滋肾止血片对实验性IgA肾病大鼠肾组织TGF-β基因表达的影响
http://www.100md.com
胡海翔 刘占民
摘要：采用口服牛血清白蛋白(BSA)和葡萄球菌肠毒素B(SEB)感染的复合法诱发大鼠的IgA肾病(IgAN)模型，并运用时振声教授治疗肾炎的有效方剂滋肾止血片对该模型肾组织转化生长因子β(TGF-β)基因表达进行研究，提示该药对IgAN大鼠肾组织TGF-β的mRNA表达有抑制作用。
关键词：滋肾止血片；IgA肾病；大鼠；TGF-β
Effect of Zishenzhixue Tablet on Renal Tissue TGF-β Gene Expression of
the Experimental IgA Nephropathy Rat
Hu Haixiang (胡海翔)
, 百拇医药
(General Hospital of Air Force, Beijing 100036)
ABSTRACT：The IgAN rat model was induced through oral administration of bovine serum albumin (BSA) and staphylococcus enterotoxin infection. Using Zishenzhixue tablet, TCM prescription by Professor Shi Zhensheng with efficacy on nephritis, observed the gene expression of transforming growth factor (TGF-β). The result suggested the tablet had inhibitive action on mRNA expression of renal tissue TGF-β of IgAN rat model. The tablet is composed by Nüzhenzi(Privet Berry), Hanliancao(Yerbadetajo), Baimaogen(Cogongrass Rhizome), Shiwei(Pyrrosia Leaf), Baihuasheshecao(Herb of Spreading Hedyotis), Yimucao(Motherwort Herb), et al.
, 百拇医药
KEY WORDS: Zishenzhixue tablet; IgA renopathy; Rat; TGF-β
我们采用口服牛血清白蛋白(BSA)和葡萄球菌肠毒素B(SEB)感染的复合法诱发大鼠的IgAN模型。并运用时振声教授多年来治疗肾炎的有效方剂滋肾止血片对其肾组织转化生长因子β基因表达进行研究，以期进一步探讨该药的作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 选用SD纯种大白鼠，雌性，体重(180±10)g，12周龄(证书号01-3077,二级)，由解放军总医院动物实验中心提供。实验在空军总医院动物实验中心(国家二级实验中心)进行。动物随机分为模型组、滋肾止血片组、潘生丁组、茜草双酯片组、正常对照组5组，每组各12只。
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1.1.2 造模用药 牛血清白蛋白(BSA)，天津生化制品厂提供，批号：92-8-20；葡萄球菌肠毒素B(SEB)，军事医学科学院微生物流行病研究所提供，批号：1982-9。
1.1.3 实验用药 滋肾止血片(由女贞子、旱莲草、白茅根、石韦、白花蛇舌草、益母草等组成)，由中国中医研究院西苑医院实验药厂提供，每片重0.3 g，含生药1.38 g，批号：950306；茜草双酯片由上海天平制药厂提供，批号：960601；潘生丁由天津市力生制药厂提供，批号：970708。
1.1.4 主要试剂 总RNA提取试剂盒、反转录PCR试剂盒均由美国Promega公司提供。引物：TGF和GAPDH引物均由军事医学科学院基础医学研究所合成。
1.1.5 主要仪器 PCR扩增仪为美国Perkin-Elmer公司9600型；紫外分光计为日本岛津UV2201型；光密及扫描仪为美国Pharmacia公司产。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 模型组 IgAN模型制备参照刘宏伟等[1]报道的方法，即隔日口服含0.1%BSA的酸化水，6周后定期尾静脉注射1%BSA缓冲液(每日1次，连续3次)，8周时复加尾静脉注射SEB(每周1次，连续3周)，然后观察至第12周末。
1.2.2 滋肾止血片组 造模与模型组相同，于8周静脉注射1%BSA缓冲液出现蛋白尿、血尿后开始用滋肾止血片15 g/(kg . d), 灌胃给药，至第12周末。
1.2.3 潘生丁组 造模与模型组相同，于8周静脉注射1%BSA缓冲液出现蛋白尿、血尿后开始用潘生丁15 g/(kg . d), 灌胃给药，至第12周末。
1.2.4 茜草双酯片组 造模与模型组相同，于8周静脉注射1%BSA缓冲液出现蛋白尿、血尿后开始用茜草双酯片15 g/(kg . d), 灌胃给药，至第12周末。
, 百拇医药
