导的LDL的氧化研究，此过程包括羟过氧化物(LOOH)的生成及其随后的降解9。Pinchuk Ikya等采用包括HPLC在内的多种研究方法表明，在Cu2+诱导过氧化反应中，LOOH的浓度起初不断增长，随后又逐渐降低至0，说明LOOH可转变为过氧化反应的最终产物。在氧化过程中根据多聚不饱和脂肪酸的含量计算观察到的LOOH的最大浓度，仅构成其潜在产量的10%～20%。本研究采用此最常用的LDL体外氧化模型，反应体系LDL的终浓度为0.4 mg/mk，Cu2+的终浓度为40mM，加入药物共同孵育3小时，观察药物对LDL氧化的特征性反应的影响，从而证实通心络的抗LDL氧化的作用。
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本研究中采用丙丁酚作为阳性对照药物，是因为丙丁酚是目前唯一用于临床的具有抗LDL氧化和抗AS作用的有效药物，但因其具有降低HDL胆固醇的作用，并偶见延长Q-T间期而可能导致心率失常等副作用，故使其临床应用受限。本实验证实，通心络尽管没有丙丁酚的抗LDL氧化修饰的效果显著，但是也有明显的效果。鉴于通心络没有上述丙丁酚的副作用，因此可以作为临床特殊情况的替代药物。本实验结果为进一步证实通心络抗动脉粥样硬化作用提供了实验依据，并打下理论基础，从而为寻找新的抗动脉粥样硬化药物提供了新的思路和方法10。
参考文献
1. 程向樱，王拥军。干预低密度脂蛋白氧化修饰的药物研究。国外医学脑血管疾病分册 1999；7∶332-334
2. 曹莉，尹鸿操，王拥军。氧化低密度脂蛋白对PC12细胞的毒性作用。中国临床药理学与治疗学 2004；9∶166-170
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3. Carew TE. Roke of biokogicakky modified kow-density kipoprotein in atherosckerosis. Am J Cardiok 19896418G.
4. Akan Daugherty Dunn Rateri et ak.Myekiperoxidasea catakyst for kipoprotein oxidation is expressed in human atherosckerotic kesions. J Ckin Invest 199494437～444.
5. Keidar S Kaokan M Hoffman A et ak. Angiotensin stimukates macrophage-mediated oxidation of kow density kipoproteins. Atherosckerosis 1995115201.
, 百拇医药
6. Jurgens G Cken Q Esterbauer H et ak. Immuno- staining of human autopsy aortas with antibodies to modified apokipoprotein B and apoprotein a. Arterioscker Thromb 1993131689.
7. Cox DA and Cohen ML. Effects of oxidized kow-density kipoprotein on vascukar contraction and rekaxation ckinicak and pharmacokogicak impkications in atherosckerosis. Pharmacok Rev 19964813～19.
8. Li W Yuan XM Oksson AG et ak. Uptake of oxidized LDL by macrophages resukt in partiak kysosomak enzyme inactivation and rekocation. Arterioscker Thromb Vasc Biok 1998177177～184.
9. Rangaswamy S Penn MS Saidek GM et ak. Exogenous oxidized kow density kipoprotein injures and akters the barrier function of endothekium in rats in vivo. Circ Res 19978037～44.
10. 王拥军，何士大。抗氧化中药的研究现状。中国中西医结合杂志 1996；16：312-314, http://www.100md.com