“强力方”治疗实验性自身免疫性重症肌无力的机理研究
“强力方”是根据中医学“虚则补之，损则益之”的理论，经过本院长期临床实践总结的验方，其针对重症肌无力脾气虚损、脾虚及肾虚病机而设。“脾主肌肉”，“脾主四肢”，《古今医统大全》更概括为“脾主运动”，故组方以黄芪之势宏力专，并党参相辅，以培补脾气，强肌健力。同时反映了“补脾三宜”的学术思想，即宜甘温滋养;宜升举调畅;宜健脾运中以及“脾肾交济”的内涵。先期临床工作已证实了“强力方”对重症肌无力具有良好疗效，并与泼尼松组(50例)进行了临床疗效对比。强力方组(50例)临床痊愈16例，显效17例，总有效率92%，强力方组与泼尼松组临床疗效经统计学处理差异无显著性(χ 2 =0.862，P>0.05) [1] 。本实验主要观察以调补脾肾组方的“强力方”对实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)糖皮质激素受体(GR)的调节作用，胸腺并指状树突细胞(IDC)含量的影响，血清γ-干扰素(IFN-γ)、α-肿瘤坏死因子(TNF-α)的分泌以及乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)的变化和神经肌肉接头电生理检测，同时进行了药效验证。
1 材料与方法
1.1 实验材料 健康雌性SD大鼠45只(中科院动物所提供)，7～8周龄，体重100～120g。
1.2 主要试剂 (1)乙酰胆碱受体(AchR)于加利福尼亚电鳐发电器官中提取，由上海复旦大学乔健教授提供。(2)兔抗鼠酶标抗体，由第二军医大学沈茜教授惠赠。(3)福氏佐剂，Sigma公司产品。(4)[1、2、4 3 H]Dex(英国放免中心)，地塞米松(Sigma)。(5)抗S-100抗体，抗体及ABC试剂盒均为美国Vecter公司产品。
1.3 实验分组 将45只SD大鼠随机分成4组:正常对照组(N)5只;模型对照组(M)20只;泼尼松治疗组(P)10只;强力方治疗组(Q)10只。
1.4 模型复制及治疗方法 用50μg AchR和等体积完全福氏佐剂乳化后，于大鼠背部多点注射，2周后等剂量注射1次，以后每周注射25μg，共注射8次。各治疗组于免疫5周后，乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)阳性，肌电图低频重复电刺激有异常阳性改变时给药。泼尼松组，口饲泼尼松片50mg/(kg·d)×30天(上海长乐药厂，980901)。强力方组，口饲复方浸膏，200g/(kg·d)(生药)×30天(强力方主要成分为黄芪、党参、熟地、白术、升麻、仙灵脾、炙甘草)。
1.5 动物一般情况观察 实验首周及第5、9周分别称体重，观察大鼠在笼内活动情况，参考Lennon VA等的方法，将其程度分为4级:“-”无明显无力表现;“+”爬动无力或叫声减少;“++”前肢屈曲，躬屈低头，被捉时挣扎无力;“+++”严重的全身无力，没有叫声或爬不动，濒死状态。
1.6 负荷游泳实验 大鼠后肢系以7%体重的负荷后游泳，测定大鼠开始游泳至下沉时间。
1.7 AchR-Ab的测定 [2] 按涂来慧等报道的简化ELISA法测定AchR-Ab。
1.8 肌电图神经肌肉接头电生理检测 以巴比妥钠麻醉大鼠，以3次/s的频率重复刺激其坐骨神经的近端，观测10个动作电位的递减幅度，若其中有3个波幅递减15%即为阳性，并要求阳性者腹腔新斯的明试验后上述异常改变消失。
1.9 大鼠肝胞液、脑胞液GR的测定 [3] 将大鼠断头处死，按徐仁宝等报道的方法制备肝、脑胞液，然后按谭金兴等报道方法测定肝、脑胞液的GR。
1.10 大鼠胸腺S-100的染色 按照常规免疫组化ABC法进行。
1.11 大鼠IFN-γ、TNF-α含量测定 按常规ELISA方法测定血清中IFN-γ、TNF-α含量，据标准曲线计算实际含量。
