蝎毒抗癌多肽的研究进展
http://www.100md.com
蝎毒抗癌多肽(antineoplastic polypeptide from Buthus martensii venom，APBMV)是从东亚钳蝎蝎毒中提取分离的抗肿瘤有效部位，对人食管癌、胃癌、喉癌、鼻咽癌及直肠腺癌细胞株等有显著的细胞杀伤和细胞毒性作用，对肝癌、肺癌等有确切的疗效。目前该项研究越来越深入并从APB MV中又分离出单一成分蝎毒抗癌多肽组分Ⅲ(antineoplas tic polypeptide-Ⅲ from APBMV，AP-Ⅲ)，纯度达95%，毒性较APBMV强约16%，具有抑制H22生长的作用，高剂量的AP-Ⅲ可增加带瘤小鼠胸腺重量，提高机体的免疫功能。
蝎毒抗癌多肽的提取分离
蝎毒抗癌多肽是河南医科大学生物毒素中心利用分子筛层析技术从东亚钳蝎粗蝎毒中分离出的抗肿瘤有效部位，其相对分子质量在6000～7000之间。孔天翰等对该部位用HPLC仪进行检测发现有4个峰，说明APBMV并不是一个单一成分的多肽，而是由4组多肽组成并带有不同电荷或电量的APBMV。郭进武等对APBMV进行了分离纯化条件的摸索，选用Sepharose FF强阳性离子交换凝胶，通过改变柱长和流速，可得到不同的蝎毒样品。当选择柱长 25cm，直径5cm，流速0.2mL/min时出现有3个峰，得到 APBMV，AP-Ⅲ纯度为83%且峰形低平；当流速为0.5mL/ min时，分离出4个峰，AP-Ⅲ纯度为85%；流速为1.0或 0.8mL/min时，可得到6个峰，纯度为89%，研究表明流速为1.0或0.8mL/min是最佳的分离条件。孔天翰等探讨了AP-Ⅲ的分离和纯化方法，将蝎毒预处理后，分别采用 Sephadex FF阳性离子交换凝胶柱层析法和Sepharose FF 阳性离子交换凝胶柱与Sephadex G-50凝胶柱联合层析法，从APBMV中分离AP-Ⅲ，用HPLC仪检测两种方法分离出的AP-Ⅲ的纯度及产量。结果表明：前者的分离纯度及产量与郭进武等人的分离结果相同。而后者的分离结果比前者的效果好，其产率为4.72%，纯度为95%。
, http://www.100md.com
蝎毒抗癌多肽的热稳定性
近年来研究显示生物毒素主要由多种肽类物质所组成，其活性及毒力与温度有密切关系。随着温度的升高，加热时间的延长，毒素的毒力逐渐下降，直至完全失活。APBMV 对热是否稳定引起了专家的关注，孔天翰等利用紫外分光光谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定了APBMV粉针制剂的热稳定性，结果显示50℃～80℃范围内随着加热时间延长，在波长280nm处吸光度逐渐升高，聚丙烯酰胺凝胶电泳主色带逐渐变浅，但PH值、水溶性及外观色泽无明显变化。朱心强等报道新鲜蝎毒煮沸30min，其毒性基本未见破坏，即使煮沸120min，其LD50升高1倍左右，仍有明显的毒性。两者研究结果基本一致，由此可见蝎毒及其注射剂在常压下煮沸不易破坏。据上述结果，注射用APBMV粉针剂在 4℃密闭、暗处储藏的情况下，其保质期可暂定为5年。
蝎毒抗癌多肽的药理研究
