活化蛋白C拮抗与静脉血栓形成
【摘要】 活化蛋白C拮抗(activated protain cresistance，APCR)是由于APC无法正常、有效的水解、灭活FVa，使凝血酶原复合物、凝血酶生成增加，造成体内高凝状态。目前发现大部分APCR是由于遗传性因素引起，即由于FV的单点突变使其对APC的水解产生拮抗，而又保留有促凝活性。遗传性APCR与人体静脉血栓形成有关，但二者相关性因地域、人种不同而有较大差别，其临床表现也因人而异。获得性APCR逐渐引起重视，但其与临床疾病的相关性及发生机制尚待深入研究。
【关键词】 活化蛋白C 拮抗 静脉血栓 文献综述
静脉血栓形成(venous thrombosis，VT)的病因很多，自1993年Dahlback [1] 首次报道活化蛋白C拮抗(activated pro-tein cresistance，APCR)以来，其已成为可能是静脉血栓形成的最主要原因，并为静脉血栓形成分子机制研究的热点。
1 APC与人体抗凝系统
1978年，Stenflo从吸附过牛血浆的枸橼酸钡上洗脱下一些蛋白质，通过DEAE-Sephadex柱层析，可在第三蛋白峰中分离出一种无促凝活性、依赖维生素K的蛋白质，因在第三峰，故称为蛋白C。激活的PC称为活化蛋白C(acti-vated protein C，APC)，具有明显的抗凝血功能。
1.1 FV、FVⅢ与人体血凝系统 人体在生理状态下，血液促凝/抗凝系统保持平衡，但偏向抗凝以使人体血液循环通畅。而在血管损伤部位抗凝系统下调，促凝系统占优势以利于止血。产生于血管损伤部位的凝血酶可使FV、FⅧ激活，同时使血小板聚集活化;并使纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白网络。FVa、FⅧa结合于激活的血小板表面暴露的带负电的磷脂并作为FⅨa、FⅩa的受体位点。FⅨa和FⅩa是蛋白水解酶，由FⅦa-TF复合物水解相应的酶原而产生。FⅨa和FⅩa之间的膜结合物有效地激活FⅩ，从而构成“X复合酶”(Xase complex或tenase)复合物，从而产生凝血酶。人体的凝血反应是一个高效的酶促反应过程，失控的酶促反应将变成对人体的威胁。为了对付这一潜在的威胁，人体内凝血酶可作为一个天然抗凝系统-蛋白C(Protein C，PC)系统的启动因素，此时凝血酶从一个促凝因素变成一个依赖于内皮细胞的抗凝因素:在完整血管处产生的凝血酶结合于内皮膜蛋白-TM而激活蛋白C，TM是内皮细胞上凝血酶的受体，是凝血酶的强力调节剂和激活PC的辅助因子;活化的蛋白C(APC)通过有限的蛋白水解而灭活膜结合的FⅤa和FⅧa，这个反应可被蛋白S(PS)及未激活的FⅤ加强。