1.12 统计学方法 采用配对或未配对的student's t-test。
2 结果
2.1 动物一般情况观测 自初次免疫后，模型对照组及各治疗组大鼠3周开始出现笼内懒动，行动缓慢，挣扎无力，叫声较低而短促，体重增长缓慢甚至少数有下降，毛发暗淡脱落，消瘦，易死亡。模型对照组麻醉时死亡7只，另1只第9周衰竭死亡见表1、表2。游泳实验显示模型组大鼠负荷游泳时间下降与正常组对照组差异有非常显著性(P<0.01)。
表1 不同时间体重情况 (略)
注:第9周时M组与其他各组比较，P<0.01
表2 不同时间症状变化 (略)
第9周时，正常组、模型组及强力方治疗组的大鼠负荷游泳时间分别为(18.3±4.17)min、(7.88±3.18)min、(18.50±3.89)min，后两组比较差异有非常显著性(P<0.01)，即经强力方治疗后负荷游泳时间显著延长。
2.2 AchR-Ab的变化 免疫第5周正常对照组与模型组AchR-Ab滴度差异有显著性，各组治疗后抗体滴度下降，与治疗前比较差异有显著性，见表3。
表3 不同时间AchR-Ab滴度(OD值)变化(略)
注:N组第5周与第9周比较，P>0.05;各治疗组治疗前后比较，P<0.05;第5周时N组与M组比较，P<0.05
2.3 肌电图变化 第5周时正常对照组与模型组比较肌电图递减幅度差异有显著性，各组经治疗后肌电图递减幅度明显好转，与治疗前差异有显著性，见表4。
表4 不同时间肌电图波幅的改变 (略)
注:第5周N组与M组比较，P<0.05;M组第5周与第9周比较，P>0.05;各治疗组治疗前后比较，P<0.05
2.4 胸腺IDC的分布与数量 在正常胸腺内，多数IDC位于皮髓质交界处，少数位于髓质，而在EAMG模型组IDC主要位于髓质，小部分位于皮髓质交界处，强力方和泼尼松治疗组IDC的分布类似正常组。模型组的IDC数量大于正常组和强力方与泼尼松治疗组，差异有显著性，见表5。
表5 第9周各组胸腺IDC的数量 (略)
注:各组与模型组比较，P<0.01
2.5 肝胞液、脑胞液GR的变化 模型组大鼠肝胞液和脑胞液GR均较正常对照组减少，强力方和泼尼松治疗组肝胞液GR明显增高，泼尼松组脑胞液GR也增多，强力方治疗组脑胞中GR变化不明显(P>0.05)，见表6。
表6 大鼠肝、脑胞液中糖皮质激素受体含量 (略)
注:N组与M组比较，P<0.01;各治疗组分别与模型组比较，P<0.01
2.6 血清IFN-γ、TNF-α含量的变化 第9周检测时模型组IFN-γ、TNF-α含量较正常对照组明显增高，P<0.05，强力方和泼尼松组IFN-γ、TNF-α含量比模型组明显降低，差异具有显著性，P<0.05，见表7。
表7 血清IFN-γ、TNF-α的变化(略)
3 讨论
本实验以AchR和福氏佐剂多次免疫SD大鼠，复制出实验性自身免疫性重症肌无力动物模型，动物的临床表现、AchR-Ab与肌电图波幅的异常变化等均与人的重症肌无力相似，且具有脾虚证的特征(倦怠嗜卧、乏力不耐负荷、体重增长迟缓甚至下降，毛发脱落无光泽，易便溏)。大鼠的负荷游泳实验及麻醉时易死亡说明EAMG模型动物的肌力与耐受性下降。
本实验证实“强力方”取得治疗效果的同时，伴随着EAMG体内AchR-Ab滴度的降低，神经肌肉接头电生理异常得到显著改善。提示“强力方”有抑制AchR-Ab产生，恢复骨骼肌运动终板乙酰胆碱受体功能的作用。
临床研究表明，重症肌无力患者糖皮质激素受体减少，与本实验结果一致。糖皮质激素(GCS)具有很强的抗炎和免疫调节作用，GCS进入细胞后，与GR受体结合转移至胞核，再与特异的DNA序列结合，从而增强或抑制(更多的是抑制)靶基因的产生，例如白介素类等。GR减少，GCS不能发挥免疫抑制作用，产生免疫紊乱，免疫系统对自身乙酰胆碱受体致敏，产生AchR-Ab。实验发现“强力方”能使EAMG大鼠肝胞液中GR上调，说明“强力方”治疗EAMG主要机制是调节GR的数量，上调受体的表达。关于中药调节GR表达的详细机制将是值得深入研究的课题。