蝎毒抗癌多肽抑瘤作用：蝎毒抗癌多肽对多种肿瘤均有抑制作用，尤对食管瘤(Eca109)细胞株、人喉癌(Hep 2)细胞株及人直肠腺癌(C1184)细胞株有显著的细胞杀伤和细胞毒性作用；明显延长腹腔接种艾氏腹水癌小鼠的生存期；抑制小鼠肉瘤37(S37)的生长；并可提高小鼠的细胞免疫功能，连续注射91d APBMV，对重要器官没有损害作用。董伟华等以APBMV不同浓度处理4种肿瘤细胞(人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60、人肝癌细胞株SMMC-7721、人低分化鼻咽上皮癌细胞株CNE-2Z和人胃癌细胞株MGC 803)。结果APBMV均有显著的细胞毒性和生长抑制作用。 APBMV对HL-60细胞的生长抑制作用以48h为显著，还可显著抑制SMMC-7721细胞的集落形成。另外APBMV对小鼠肝癌H22和小鼠黑色素瘤B16均有明显的抑制作用，抑制率均大于3O%，与对照组相比差异显著(P<0.001)；APB MV在高、中、低3个剂量组对B16具有显著的抑制作用，其抑制作用强于5-氟尿嘧啶(5-FU)。经用APBMV处理的H22 带瘤小鼠外周血白细胞数及脾脏指数(SI)与对照组相比无明显变化；用5-Fu处理后则使H22带瘤小鼠白细胞数和SI 明显减少，与对照组及APBMV治疗组相比差异非常显著(P<0.001)。说明APBMV能有效抑制H22和B16的生长，并有助于带瘤小鼠机体正常功能的维持。研究证明APBM 能够抑制人肝癌细胞株和小鼠肝癌细胞株的生长，使克隆形成的能力下降，其抑制作用与浓度和作用时间均有明显的依赖关系。APBMV经实验治疗小鼠肝癌H22后，带瘤小鼠外周白细胞计数和脾脏指数均比5-FU治疗组明显升高，在抑制肝癌H22的同时，没有出现骨髓抑制等毒副作用。APBMV可以引起鼻咽癌CNE-2Z细胞膜钾电位降低，使CNE-2Z细胞周期阻滞于G1期。近年来的临床观察显示：注射用的 APBMV胸腔内肝动脉介入给药对肝癌、肺癌等有确切的疗效。韩雪飞等研究了AP-Ⅲ对肝癌H22的生长抑制作用及对带瘤小鼠胸腺重量的影响，结果表明：AP-Ⅲ实验组和APBMV组对H22有明显的抑制作用，与对照组比较有显著性差异(P<0.01或P<0.001＝。5-FU组胸腺重量低于对照组，而AP-Ⅲ实验组和AFBMV组则高于或接近对照组。结果显示AP-Ⅲ具有抑制H22生长的作用，高剂量的AP-Ⅲ 还可增加带瘤小鼠的胸腺重量。
, 百拇医药
蝎毒抗癌多肽的免疫调节作用
蝎毒抗癌多肽与化疗药合用对免疫调节作用的影响：董伟华等在研究中分别观察了单独给APBMV、5- FU以及APBMV与化疗药5-Fu联合应用后带瘤小鼠免疫功能的改变。结果显示：APBMV及APBMV与5-Fu联合应用可显著增强H22带瘤小鼠NK细胞的活性，提高其淋巴细胞转化指数，增强二硝基氮苯(DNCB)诱导的皮肤迟发超敏反应，与对照组及单用5-FU组有显著性差异；APBMV可显著提高H22带瘤小鼠外周血白细胞计数，当其与5-Fu联合应用后亦能明显减轻5-Fu所致的白细胞减少，使白细胞计数恢复接近对照组水平；单用APBMV还可提高H22带瘤小鼠血清溶血素水平。韩雪飞等研究了APBMV对人低分化量咽癌上皮细胞CNE-2Z的毒性作用，从而找出APBMV抑制鼻咽癌的最佳浓度。结果APBMV在2～8mg/L浓度范围内，生长抑制率GL<50%，CT>50%，其中在3～6mg/L 浓度范围内，CT>68%，与阴性对照组比较有显著差异(P< 0.05或P<0.01)，但剂量效应关系不明显。APBMV对 CNE-2Z具有较强的细胞毒性作用。
, http://www.100md.com