1.2 PC、PS与FⅤa灭活 PC为维生素K依赖性蛋白，与FⅦ，FⅨ及FⅩ有同源性，有共同的调节组成:(从N端开始)一个维生素K依赖性r-羧基谷氨酸(Gla)富有区:两个EGF样片段;一个丝氨酸蛋白酶(SP)调节子。血浆中大多数PC以双链形式存在，其轻链含Gla和EGF片段，重链含SP调节子。在凝血酶-TM复合物激活下，一个12aa的激活肽从重链N端释放，SP调节子转变成为一种活性酶，形成APC;APC高度特异地水解切割FⅤ及FⅧa上有限数目的肽键，但APC只特异地切割灭活膜结合型FⅤ及FⅧa，而对于循环中的FⅤ及FⅧa几乎无影响。未激活的FⅤ与具有同源性的FⅧ有共同的调节子排列:A 1 ，A 2 ，B 1 ，A 3 ，C 1 ，C 2 。凝血酶或FⅩa激活FⅤ后，切割三个肽键Arg709(A 2- B);Arg1545(B-A 3 )。活化的FⅤa由重链(A 1 +A 2 )和轻链(A 3 +C 1 +C 2 )组成，由Ca 2+ 依赖性肽链结合在一起。FⅧ的激活稍有不同:切割发生在A 1 -A 2 ，A 2 -B 1 ，B。APC对二者的切割均发生在A 1 -A 2 内，FⅤa为Arg506，Arg679;FⅧA为Arg336，Arg562。APC切割后，FⅤa和FⅧa失去抗凝活性。
APC单独抗凝活性极低，只有在蛋白S(PS)和FⅤ的辅助下其抗凝活性才可有效表达。目前，未激活的FⅤ作为APC辅助因子的作用机理尚不清楚 [2] 。PS也是维生素K依赖性血浆蛋白，与其它维生素依赖性促凝因子不同的是，它不是一个丝氨酸蛋白酶。PS作为APC辅助因子的机制尚不完全清楚，有人提出PS通过促进APC与磷脂表面的结合以及清除针对APC水解FⅤa，FⅧa的FⅤa、FⅨa依赖性的保护作用而发挥作用。最近有人提出PS的辅助作用是发生于FⅤa上的Arg306切割而不是Arg506切割，加之FⅩa对Arg506的保护作用，提示Arg306是凝血酶原复合物中调节FⅤa活性的关键位点。现在认为FⅤa在Arg506的迅速水解切割有助于Arg306的缓慢水解，Arg306的切割使得FⅤa的活性彻底丧失 [3] 。也有报道PS通过直接作用于FⅤa，FⅩa及磷脂表面而直接抑制凝血酶原酶的激活，从而发挥非APC依赖性的抗凝活性。
PC、PS的杂合子缺陷与静脉血栓发生有相关性:2%～5%血栓病与之有关。人群中的PC缺乏发生频率约为1/300，血栓患者中PC缺陷发生频率升高10倍。PS缺陷在人群中的发生频率仍未知，但家族研究提示PS缺陷相关的静脉血栓形成与PC缺陷相似。PC、PS纯合子缺陷常在新生儿时即表现为严重的、致死性的血栓形成，显示PC系统在调节血液凝固系统中的作用。
2 APCR发病机制
1994年，Bertina等 [4] 对APCR的纯合子与杂合子患者进行了基因分析，发现患者FⅤ基因第1691位核苷酸发生点突变(G→C)，因此生成一种Arg506→GLn置换的异常FⅤ分子(FⅤLeiden)。Corral等 [5] 报道FⅤLeidein突变携带者在正常人群的发生率为2%～7%。Dahlback [6] 报道为5%～10%。正常FⅤa分子的Arg506处为APC断裂之一，因而使FⅤa活性大大降低。Kalafatis等 [7] ，测定了人FⅤa的APC断裂点位于FⅤa重链Arg306，Arg506，Arg679处。没有Arg506断裂，Arg306也可以断裂使FⅤa灭活。Arg679处断裂时对FⅤa灭活不太重要 [8] 。