IDC属于树突状细胞系统，它的生物学功能:向T细胞递呈抗原，参与T细胞亚群的分化和诱导免疫耐受以及参与调节免疫应答。它能高水平的表达MHC分子、协同刺激分子、黏附分子并分泌多种趋化因子和细胞因子，并可直接活化未致敏的T细胞，是T细胞免疫中重要的辅助细胞。本实验研究发现EAMG模型动物胸腺组织中特异的IDC数量明显增多，与Bofill等的观点一致，因此认为与重症肌无力相关的特异的IDC在重症肌无力发病中起重要作用。而“强力方”可以调节胸腺组织中IDC分化，使EAMG的胸腺IDC数量恢复到正常水平，分布接近常态。
细胞因子在自身免疫性疾病中的作用已成为近年来研究的热点。T辅助细胞(Th)等产生的细胞因子调节着AchR-Ab的产生。IFN-γ作为一个直接的B细胞成熟刺激因子，能促使非免疫球蛋白分泌细胞转化为免疫球蛋白分泌细胞，在EAMG发病过程中的作用还包括诱导抗原递呈细胞的MHC表达，巨噬细胞活化及调节其他细胞因子TNF-α和IL-1的分泌。局部表达的IFN-γ可激发对运动终板的体液免疫反应，从而启动MG发病。重症肌无力病人血中同时含有较多表达TNF-α、TNF-β、mRNA单个核细胞，这些细胞对AchR具有反应性。本实验发现EAMG大鼠血清中IFN-γ、TNF-α的表达增高，经“强力方”治疗后含量均下调，证实“强力方”治疗EAMG的相关机制包括调节细胞因子的分泌。
“强力方”实验研究结论:“强力方”疗效得到EAMG模型论证，其治疗重症肌无力的机制是对机体免疫多环节、多靶点的整体调节，即通过调节胸腺组织中特异的抗原递呈细胞，作用于致病起始环节;通过调节细胞因子的分泌，调控重症肌无力的体液免疫;通过抑制AchR-Ab的产生，达到恢复乙酰胆碱受体功能的目的;通过调节细胞内糖皮质激素受体的表达，影响靶基因的产生、从而参与免疫内分泌环节的调控。
参考文献
1 涂来慧，张仁琴，沈茜，等.简化ELISA在检测重症肌无力抗烟碱 型乙酰胆碱受体抗体的临床应用.中国免疫学杂志，1993，3:243.
2 谭金兴，徐仁宝.糖皮质激素受体交换测定方法的改进.生物化学与生物物理学进展，1987，4:56-58.
3 蒋建明，涂来慧，张仁琴，等.重症肌无力患者白细胞糖皮质激素受体检测及其临床意义.中华神经精神杂志，1993，26(6):341-343.
(编辑小 南)
* 基金项目:上海市医学领先学科科研课题(编号:992040)
作者单位:200082上海市中西医结合医院重症肌无力专科
200043上海第二军医大学病理教研室, 百拇医药(蒋方建 臧海生 徐冬波 陈钢 谭金兴)
1 材料与方法
1.1 实验材料 健康雌性SD大鼠45只(中科院动物所提供)，7～8周龄，体重100～120g。
1.2 主要试剂 (1)乙酰胆碱受体(AchR)于加利福尼亚电鳐发电器官中提取，由上海复旦大学乔健教授提供。(2)兔抗鼠酶标抗体，由第二军医大学沈茜教授惠赠。(3)福氏佐剂，Sigma公司产品。(4)[1、2、4 3 H]Dex(英国放免中心)，地塞米松(Sigma)。(5)抗S-100抗体，抗体及ABC试剂盒均为美国Vecter公司产品。
1.3 实验分组 将45只SD大鼠随机分成4组:正常对照组(N)5只;模型对照组(M)20只;泼尼松治疗组(P)10只;强力方治疗组(Q)10只。
1.4 模型复制及治疗方法 用50μg AchR和等体积完全福氏佐剂乳化后，于大鼠背部多点注射，2周后等剂量注射1次，以后每周注射25μg，共注射8次。各治疗组于免疫5周后，乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)阳性，肌电图低频重复电刺激有异常阳性改变时给药。泼尼松组，口饲泼尼松片50mg/(kg·d)×30天(上海长乐药厂，980901)。强力方组，口饲复方浸膏，200g/(kg·d)(生药)×30天(强力方主要成分为黄芪、党参、熟地、白术、升麻、仙灵脾、炙甘草)。