蝎毒抗癌多肽与放疗合用对免疫调节作用的比较；孔天翰观察了APBMV对放疗后肝癌小鼠瘤重以及对放疗引起的造血功能抑制和脂质过氧化等机体状况的影响。单独应用APBMV时，对H22均保持较稳定的抑制作用，抑瘤率最高可达40.30%；APBMV与放疗(RT)联用可维持较强的肿瘤抑制作用，H22带瘤小鼠的瘤重显著下降，肿瘤生长抑制率(IR)最高可达78.28%，对肿瘤的抑制作用显著优于单用RT和APBMV组。说明APBMV可能增加了肿瘤组织对射线的敏感性，或是发挥了其本身对肝癌H22细胞的直接毒性作用，增强了射线对肿瘤细胞的杀伤效应；APBMV具有一定程度的升白细胞和骨髓保护作用；APBMV组带瘤小鼠的脾脏指数(SI)保持正常水平，APBMV与RT合用SI亦高于RT组(P<0.05)，说明APBMV可对抗辐射所引起的SI 降低，对脾脏有一定的保护作用；APBMV能够加快清除照射后产生的自由基，抑制辐射引发的脂质过氧化作用，拮抗放疗引起的SOD活力下降，提高机体的抗氧化能力。APB MV不但能高选择性杀伤多种肿瘤细胞，增强机体免疫力，尚可减轻化疗对骨髓造血功能抑制的副作用，增强正常组织对放疗抗辐射的能力。
, 百拇医药
蝎毒抗癌多肽的毒性研究：董伟华等对APBMV及其AP-Ⅲ进行了毒性比较研究，结果表明：给小鼠注射大剂量的APBMV或AP-Ⅲ1～5min后，可出现尖叫不安、跳跃、添注射部位、多涎、呆滞、呼吸不规则、颈部立毛等行为学的改变。随着给药时间的延长，动物呈俯伏不动，后肢痉挛性麻痹，呼吸加速，窒息，惊厥直至死亡，大部分动物的死亡时间均在注射后90min之内。解剖死亡动物，心、大脑、肝、肺、胃、小肠等主要器官切片观察未见明显的病理改变。根据各组动物的给药剂量及死亡率，测得APBMV LD50为9.738 mg/kg，95%可信区间为(9.738±1.527)mg/kg；AP-Ⅲ LD50为8.177mg/kg，95%可信区间为(8.17±1.279)mg/ kg。AP-Ⅲ的毒性较APBMV强约16%以上。从实验结果看出纯度增强则毒性加大，但AP-Ⅲ的抗肿瘤作用是否强于 APBMV则有待进一步的研究。
不同剂型的APBMV对肿瘤细胞和免疫功能的影响
为了做好新药的申报工作，以便为临床提供科学的依据，孔天翰等对APBMV的剂型进行了研究比较，在试验中分别给予3种APBMV制剂(针剂、胶囊、乳剂)及5-FU。结果5-Fu对H22荷瘤小鼠的抑癌率最高，可达48.81%； APBMV针剂对肿瘤的抑制率达40.59%与阴性对照组相比差异均有显著性(P, http://www.100md.com
蝎毒抗癌多肽的提取分离
蝎毒抗癌多肽是河南医科大学生物毒素中心利用分子筛层析技术从东亚钳蝎粗蝎毒中分离出的抗肿瘤有效部位，其相对分子质量在6000～7000之间。孔天翰等对该部位用HPLC仪进行检测发现有4个峰，说明APBMV并不是一个单一成分的多肽，而是由4组多肽组成并带有不同电荷或电量的APBMV。郭进武等对APBMV进行了分离纯化条件的摸索，选用Sepharose FF强阳性离子交换凝胶，通过改变柱长和流速，可得到不同的蝎毒样品。当选择柱长 25cm，直径5cm，流速0.2mL/min时出现有3个峰，得到 APBMV，AP-Ⅲ纯度为83%且峰形低平；当流速为0.5mL/ min时，分离出4个峰，AP-Ⅲ纯度为85%；流速为1.0或 0.8mL/min时，可得到6个峰，纯度为89%，研究表明流速为1.0或0.8mL/min是最佳的分离条件。孔天翰等探讨了AP-Ⅲ的分离和纯化方法，将蝎毒预处理后，分别采用 Sephadex FF阳性离子交换凝胶柱层析法和Sepharose FF 阳性离子交换凝胶柱与Sephadex G-50凝胶柱联合层析法，从APBMV中分离AP-Ⅲ，用HPLC仪检测两种方法分离出的AP-Ⅲ的纯度及产量。结果表明：前者的分离纯度及产量与郭进武等人的分离结果相同。而后者的分离结果比前者的效果好，其产率为4.72%，纯度为95%。
, http://www.100md.com
