基础研究：维奥欣对阿霉素所致大鼠心肌线粒体毒性的保护作用
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摘要：本研究的目的，①确定维奥欣是否对阿霉素所致心肌线粒体毒性具有保护作用；②弄清维奥欣是否影响阿霉素的抗肿瘤作用。应用电镜细胞化学方法，从心肌细胞超微结构和细胞色素C氧化酶的改变方面，观察了维奥欣对心肌细胞的保护作用，阿霉素造成的大鼠心肌细胞肌原纤维排列紊乱、线粒体肿胀、嵴断裂及细胞色素C氧化酶活性降低，可明显地被维奥欣所防止。结果显示：维奥欣对阿霉素所致的心肌细胞毒性具有完全的保护作用，而不干扰其抗肿瘤作用，这种保护作用可能与心肌细胞抗氧化状态的维持有关。
关键词：阿霉素；线粒体；细胞色素C氧化酶；维奥欣
阿霉素是临床上常用的非常有效的抗肿瘤药物，但由于它的分子结构中的半醌基发生氧化还原反应引起过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH)的形成增多[1,2]，造成对心肌细胞的毒性，大大限制了这一高效抗肿瘤药物的临床应用。因而寻找一种安全而有效的抗氧化制剂是当务之急。本研究采用超微病理学方法结合细胞化学技术，观察维奥欣对阿霉素所致心肌线粒体损伤的保护作用，为临床提供一种有效的抗阿霉素毒副作用的药物。
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材料与方法
1. 雄性SD大鼠30只，体重150～180g，随机分为3组，每组10只。第一组为对照组，给大鼠腹腔注射与阿霉素等量的生理盐水；第二组为阿霉素组，给大鼠腹腔一次性注射阿霉素(Sig ma)1.5mg/100g体重；第三组为维奥欣加阿霉素组；大鼠先隔日灌服维奥欣6次，每次12.0mg/kg体重，然后再隔日灌服维奥欣3次，维奥欣总剂量为1.08g/kg体重。三组动物采用基础饲料，同条件喂养。在最后一次灌服维奥欣24小时后，三组动物经戊巴比妥纳腹腔注射麻醉，2%多聚甲醛，0.5%戊二醛灌流固定，取下心脏，将左心室切成小条，再在同一固定液中固定1小时，30mol/L PI PES缓冲液冲洗。
2. 用于细胞化学观察的心肌组织，振荡切片机切片，厚度为40μm，细胞色素C氧化酶按Seligman[3]法显示，切片入孵育液中(DAB:10mg;30mol/L PIPES缓冲液；5ml；过氧化氢酶：1mg;细胞色素C:5mg;蔗糖0.5mg;蒸馏水5ml。所需药品均购自Sigma公司)，37℃,30min,经PIPES缓冲液冲洗后，1%锇酸后固定1小时，梯度酒精脱水，Spurr树脂包埋，JEOL1200EX电镜观察。
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3. 用于超微结构观察的心肌组织切成1mm3的小块，行常规透射电镜标本制作。
结 果
1. 超微结构观察：对照组心肌细胞两Z线之间肌原纤维排列规则，线粒体丰富，其嵴平行排列，横小管位于Z线水平，肌浆网近横小管处略膨大，与横小管紧贴形成二联体(图1)；阿霉素组可见肌原纤维排列紊乱，线粒体肿胀、嵴断裂、空泡化(图2)；维奥欣加阿霉素组，肌原纤维、线粒体、横小管的结构与对照组无明显差异(图3)。
2. 细胞化学观察：电镜下，对照组心肌细胞细胞色素C氧化酶反应产物主要分布于线粒体内膜和线粒体嵴，呈均匀一致的高电子密度(图4)，阿霉素组大多数心肌细胞线粒体细胞色素C氧化酶活
性明显减弱，电子密度降低，有的线粒体酶活性几乎消失(图5)；维奥欣加阿霉素组、细胞色素C氧化酶的活性则保存良好，线粒体骨膜及嵴均可见较强的酶活性，与对照组相似(图6)。
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图版说明
1. 对照组心肌细胞的超微结构，线粒体嵴平行排列(M)，横小管与肌浆网构成二连(箭头)，×10000
2. 阿霉素组心肌细胞的超微结构，可见肌原纤维排列紊乱，线粒体嵴断裂(M)，横小管肿胀、扩张，肌浆网扩张，×10000
3. 维奥欣加阿霉素组心肌细胞的超微结构、线粒体、横小管和肌浆网与对照组比较无显著差别，×10000
4. 对照组电镜下细胞色素C氧化酶活性，酶反应产物位于线粒体内膜及线粒体嵴，呈均匀一致的高电子密度，×10000
5. 阿霉素组电镜下细胞色素C氧化酶活性，很多线粒体显示弱的酶活性，有的线粒体酶活性消失，×10000
6. 维奥欣加阿霉素组电镜下细胞色素C氧化酶活性，可见酶活性增强，线粒体骨膜及嵴均可见较高电子密度的酶反应产物，×10000
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讨 论