1.5 动物一般情况观察 实验首周及第5、9周分别称体重，观察大鼠在笼内活动情况，参考Lennon VA等的方法，将其程度分为4级:“-”无明显无力表现;“+”爬动无力或叫声减少;“++”前肢屈曲，躬屈低头，被捉时挣扎无力;“+++”严重的全身无力，没有叫声或爬不动，濒死状态。
1.6 负荷游泳实验 大鼠后肢系以7%体重的负荷后游泳，测定大鼠开始游泳至下沉时间。
1.7 AchR-Ab的测定 [2] 按涂来慧等报道的简化ELISA法测定AchR-Ab。
1.8 肌电图神经肌肉接头电生理检测 以巴比妥钠麻醉大鼠，以3次/s的频率重复刺激其坐骨神经的近端，观测10个动作电位的递减幅度，若其中有3个波幅递减15%即为阳性，并要求阳性者腹腔新斯的明试验后上述异常改变消失。
1.9 大鼠肝胞液、脑胞液GR的测定 [3] 将大鼠断头处死，按徐仁宝等报道的方法制备肝、脑胞液，然后按谭金兴等报道方法测定肝、脑胞液的GR。
1.10 大鼠胸腺S-100的染色 按照常规免疫组化ABC法进行。
1.11 大鼠IFN-γ、TNF-α含量测定 按常规ELISA方法测定血清中IFN-γ、TNF-α含量，据标准曲线计算实际含量。
1.12 统计学方法 采用配对或未配对的student's t-test。
2 结果
2.1 动物一般情况观测 自初次免疫后，模型对照组及各治疗组大鼠3周开始出现笼内懒动，行动缓慢，挣扎无力，叫声较低而短促，体重增长缓慢甚至少数有下降，毛发暗淡脱落，消瘦，易死亡。模型对照组麻醉时死亡7只，另1只第9周衰竭死亡见表1、表2。游泳实验显示模型组大鼠负荷游泳时间下降与正常组对照组差异有非常显著性(P<0.01)。
表1 不同时间体重情况 (略)
注:第9周时M组与其他各组比较，P<0.01
表2 不同时间症状变化 (略)
第9周时，正常组、模型组及强力方治疗组的大鼠负荷游泳时间分别为(18.3±4.17)min、(7.88±3.18)min、(18.50±3.89)min，后两组比较差异有非常显著性(P<0.01)，即经强力方治疗后负荷游泳时间显著延长。
2.2 AchR-Ab的变化 免疫第5周正常对照组与模型组AchR-Ab滴度差异有显著性，各组治疗后抗体滴度下降，与治疗前比较差异有显著性，见表3。
表3 不同时间AchR-Ab滴度(OD值)变化(略)
注:N组第5周与第9周比较，P>0.05;各治疗组治疗前后比较，P<0.05;第5周时N组与M组比较，P<0.05
2.3 肌电图变化 第5周时正常对照组与模型组比较肌电图递减幅度差异有显著性，各组经治疗后肌电图递减幅度明显好转，与治疗前差异有显著性，见表4。
表4 不同时间肌电图波幅的改变 (略)
注:第5周N组与M组比较，P<0.05;M组第5周与第9周比较，P>0.05;各治疗组治疗前后比较，P<0.05
2.4 胸腺IDC的分布与数量 在正常胸腺内，多数IDC位于皮髓质交界处，少数位于髓质，而在EAMG模型组IDC主要位于髓质，小部分位于皮髓质交界处，强力方和泼尼松治疗组IDC的分布类似正常组。模型组的IDC数量大于正常组和强力方与泼尼松治疗组，差异有显著性，见表5。
表5 第9周各组胸腺IDC的数量 (略)
注:各组与模型组比较，P<0.01
2.5 肝胞液、脑胞液GR的变化 模型组大鼠肝胞液和脑胞液GR均较正常对照组减少，强力方和泼尼松治疗组肝胞液GR明显增高，泼尼松组脑胞液GR也增多，强力方治疗组脑胞中GR变化不明显(P>0.05)，见表6。
表6 大鼠肝、脑胞液中糖皮质激素受体含量 (略)
注:N组与M组比较，P<0.01;各治疗组分别与模型组比较，P<0.01
2.6 血清IFN-γ、TNF-α含量的变化 第9周检测时模型组IFN-γ、TNF-α含量较正常对照组明显增高，P<0.05，强力方和泼尼松组IFN-γ、TNF-α含量比模型组明显降低，差异具有显著性，P<0.05，见表7。