蝎毒抗癌多肽的热稳定性
近年来研究显示生物毒素主要由多种肽类物质所组成，其活性及毒力与温度有密切关系。随着温度的升高，加热时间的延长，毒素的毒力逐渐下降，直至完全失活。APBMV 对热是否稳定引起了专家的关注，孔天翰等利用紫外分光光谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定了APBMV粉针制剂的热稳定性，结果显示50℃～80℃范围内随着加热时间延长，在波长280nm处吸光度逐渐升高，聚丙烯酰胺凝胶电泳主色带逐渐变浅，但PH值、水溶性及外观色泽无明显变化。朱心强等报道新鲜蝎毒煮沸30min，其毒性基本未见破坏，即使煮沸120min，其LD50升高1倍左右，仍有明显的毒性。两者研究结果基本一致，由此可见蝎毒及其注射剂在常压下煮沸不易破坏。据上述结果，注射用APBMV粉针剂在 4℃密闭、暗处储藏的情况下，其保质期可暂定为5年。
蝎毒抗癌多肽的药理研究
蝎毒抗癌多肽抑瘤作用：蝎毒抗癌多肽对多种肿瘤均有抑制作用，尤对食管瘤(Eca109)细胞株、人喉癌(Hep 2)细胞株及人直肠腺癌(C1184)细胞株有显著的细胞杀伤和细胞毒性作用；明显延长腹腔接种艾氏腹水癌小鼠的生存期；抑制小鼠肉瘤37(S37)的生长；并可提高小鼠的细胞免疫功能，连续注射91d APBMV，对重要器官没有损害作用。董伟华等以APBMV不同浓度处理4种肿瘤细胞(人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60、人肝癌细胞株SMMC-7721、人低分化鼻咽上皮癌细胞株CNE-2Z和人胃癌细胞株MGC 803)。结果APBMV均有显著的细胞毒性和生长抑制作用。 APBMV对HL-60细胞的生长抑制作用以48h为显著，还可显著抑制SMMC-7721细胞的集落形成。另外APBMV对小鼠肝癌H22和小鼠黑色素瘤B16均有明显的抑制作用，抑制率均大于3O%，与对照组相比差异显著(P<0.001)；APB MV在高、中、低3个剂量组对B16具有显著的抑制作用，其抑制作用强于5-氟尿嘧啶(5-FU)。经用APBMV处理的H22 带瘤小鼠外周血白细胞数及脾脏指数(SI)与对照组相比无明显变化；用5-Fu处理后则使H22带瘤小鼠白细胞数和SI 明显减少，与对照组及APBMV治疗组相比差异非常显著(P<0.001)。说明APBMV能有效抑制H22和B16的生长，并有助于带瘤小鼠机体正常功能的维持。研究证明APBM 能够抑制人肝癌细胞株和小鼠肝癌细胞株的生长，使克隆形成的能力下降，其抑制作用与浓度和作用时间均有明显的依赖关系。APBMV经实验治疗小鼠肝癌H22后，带瘤小鼠外周白细胞计数和脾脏指数均比5-FU治疗组明显升高，在抑制肝癌H22的同时，没有出现骨髓抑制等毒副作用。APBMV可以引起鼻咽癌CNE-2Z细胞膜钾电位降低，使CNE-2Z细胞周期阻滞于G1期。近年来的临床观察显示：注射用的 APBMV胸腔内肝动脉介入给药对肝癌、肺癌等有确切的疗效。韩雪飞等研究了AP-Ⅲ对肝癌H22的生长抑制作用及对带瘤小鼠胸腺重量的影响，结果表明：AP-Ⅲ实验组和APBMV组对H22有明显的抑制作用，与对照组比较有显著性差异(P<0.01或P<0.001＝。5-FU组胸腺重量低于对照组，而AP-Ⅲ实验组和AFBMV组则高于或接近对照组。结果显示AP-Ⅲ具有抑制H22生长的作用，高剂量的AP-Ⅲ 还可增加带瘤小鼠的胸腺重量。
, 百拇医药
蝎毒抗癌多肽的免疫调节作用