1.2.5 正常对照组 隔日口服酸化水，共12周。在上述12周内，各组动物进食进水量不限。从6周起用代谢笼留尿，每1周查尿红细胞及尿蛋白。实验动物在12周末，禁食12 h，速眠新(846合剂)和盐酸氯胺酮麻醉。迅速打开腹腔，腹主动脉取血，并取出肾组织，在冰板上剪成3份，用生理盐水洗净其中血液，然后装入直径为0.4 cm、长3 cm的塑料管内,投入液氮瓶中待测。
1.3 检测项目和方法
1.3.1 肾组织转化生长因子β(TGF-β)mRNA表达的测定 按文献方法[2]，聚合酶链反应(PCR)。
2 结果
各组肾脏组织TGF-β mRNA经反转录, cDNA PCR扩增，取扩增产物进行1.5%的琼脂糖电泳，并以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为对照。结果显示，各组肾组织GAPDH mRNA的PCR产物电泳条带，在明暗或宽窄方面均匀一致。而各组肾组织TGF-β mRNA的PCR产物电泳条带则显示明显的不均(图略)。正常对照组电泳条带线暗，其次为滋肾止血片组、茜草双酯片组，潘生丁组的电泳条带比较明亮，模型组最为明显。从各组大鼠TGF-β定量比较的研究中可以看出，模型组的TGF-β定量明显高于正常组，滋肾止血片组的TGF-β定量明显低于模型组。
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3 讨论
我们从胃肠粘膜免疫入手以口服牛血清白蛋白(BSA)、葡萄球菌肠毒素B(SEB)感染的复合法建立大鼠实验性IgAN模型。实验结果表明模型组和治疗组大鼠自第6周起临床表现有蛋白尿、血尿，并持续至实验结束。肾脏病理提示有系膜细胞增生和基质增多，免疫荧光和免疫酶标染色显示IgA在肾小球系膜区呈团状沉积。实验结果基本符合我们原来的设想，与文献报道一致[3]，从而提示该模型是成功的。
转化生长因子β具有调解细胞生长、分化，以及免疫抑制、免疫趋化等多种生物学功能，参与了机体许多生理和病理过程。其中尤以在组织器官免疫和非免疫损伤后的瘢痕和纤维化形成过程中的作用最为引人注目。它是迄今为止人们所发现的在纤维和结缔组织基质发生过程中重要的细胞因子[4，5]。最近的研究表明，肾脏疾病中，肾小球表达TGF-β明显增加。在研究本项指标时，我们采用了PCR技术。为严格控制组间差异，实验中从组织块处理到PCR产物电泳的全过程均为各组同步进行，并设立以“看家”基因—GAPDH为对照的外控组，从GAPDH mRNA的PCR产物的电泳条带来看，实验结果是可信的。
我们研究结果显示，各造模组肾组织中的TGF-β mRNA的含量明显高于正常对照组，模型组肾组织中的TGF-β mRNA的含量又明显高于3个治疗组。由多到少可排定以下顺序：模型组、潘生丁组、茜草双酯片组、滋肾止血片组、正常对照组。正常对照组与滋肾止血片组肾组织中的TGF-β mRNA内控定量较少，与其他各组比较有显著性差异(P, http://www.100md.com
摘要：采用口服牛血清白蛋白(BSA)和葡萄球菌肠毒素B(SEB)感染的复合法诱发大鼠的IgA肾病(IgAN)模型，并运用时振声教授治疗肾炎的有效方剂滋肾止血片对该模型肾组织转化生长因子β(TGF-β)基因表达进行研究，提示该药对IgAN大鼠肾组织TGF-β的mRNA表达有抑制作用。
关键词：滋肾止血片；IgA肾病；大鼠；TGF-β
Effect of Zishenzhixue Tablet on Renal Tissue TGF-β Gene Expression of
the Experimental IgA Nephropathy Rat
Hu Haixiang (胡海翔)
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(General Hospital of Air Force, Beijing 100036)
ABSTRACT：The IgAN rat model was induced through oral administration of bovine serum albumin (BSA) and staphylococcus enterotoxin infection. Using Zishenzhixue tablet, TCM prescription by Professor Shi Zhensheng with efficacy on nephritis, observed the gene expression of transforming growth factor (TGF-β). The result suggested the tablet had inhibitive action on mRNA expression of renal tissue TGF-β of IgAN rat model. The tablet is composed by Nüzhenzi(Privet Berry), Hanliancao(Yerbadetajo), Baimaogen(Cogongrass Rhizome), Shiwei(Pyrrosia Leaf), Baihuasheshecao(Herb of Spreading Hedyotis), Yimucao(Motherwort Herb), et al.