正常FⅤa灭活通过两个同时进行的反应:快反应和慢反应。快反应通过先断裂Arg506，再断裂Arg306而使FⅤa灭活，慢反应通过Arg306断裂而实现。FⅤa Leiden灭活过程类似于正常FⅤa浓度灭活的慢反应。Nicolaes等 [9] 通过米氏方程分析证明，FⅤa和FⅤa Leiden对APC敏感性FⅤa有明显差异。低浓度FⅤa(0.3～5nmol/L)时为20倍，高浓度(280nmol/L)时为2.5倍 [10] (正常人FⅤa浓度为5～10mg/L)。由于FⅤ突变后，APC对其灭活很慢，且FⅤa Leiden凝血活性并未改变，但作为APC辅助因子的活性降低，因而导致血液高凝状态及血栓形成。
3 遗传性APCR与静脉血栓形成
近年来对静脉血栓形成分子机制的研究，发现了一些先天性血栓素质或先天性血栓倾向的病人，同时已观察到在40%的血栓病人中有家族史，但促使血栓发生的遗传性因素仍未完全澄清。APCR的发现使遗传性易血栓症的机理研究迈进了一大步。目前已出现了一大批APCR与静脉血栓危险因素增高的报道，但由于所选择病人的标准及人种的差异，所报告的数据有一定的差异 [11] 。总的来看，由于FⅤ突变引发的遗传性APCR的确是血栓发生的重要高危因素，现已公认由FⅤ突变引发的遗传性APCR是目前所见的静脉血栓形成最常见的遗传诱因，其杂合子患者血栓发生率较其他人高6～8倍，而纯合子的发生率则高30～140倍 [4] 。遗传性APCR的临床表现与其他抗凝因子(PC、PS、AT)的缺乏相似，深静脉血栓(DVT)是最常见的，而肺栓塞较少见。其临床发病率的个体差异较大，有些人可能是终身不 发生血栓，而有些人则从小反复发生严重的血栓，纯合子的发病几率高于杂合子;发生血栓的危险性终生存在，并随年龄的增长而增加。
4 获得性APCR
在西方人群中APCR发生率约为3%～5%，在家族性血栓形成患者中占20%～60%，FⅤa Leiden所致APCR高达95%。然而在非洲、南亚、东南亚及东亚，FⅤa Leiden极为罕见 [12] ，提示APCR的遗传学基因不一定仅为FⅤ突变，亦有获得性APCR的可能，即由于各种获得性因素影响，造成APC对FⅤa和FⅧa的降解功能降低，从而表现为APCR。近年的研究表明可能与下列因素存在关系:抗磷脂抗体 [13] ，作为一大类针对各种负电性磷脂-蛋白复合物的自身或同种抗体，与血栓形成密切相关。高同型半胱氨酸血症 [14] 与血管内皮细胞损伤、增强内皮细胞表面FⅤ的活性、降低PC活性等有关。妊娠 [15] 中由于生理性适应而使促凝系统效率增高、PC系统受到抑制，APC反应低于未妊娠妇女，若合并其他病理性抗凝物质，也有可能发生获得性APCR。狼疮性抗凝物质由于可干扰PC系统反应而被认为可能导致获得性APCR [16] ，这可能与急性血栓形成时相反应中促凝因子如FⅧ和纤维蛋白升高以及具有APC抑制性的a-抗胰蛋白酶升高有关。口服避孕药 [17] 、感染 [18] 等可能引起血浆铜蓝蛋白水升增高在APC灭活FⅤa和FⅧa时与之竞争受体，因而抑制了这两个凝血因子灭活，导致APCR。这方面的原因尚待深入研究。