阿霉素是一种十分有效药物，但由于它对心肌细胞的毒性作用，如引起心肌病和充血性心力衰竭等[4，5]，使其临床应用受到了很大限制。已有研究认为，阿霉素主要损伤心肌细胞的线粒体[1，6]，因线粒体内富有阴电荷的磷脂-心脂，与阿霉素有较高的亲和力，相互作用的结果使依赖心脂的酶-细胞色素C氧化酶活性降低。细胞色素C氧化酶是线粒体的标志酶，主要定位于线粒体内膜，参与氧化磷酸化过程中的电子传递，本研究中，阿霉素使线粒体细胞色素C氧化酶活性降低，表明心肌细胞有氧氧化代谢能力下降和能量供应不足，同时形态学观察到的心肌细胞肌原纤维紊乱，线粒体肿胀、嵴断裂等形态学改变了反映了心肌细胞的中毒反应和代谢障碍。
维奥欣是从药用植物穿山龙中提取的8种水溶性甾体皂甙，经科学配方精制而成的纯中药制剂，具有吸收性好，生物利用度高的特点，临床上主要用于降低血脂、改善心肌缺血及心肌再灌注性损伤等。但对其确切作用机制尚不十分清楚。为了进一步研究它的作用机制，开发其新的用途，我们观察了维奥欣对阿霉素所致心肌细胞线粒体损伤的保护作用，研究发现大鼠灌服维奥欣后，对阿霉素造成的心肌损害有明显的保护作用。虽然阿霉素致心肌线粒体损伤是多方面的[7,8]，但都与有害自由基的作用有关[1,2，6]，因此我们推测维奥欣对阿霉素所致的心肌线粒体损伤的保护作用很可能与其对自由基的清除有关，因阿霉素的分子结构中的半醌基发生氧化还原反应引起H2O2和-OH的形成增多[1,2]，造成膜脂质过氧化，导致正常心肌细胞损伤，而阿霉素的杀肿瘤细胞作用，主要是其嵌入DNA分子中，干扰DNA的转录[9]，所以维奥欣不干扰其抗肿瘤作用。近几年来许多学者在不断寻找预防阿霉素心肌线粒体损害而不干扰抗肿瘤作用的药物，维奥欣的应用为预防化疗药物所致的心肌损伤开辟了一条新途径。我们认为维奥欣不仅可用于心脑血管病，还可用于预防化疗药物所致的心肌损伤，是目前有希望的预防自由基损害的药物。
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参 考 文 献
1 Griffin-Green EA, Zaleska MM, Ercinska M. Adriamycin-induced lipid pcroxidation in mitochondria and microsomes, biochem pharmacol, 1988, 37(16): 3071
2 Dorshow JH. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart. Cancer Res,1983, 43: 460
3 Seligman, AM, Karnovsky MJ, Wasserkrug HL, et al. Non-droplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J cell Biol, 1968, 38: 1-4
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4 Lefrak EA, Pitha J, Rosenheim S, et al. A clinicopathologic analysis of adrismycin cardiotoxicity. Cancer 1973,32:302
5 Goorin AM, Chauvenet AR, Peroz-Atayde AR, et al. Initial congestive heart failure, six to ten years after doxorubicin chemotherapy for childhood cancer. J Pediatr 1990 ; 116: 144
6 Singnal PK, Deally CMR, Weinbery LE. Subcellular effects of adriamycin in the heart: A concise review. J Moi Cell Cardiol 1987, 19: 817
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7 Tong J, Ganguly PK, Singal PK. Myocardial adrcnergic changes at two stages of heart failure duc to adricmycin treatment in rats. Am J Physiol 1991, 260: H909
8 Singal PK, Pierce GN. Adricmycin stinulates low-affinity Ca2+ binding and lipid peroxidation but depresses myocardial function. Am J: Physiol. 1986,250:H419