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KEY WORDS: Zishenzhixue tablet; IgA renopathy; Rat; TGF-β
我们采用口服牛血清白蛋白(BSA)和葡萄球菌肠毒素B(SEB)感染的复合法诱发大鼠的IgAN模型。并运用时振声教授多年来治疗肾炎的有效方剂滋肾止血片对其肾组织转化生长因子β基因表达进行研究，以期进一步探讨该药的作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 选用SD纯种大白鼠，雌性，体重(180±10)g，12周龄(证书号01-3077,二级)，由解放军总医院动物实验中心提供。实验在空军总医院动物实验中心(国家二级实验中心)进行。动物随机分为模型组、滋肾止血片组、潘生丁组、茜草双酯片组、正常对照组5组，每组各12只。
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1.1.2 造模用药 牛血清白蛋白(BSA)，天津生化制品厂提供，批号：92-8-20；葡萄球菌肠毒素B(SEB)，军事医学科学院微生物流行病研究所提供，批号：1982-9。
1.1.3 实验用药 滋肾止血片(由女贞子、旱莲草、白茅根、石韦、白花蛇舌草、益母草等组成)，由中国中医研究院西苑医院实验药厂提供，每片重0.3 g，含生药1.38 g，批号：950306；茜草双酯片由上海天平制药厂提供，批号：960601；潘生丁由天津市力生制药厂提供，批号：970708。
1.1.4 主要试剂 总RNA提取试剂盒、反转录PCR试剂盒均由美国Promega公司提供。引物：TGF和GAPDH引物均由军事医学科学院基础医学研究所合成。
1.1.5 主要仪器 PCR扩增仪为美国Perkin-Elmer公司9600型；紫外分光计为日本岛津UV2201型；光密及扫描仪为美国Pharmacia公司产。
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1.2 实验方法
1.2.1 模型组 IgAN模型制备参照刘宏伟等[1]报道的方法，即隔日口服含0.1%BSA的酸化水，6周后定期尾静脉注射1%BSA缓冲液(每日1次，连续3次)，8周时复加尾静脉注射SEB(每周1次，连续3周)，然后观察至第12周末。
1.2.2 滋肾止血片组 造模与模型组相同，于8周静脉注射1%BSA缓冲液出现蛋白尿、血尿后开始用滋肾止血片15 g/(kg . d), 灌胃给药，至第12周末。
1.2.3 潘生丁组 造模与模型组相同，于8周静脉注射1%BSA缓冲液出现蛋白尿、血尿后开始用潘生丁15 g/(kg . d), 灌胃给药，至第12周末。
1.2.4 茜草双酯片组 造模与模型组相同，于8周静脉注射1%BSA缓冲液出现蛋白尿、血尿后开始用茜草双酯片15 g/(kg . d), 灌胃给药，至第12周末。
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1.2.5 正常对照组 隔日口服酸化水，共12周。在上述12周内，各组动物进食进水量不限。从6周起用代谢笼留尿，每1周查尿红细胞及尿蛋白。实验动物在12周末，禁食12 h，速眠新(846合剂)和盐酸氯胺酮麻醉。迅速打开腹腔，腹主动脉取血，并取出肾组织，在冰板上剪成3份，用生理盐水洗净其中血液，然后装入直径为0.4 cm、长3 cm的塑料管内,投入液氮瓶中待测。
1.3 检测项目和方法
1.3.1 肾组织转化生长因子β(TGF-β)mRNA表达的测定 按文献方法[2]，聚合酶链反应(PCR)。
2 结果
各组肾脏组织TGF-β mRNA经反转录, cDNA PCR扩增，取扩增产物进行1.5%的琼脂糖电泳，并以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为对照。结果显示，各组肾组织GAPDH mRNA的PCR产物电泳条带，在明暗或宽窄方面均匀一致。而各组肾组织TGF-β mRNA的PCR产物电泳条带则显示明显的不均(图略)。正常对照组电泳条带线暗，其次为滋肾止血片组、茜草双酯片组，潘生丁组的电泳条带比较明亮，模型组最为明显。从各组大鼠TGF-β定量比较的研究中可以看出，模型组的TGF-β定量明显高于正常组，滋肾止血片组的TGF-β定量明显低于模型组。
, http://www.100md.com
3 讨论
我们从胃肠粘膜免疫入手以口服牛血清白蛋白(BSA)、葡萄球菌肠毒素B(SEB)感染的复合法建立大鼠实验性IgAN模型。实验结果表明模型组和治疗组大鼠自第6周起临床表现有蛋白尿、血尿，并持续至实验结束。肾脏病理提示有系膜细胞增生和基质增多，免疫荧光和免疫酶标染色显示IgA在肾小球系膜区呈团状沉积。实验结果基本符合我们原来的设想，与文献报道一致[3]，从而提示该模型是成功的。
转化生长因子β具有调解细胞生长、分化，以及免疫抑制、免疫趋化等多种生物学功能，参与了机体许多生理和病理过程。其中尤以在组织器官免疫和非免疫损伤后的瘢痕和纤维化形成过程中的作用最为引人注目。它是迄今为止人们所发现的在纤维和结缔组织基质发生过程中重要的细胞因子[4，5]。最近的研究表明，肾脏疾病中，肾小球表达TGF-β明显增加。在研究本项指标时，我们采用了PCR技术。为严格控制组间差异，实验中从组织块处理到PCR产物电泳的全过程均为各组同步进行，并设立以“看家”基因—GAPDH为对照的外控组，从GAPDH mRNA的PCR产物的电泳条带来看，实验结果是可信的。
我们研究结果显示，各造模组肾组织中的TGF-β mRNA的含量明显高于正常对照组，模型组肾组织中的TGF-β mRNA的含量又明显高于3个治疗组。由多到少可排定以下顺序：模型组、潘生丁组、茜草双酯片组、滋肾止血片组、正常对照组。正常对照组与滋肾止血片组肾组织中的TGF-β mRNA内控定量较少，与其他各组比较有显著性差异(P, http://www.100md.com