综上所述，本人对活化蛋白C拮抗与静脉血栓形成从临床及分子生物学角度进行了探讨，加深了人们对静脉血栓的认识，对探索静脉血栓的预防及治疗有着重要的指导意义。
参考文献
1 Dahlback B.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90:1004-1008.
2 Williamson D，Brown K，Luddington R，et al.Blood，1998，91:1139-1140.
3 Aparicio Cand Dahlback B.Biochem J，1996，313:467.
4 Bertina RM Nature，1994，369:64-67.
5 Corral J.Thromb Haemost，1996，76(5):735-737.
6 Dahlback B.Thromb Haemost，1995，74(1):139-148.
7 Kalafatis M.J Biol Chem，1994，269:31869-31880.
8 Roshg J.J Biol Chem，1995，270:4053-4057.
9 Nicolaes GA.J Biol Chem，1995，270:21158-21166.
10 Kalafatis M.J Biol Chem，1995，270:4053-4057.
11 Chacg-hong HO.Thrombc.Res，1997，88:409-412.
12 Guglielmina P.Thromb Haemost，1997，77(2):329-331.
13 Bokarewa MI.Semin Hematol，1997，34(3):235-243.
14 D Angelo A.Haematologica，1997，82(2):211-219.
15 Cumming TR.Br J Haemetal，1995，90:725-727.
16 Visser Mc，Fernandez JA，Amersco SF，et al.Br J Haematol，1998，12:146.
17 Olivieriu.Br Haemetal，1995，91:465-470.
18 Green D.Thromb Haemost，1997，(suppl):316.
作者单位:300222天津市第四医院外科
(编辑秋 实), 百拇医药(赵长义)
【关键词】 活化蛋白C 拮抗 静脉血栓 文献综述
静脉血栓形成(venous thrombosis，VT)的病因很多，自1993年Dahlback [1] 首次报道活化蛋白C拮抗(activated pro-tein cresistance，APCR)以来，其已成为可能是静脉血栓形成的最主要原因，并为静脉血栓形成分子机制研究的热点。
1 APC与人体抗凝系统
1978年，Stenflo从吸附过牛血浆的枸橼酸钡上洗脱下一些蛋白质，通过DEAE-Sephadex柱层析，可在第三蛋白峰中分离出一种无促凝活性、依赖维生素K的蛋白质，因在第三峰，故称为蛋白C。激活的PC称为活化蛋白C(acti-vated protein C，APC)，具有明显的抗凝血功能。
1.1 FV、FVⅢ与人体血凝系统 人体在生理状态下，血液促凝/抗凝系统保持平衡，但偏向抗凝以使人体血液循环通畅。而在血管损伤部位抗凝系统下调，促凝系统占优势以利于止血。产生于血管损伤部位的凝血酶可使FV、FⅧ激活，同时使血小板聚集活化;并使纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白网络。FVa、FⅧa结合于激活的血小板表面暴露的带负电的磷脂并作为FⅨa、FⅩa的受体位点。FⅨa和FⅩa是蛋白水解酶，由FⅦa-TF复合物水解相应的酶原而产生。FⅨa和FⅩa之间的膜结合物有效地激活FⅩ，从而构成“X复合酶”(Xase complex或tenase)复合物，从而产生凝血酶。人体的凝血反应是一个高效的酶促反应过程，失控的酶促反应将变成对人体的威胁。为了对付这一潜在的威胁，人体内凝血酶可作为一个天然抗凝系统-蛋白C(Protein C，PC)系统的启动因素，此时凝血酶从一个促凝因素变成一个依赖于内皮细胞的抗凝因素:在完整血管处产生的凝血酶结合于内皮膜蛋白-TM而激活蛋白C，TM是内皮细胞上凝血酶的受体，是凝血酶的强力调节剂和激活PC的辅助因子;活化的蛋白C(APC)通过有限的蛋白水解而灭活膜结合的FⅤa和FⅧa，这个反应可被蛋白S(PS)及未激活的FⅤ加强。