9 Mycrs, CE, McGuirs Wp, Liss Rh, et al. Adriamycin; the role of lipid peroxidation in cardiac toxicity and tumor response. Science, 1977, 19: 165, 百拇医药
关键词：阿霉素；线粒体；细胞色素C氧化酶；维奥欣
阿霉素是临床上常用的非常有效的抗肿瘤药物，但由于它的分子结构中的半醌基发生氧化还原反应引起过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH)的形成增多[1,2]，造成对心肌细胞的毒性，大大限制了这一高效抗肿瘤药物的临床应用。因而寻找一种安全而有效的抗氧化制剂是当务之急。本研究采用超微病理学方法结合细胞化学技术，观察维奥欣对阿霉素所致心肌线粒体损伤的保护作用，为临床提供一种有效的抗阿霉素毒副作用的药物。
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材料与方法
1. 雄性SD大鼠30只，体重150～180g，随机分为3组，每组10只。第一组为对照组，给大鼠腹腔注射与阿霉素等量的生理盐水；第二组为阿霉素组，给大鼠腹腔一次性注射阿霉素(Sig ma)1.5mg/100g体重；第三组为维奥欣加阿霉素组；大鼠先隔日灌服维奥欣6次，每次12.0mg/kg体重，然后再隔日灌服维奥欣3次，维奥欣总剂量为1.08g/kg体重。三组动物采用基础饲料，同条件喂养。在最后一次灌服维奥欣24小时后，三组动物经戊巴比妥纳腹腔注射麻醉，2%多聚甲醛，0.5%戊二醛灌流固定，取下心脏，将左心室切成小条，再在同一固定液中固定1小时，30mol/L PI PES缓冲液冲洗。
2. 用于细胞化学观察的心肌组织，振荡切片机切片，厚度为40μm，细胞色素C氧化酶按Seligman[3]法显示，切片入孵育液中(DAB:10mg;30mol/L PIPES缓冲液；5ml；过氧化氢酶：1mg;细胞色素C:5mg;蔗糖0.5mg;蒸馏水5ml。所需药品均购自Sigma公司)，37℃,30min,经PIPES缓冲液冲洗后，1%锇酸后固定1小时，梯度酒精脱水，Spurr树脂包埋，JEOL1200EX电镜观察。
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3. 用于超微结构观察的心肌组织切成1mm3的小块，行常规透射电镜标本制作。
结 果
1. 超微结构观察：对照组心肌细胞两Z线之间肌原纤维排列规则，线粒体丰富，其嵴平行排列，横小管位于Z线水平，肌浆网近横小管处略膨大，与横小管紧贴形成二联体(图1)；阿霉素组可见肌原纤维排列紊乱，线粒体肿胀、嵴断裂、空泡化(图2)；维奥欣加阿霉素组，肌原纤维、线粒体、横小管的结构与对照组无明显差异(图3)。
2. 细胞化学观察：电镜下，对照组心肌细胞细胞色素C氧化酶反应产物主要分布于线粒体内膜和线粒体嵴，呈均匀一致的高电子密度(图4)，阿霉素组大多数心肌细胞线粒体细胞色素C氧化酶活
性明显减弱，电子密度降低，有的线粒体酶活性几乎消失(图5)；维奥欣加阿霉素组、细胞色素C氧化酶的活性则保存良好，线粒体骨膜及嵴均可见较强的酶活性，与对照组相似(图6)。
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图版说明
1. 对照组心肌细胞的超微结构，线粒体嵴平行排列(M)，横小管与肌浆网构成二连(箭头)，×10000
2. 阿霉素组心肌细胞的超微结构，可见肌原纤维排列紊乱，线粒体嵴断裂(M)，横小管肿胀、扩张，肌浆网扩张，×10000
3. 维奥欣加阿霉素组心肌细胞的超微结构、线粒体、横小管和肌浆网与对照组比较无显著差别，×10000
4. 对照组电镜下细胞色素C氧化酶活性，酶反应产物位于线粒体内膜及线粒体嵴，呈均匀一致的高电子密度，×10000
5. 阿霉素组电镜下细胞色素C氧化酶活性，很多线粒体显示弱的酶活性，有的线粒体酶活性消失，×10000
6. 维奥欣加阿霉素组电镜下细胞色素C氧化酶活性，可见酶活性增强，线粒体骨膜及嵴均可见较高电子密度的酶反应产物，×10000
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讨 论
阿霉素是一种十分有效药物，但由于它对心肌细胞的毒性作用，如引起心肌病和充血性心力衰竭等[4，5]，使其临床应用受到了很大限制。已有研究认为，阿霉素主要损伤心肌细胞的线粒体[1，6]，因线粒体内富有阴电荷的磷脂-心脂，与阿霉素有较高的亲和力，相互作用的结果使依赖心脂的酶-细胞色素C氧化酶活性降低。细胞色素C氧化酶是线粒体的标志酶，主要定位于线粒体内膜，参与氧化磷酸化过程中的电子传递，本研究中，阿霉素使线粒体细胞色素C氧化酶活性降低，表明心肌细胞有氧氧化代谢能力下降和能量供应不足，同时形态学观察到的心肌细胞肌原纤维紊乱，线粒体肿胀、嵴断裂等形态学改变了反映了心肌细胞的中毒反应和代谢障碍。