蝎毒抗癌多肽与化疗药合用对免疫调节作用的影响：董伟华等在研究中分别观察了单独给APBMV、5- FU以及APBMV与化疗药5-Fu联合应用后带瘤小鼠免疫功能的改变。结果显示：APBMV及APBMV与5-Fu联合应用可显著增强H22带瘤小鼠NK细胞的活性，提高其淋巴细胞转化指数，增强二硝基氮苯(DNCB)诱导的皮肤迟发超敏反应，与对照组及单用5-FU组有显著性差异；APBMV可显著提高H22带瘤小鼠外周血白细胞计数，当其与5-Fu联合应用后亦能明显减轻5-Fu所致的白细胞减少，使白细胞计数恢复接近对照组水平；单用APBMV还可提高H22带瘤小鼠血清溶血素水平。韩雪飞等研究了APBMV对人低分化量咽癌上皮细胞CNE-2Z的毒性作用，从而找出APBMV抑制鼻咽癌的最佳浓度。结果APBMV在2～8mg/L浓度范围内，生长抑制率GL<50%，CT>50%，其中在3～6mg/L 浓度范围内，CT>68%，与阴性对照组比较有显著差异(P< 0.05或P<0.01)，但剂量效应关系不明显。APBMV对 CNE-2Z具有较强的细胞毒性作用。
, http://www.100md.com
蝎毒抗癌多肽与放疗合用对免疫调节作用的比较；孔天翰观察了APBMV对放疗后肝癌小鼠瘤重以及对放疗引起的造血功能抑制和脂质过氧化等机体状况的影响。单独应用APBMV时，对H22均保持较稳定的抑制作用，抑瘤率最高可达40.30%；APBMV与放疗(RT)联用可维持较强的肿瘤抑制作用，H22带瘤小鼠的瘤重显著下降，肿瘤生长抑制率(IR)最高可达78.28%，对肿瘤的抑制作用显著优于单用RT和APBMV组。说明APBMV可能增加了肿瘤组织对射线的敏感性，或是发挥了其本身对肝癌H22细胞的直接毒性作用，增强了射线对肿瘤细胞的杀伤效应；APBMV具有一定程度的升白细胞和骨髓保护作用；APBMV组带瘤小鼠的脾脏指数(SI)保持正常水平，APBMV与RT合用SI亦高于RT组(P<0.05)，说明APBMV可对抗辐射所引起的SI 降低，对脾脏有一定的保护作用；APBMV能够加快清除照射后产生的自由基，抑制辐射引发的脂质过氧化作用，拮抗放疗引起的SOD活力下降，提高机体的抗氧化能力。APB MV不但能高选择性杀伤多种肿瘤细胞，增强机体免疫力，尚可减轻化疗对骨髓造血功能抑制的副作用，增强正常组织对放疗抗辐射的能力。
, 百拇医药
蝎毒抗癌多肽的毒性研究：董伟华等对APBMV及其AP-Ⅲ进行了毒性比较研究，结果表明：给小鼠注射大剂量的APBMV或AP-Ⅲ1～5min后，可出现尖叫不安、跳跃、添注射部位、多涎、呆滞、呼吸不规则、颈部立毛等行为学的改变。随着给药时间的延长，动物呈俯伏不动，后肢痉挛性麻痹，呼吸加速，窒息，惊厥直至死亡，大部分动物的死亡时间均在注射后90min之内。解剖死亡动物，心、大脑、肝、肺、胃、小肠等主要器官切片观察未见明显的病理改变。根据各组动物的给药剂量及死亡率，测得APBMV LD50为9.738 mg/kg，95%可信区间为(9.738±1.527)mg/kg；AP-Ⅲ LD50为8.177mg/kg，95%可信区间为(8.17±1.279)mg/ kg。AP-Ⅲ的毒性较APBMV强约16%以上。从实验结果看出纯度增强则毒性加大，但AP-Ⅲ的抗肿瘤作用是否强于 APBMV则有待进一步的研究。
不同剂型的APBMV对肿瘤细胞和免疫功能的影响
为了做好新药的申报工作，以便为临床提供科学的依据，孔天翰等对APBMV的剂型进行了研究比较，在试验中分别给予3种APBMV制剂(针剂、胶囊、乳剂)及5-FU。结果5-Fu对H22荷瘤小鼠的抑癌率最高，可达48.81%； APBMV针剂对肿瘤的抑制率达40.59%与阴性对照组相比差异均有显著性(P, http://www.100md.com