1.2 PC、PS与FⅤa灭活 PC为维生素K依赖性蛋白，与FⅦ，FⅨ及FⅩ有同源性，有共同的调节组成:(从N端开始)一个维生素K依赖性r-羧基谷氨酸(Gla)富有区:两个EGF样片段;一个丝氨酸蛋白酶(SP)调节子。血浆中大多数PC以双链形式存在，其轻链含Gla和EGF片段，重链含SP调节子。在凝血酶-TM复合物激活下，一个12aa的激活肽从重链N端释放，SP调节子转变成为一种活性酶，形成APC;APC高度特异地水解切割FⅤ及FⅧa上有限数目的肽键，但APC只特异地切割灭活膜结合型FⅤ及FⅧa，而对于循环中的FⅤ及FⅧa几乎无影响。未激活的FⅤ与具有同源性的FⅧ有共同的调节子排列:A 1 ，A 2 ，B 1 ，A 3 ，C 1 ，C 2 。凝血酶或FⅩa激活FⅤ后，切割三个肽键Arg709(A 2- B);Arg1545(B-A 3 )。活化的FⅤa由重链(A 1 +A 2 )和轻链(A 3 +C 1 +C 2 )组成，由Ca 2+ 依赖性肽链结合在一起。FⅧ的激活稍有不同:切割发生在A 1 -A 2 ，A 2 -B 1 ，B。APC对二者的切割均发生在A 1 -A 2 内，FⅤa为Arg506，Arg679;FⅧA为Arg336，Arg562。APC切割后，FⅤa和FⅧa失去抗凝活性。
APC单独抗凝活性极低，只有在蛋白S(PS)和FⅤ的辅助下其抗凝活性才可有效表达。目前，未激活的FⅤ作为APC辅助因子的作用机理尚不清楚 [2] 。PS也是维生素K依赖性血浆蛋白，与其它维生素依赖性促凝因子不同的是，它不是一个丝氨酸蛋白酶。PS作为APC辅助因子的机制尚不完全清楚，有人提出PS通过促进APC与磷脂表面的结合以及清除针对APC水解FⅤa，FⅧa的FⅤa、FⅨa依赖性的保护作用而发挥作用。最近有人提出PS的辅助作用是发生于FⅤa上的Arg306切割而不是Arg506切割，加之FⅩa对Arg506的保护作用，提示Arg306是凝血酶原复合物中调节FⅤa活性的关键位点。现在认为FⅤa在Arg506的迅速水解切割有助于Arg306的缓慢水解，Arg306的切割使得FⅤa的活性彻底丧失 [3] 。也有报道PS通过直接作用于FⅤa，FⅩa及磷脂表面而直接抑制凝血酶原酶的激活，从而发挥非APC依赖性的抗凝活性。
PC、PS的杂合子缺陷与静脉血栓发生有相关性:2%～5%血栓病与之有关。人群中的PC缺乏发生频率约为1/300，血栓患者中PC缺陷发生频率升高10倍。PS缺陷在人群中的发生频率仍未知，但家族研究提示PS缺陷相关的静脉血栓形成与PC缺陷相似。PC、PS纯合子缺陷常在新生儿时即表现为严重的、致死性的血栓形成，显示PC系统在调节血液凝固系统中的作用。
2 APCR发病机制
1994年，Bertina等 [4] 对APCR的纯合子与杂合子患者进行了基因分析，发现患者FⅤ基因第1691位核苷酸发生点突变(G→C)，因此生成一种Arg506→GLn置换的异常FⅤ分子(FⅤLeiden)。Corral等 [5] 报道FⅤLeidein突变携带者在正常人群的发生率为2%～7%。Dahlback [6] 报道为5%～10%。正常FⅤa分子的Arg506处为APC断裂之一，因而使FⅤa活性大大降低。Kalafatis等 [7] ，测定了人FⅤa的APC断裂点位于FⅤa重链Arg306，Arg506，Arg679处。没有Arg506断裂，Arg306也可以断裂使FⅤa灭活。Arg679处断裂时对FⅤa灭活不太重要 [8] 。正常FⅤa灭活通过两个同时进行的反应:快反应和慢反应。快反应通过先断裂Arg506，再断裂Arg306而使FⅤa灭活，慢反应通过Arg306断裂而实现。FⅤa Leiden灭活过程类似于正常FⅤa浓度灭活的慢反应。Nicolaes等 [9] 通过米氏方程分析证明，FⅤa和FⅤa Leiden对APC敏感性FⅤa有明显差异。低浓度FⅤa(0.3～5nmol/L)时为20倍，高浓度(280nmol/L)时为2.5倍 [10] (正常人FⅤa浓度为5～10mg/L)。由于FⅤ突变后，APC对其灭活很慢，且FⅤa Leiden凝血活性并未改变，但作为APC辅助因子的活性降低，因而导致血液高凝状态及血栓形成。
3 遗传性APCR与静脉血栓形成