维奥欣是从药用植物穿山龙中提取的8种水溶性甾体皂甙，经科学配方精制而成的纯中药制剂，具有吸收性好，生物利用度高的特点，临床上主要用于降低血脂、改善心肌缺血及心肌再灌注性损伤等。但对其确切作用机制尚不十分清楚。为了进一步研究它的作用机制，开发其新的用途，我们观察了维奥欣对阿霉素所致心肌细胞线粒体损伤的保护作用，研究发现大鼠灌服维奥欣后，对阿霉素造成的心肌损害有明显的保护作用。虽然阿霉素致心肌线粒体损伤是多方面的[7,8]，但都与有害自由基的作用有关[1,2，6]，因此我们推测维奥欣对阿霉素所致的心肌线粒体损伤的保护作用很可能与其对自由基的清除有关，因阿霉素的分子结构中的半醌基发生氧化还原反应引起H2O2和-OH的形成增多[1,2]，造成膜脂质过氧化，导致正常心肌细胞损伤，而阿霉素的杀肿瘤细胞作用，主要是其嵌入DNA分子中，干扰DNA的转录[9]，所以维奥欣不干扰其抗肿瘤作用。近几年来许多学者在不断寻找预防阿霉素心肌线粒体损害而不干扰抗肿瘤作用的药物，维奥欣的应用为预防化疗药物所致的心肌损伤开辟了一条新途径。我们认为维奥欣不仅可用于心脑血管病，还可用于预防化疗药物所致的心肌损伤，是目前有希望的预防自由基损害的药物。
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参 考 文 献
1 Griffin-Green EA, Zaleska MM, Ercinska M. Adriamycin-induced lipid pcroxidation in mitochondria and microsomes, biochem pharmacol, 1988, 37(16): 3071
2 Dorshow JH. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart. Cancer Res,1983, 43: 460
3 Seligman, AM, Karnovsky MJ, Wasserkrug HL, et al. Non-droplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J cell Biol, 1968, 38: 1-4
, 百拇医药
4 Lefrak EA, Pitha J, Rosenheim S, et al. A clinicopathologic analysis of adrismycin cardiotoxicity. Cancer 1973,32:302
5 Goorin AM, Chauvenet AR, Peroz-Atayde AR, et al. Initial congestive heart failure, six to ten years after doxorubicin chemotherapy for childhood cancer. J Pediatr 1990 ; 116: 144
6 Singnal PK, Deally CMR, Weinbery LE. Subcellular effects of adriamycin in the heart: A concise review. J Moi Cell Cardiol 1987, 19: 817
, http://www.100md.com
7 Tong J, Ganguly PK, Singal PK. Myocardial adrcnergic changes at two stages of heart failure duc to adricmycin treatment in rats. Am J Physiol 1991, 260: H909
8 Singal PK, Pierce GN. Adricmycin stinulates low-affinity Ca2+ binding and lipid peroxidation but depresses myocardial function. Am J: Physiol. 1986,250:H419
9 Mycrs, CE, McGuirs Wp, Liss Rh, et al. Adriamycin; the role of lipid peroxidation in cardiac toxicity and tumor response. Science, 1977, 19: 165, 百拇医药