近年来对静脉血栓形成分子机制的研究，发现了一些先天性血栓素质或先天性血栓倾向的病人，同时已观察到在40%的血栓病人中有家族史，但促使血栓发生的遗传性因素仍未完全澄清。APCR的发现使遗传性易血栓症的机理研究迈进了一大步。目前已出现了一大批APCR与静脉血栓危险因素增高的报道，但由于所选择病人的标准及人种的差异，所报告的数据有一定的差异 [11] 。总的来看，由于FⅤ突变引发的遗传性APCR的确是血栓发生的重要高危因素，现已公认由FⅤ突变引发的遗传性APCR是目前所见的静脉血栓形成最常见的遗传诱因，其杂合子患者血栓发生率较其他人高6～8倍，而纯合子的发生率则高30～140倍 [4] 。遗传性APCR的临床表现与其他抗凝因子(PC、PS、AT)的缺乏相似，深静脉血栓(DVT)是最常见的，而肺栓塞较少见。其临床发病率的个体差异较大，有些人可能是终身不 发生血栓，而有些人则从小反复发生严重的血栓，纯合子的发病几率高于杂合子;发生血栓的危险性终生存在，并随年龄的增长而增加。
4 获得性APCR
在西方人群中APCR发生率约为3%～5%，在家族性血栓形成患者中占20%～60%，FⅤa Leiden所致APCR高达95%。然而在非洲、南亚、东南亚及东亚，FⅤa Leiden极为罕见 [12] ，提示APCR的遗传学基因不一定仅为FⅤ突变，亦有获得性APCR的可能，即由于各种获得性因素影响，造成APC对FⅤa和FⅧa的降解功能降低，从而表现为APCR。近年的研究表明可能与下列因素存在关系:抗磷脂抗体 [13] ，作为一大类针对各种负电性磷脂-蛋白复合物的自身或同种抗体，与血栓形成密切相关。高同型半胱氨酸血症 [14] 与血管内皮细胞损伤、增强内皮细胞表面FⅤ的活性、降低PC活性等有关。妊娠 [15] 中由于生理性适应而使促凝系统效率增高、PC系统受到抑制，APC反应低于未妊娠妇女，若合并其他病理性抗凝物质，也有可能发生获得性APCR。狼疮性抗凝物质由于可干扰PC系统反应而被认为可能导致获得性APCR [16] ，这可能与急性血栓形成时相反应中促凝因子如FⅧ和纤维蛋白升高以及具有APC抑制性的a-抗胰蛋白酶升高有关。口服避孕药 [17] 、感染 [18] 等可能引起血浆铜蓝蛋白水升增高在APC灭活FⅤa和FⅧa时与之竞争受体，因而抑制了这两个凝血因子灭活，导致APCR。这方面的原因尚待深入研究。
综上所述，本人对活化蛋白C拮抗与静脉血栓形成从临床及分子生物学角度进行了探讨，加深了人们对静脉血栓的认识，对探索静脉血栓的预防及治疗有着重要的指导意义。
参考文献
1 Dahlback B.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90:1004-1008.
2 Williamson D，Brown K，Luddington R，et al.Blood，1998，91:1139-1140.
3 Aparicio Cand Dahlback B.Biochem J，1996，313:467.
4 Bertina RM Nature，1994，369:64-67.
5 Corral J.Thromb Haemost，1996，76(5):735-737.
6 Dahlback B.Thromb Haemost，1995，74(1):139-148.
7 Kalafatis M.J Biol Chem，1994，269:31869-31880.
8 Roshg J.J Biol Chem，1995，270:4053-4057.
9 Nicolaes GA.J Biol Chem，1995，270:21158-21166.
10 Kalafatis M.J Biol Chem，1995，270:4053-4057.
11 Chacg-hong HO.Thrombc.Res，1997，88:409-412.
12 Guglielmina P.Thromb Haemost，1997，77(2):329-331.
13 Bokarewa MI.Semin Hematol，1997，34(3):235-243.
14 D Angelo A.Haematologica，1997，82(2):211-219.
15 Cumming TR.Br J Haemetal，1995，90:725-727.
16 Visser Mc，Fernandez JA，Amersco SF，et al.Br J Haematol，1998，12:146.
17 Olivieriu.Br Haemetal，1995，91:465-470.
18 Green D.Thromb Haemost，1997，(suppl):316.
作者单位:300222天津市第四医院外科
(编辑秋 实), 百拇医药(赵长义)