表7 血清IFN-γ、TNF-α的变化(略)
3 讨论
本实验以AchR和福氏佐剂多次免疫SD大鼠，复制出实验性自身免疫性重症肌无力动物模型，动物的临床表现、AchR-Ab与肌电图波幅的异常变化等均与人的重症肌无力相似，且具有脾虚证的特征(倦怠嗜卧、乏力不耐负荷、体重增长迟缓甚至下降，毛发脱落无光泽，易便溏)。大鼠的负荷游泳实验及麻醉时易死亡说明EAMG模型动物的肌力与耐受性下降。
本实验证实“强力方”取得治疗效果的同时，伴随着EAMG体内AchR-Ab滴度的降低，神经肌肉接头电生理异常得到显著改善。提示“强力方”有抑制AchR-Ab产生，恢复骨骼肌运动终板乙酰胆碱受体功能的作用。
临床研究表明，重症肌无力患者糖皮质激素受体减少，与本实验结果一致。糖皮质激素(GCS)具有很强的抗炎和免疫调节作用，GCS进入细胞后，与GR受体结合转移至胞核，再与特异的DNA序列结合，从而增强或抑制(更多的是抑制)靶基因的产生，例如白介素类等。GR减少，GCS不能发挥免疫抑制作用，产生免疫紊乱，免疫系统对自身乙酰胆碱受体致敏，产生AchR-Ab。实验发现“强力方”能使EAMG大鼠肝胞液中GR上调，说明“强力方”治疗EAMG主要机制是调节GR的数量，上调受体的表达。关于中药调节GR表达的详细机制将是值得深入研究的课题。
IDC属于树突状细胞系统，它的生物学功能:向T细胞递呈抗原，参与T细胞亚群的分化和诱导免疫耐受以及参与调节免疫应答。它能高水平的表达MHC分子、协同刺激分子、黏附分子并分泌多种趋化因子和细胞因子，并可直接活化未致敏的T细胞，是T细胞免疫中重要的辅助细胞。本实验研究发现EAMG模型动物胸腺组织中特异的IDC数量明显增多，与Bofill等的观点一致，因此认为与重症肌无力相关的特异的IDC在重症肌无力发病中起重要作用。而“强力方”可以调节胸腺组织中IDC分化，使EAMG的胸腺IDC数量恢复到正常水平，分布接近常态。
细胞因子在自身免疫性疾病中的作用已成为近年来研究的热点。T辅助细胞(Th)等产生的细胞因子调节着AchR-Ab的产生。IFN-γ作为一个直接的B细胞成熟刺激因子，能促使非免疫球蛋白分泌细胞转化为免疫球蛋白分泌细胞，在EAMG发病过程中的作用还包括诱导抗原递呈细胞的MHC表达，巨噬细胞活化及调节其他细胞因子TNF-α和IL-1的分泌。局部表达的IFN-γ可激发对运动终板的体液免疫反应，从而启动MG发病。重症肌无力病人血中同时含有较多表达TNF-α、TNF-β、mRNA单个核细胞，这些细胞对AchR具有反应性。本实验发现EAMG大鼠血清中IFN-γ、TNF-α的表达增高，经“强力方”治疗后含量均下调，证实“强力方”治疗EAMG的相关机制包括调节细胞因子的分泌。
“强力方”实验研究结论:“强力方”疗效得到EAMG模型论证，其治疗重症肌无力的机制是对机体免疫多环节、多靶点的整体调节，即通过调节胸腺组织中特异的抗原递呈细胞，作用于致病起始环节;通过调节细胞因子的分泌，调控重症肌无力的体液免疫;通过抑制AchR-Ab的产生，达到恢复乙酰胆碱受体功能的目的;通过调节细胞内糖皮质激素受体的表达，影响靶基因的产生、从而参与免疫内分泌环节的调控。
参考文献
1 涂来慧，张仁琴，沈茜，等.简化ELISA在检测重症肌无力抗烟碱 型乙酰胆碱受体抗体的临床应用.中国免疫学杂志，1993，3:243.
2 谭金兴，徐仁宝.糖皮质激素受体交换测定方法的改进.生物化学与生物物理学进展，1987，4:56-58.
3 蒋建明，涂来慧，张仁琴，等.重症肌无力患者白细胞糖皮质激素受体检测及其临床意义.中华神经精神杂志，1993，26(6):341-343.
(编辑小 南)
* 基金项目:上海市医学领先学科科研课题(编号:992040)
作者单位:200082上海市中西医结合医院重症肌无力专科
200043上海第二军医大学病理教研室, 百拇医药(蒋方建 臧海生 徐冬波 陈钢 谭金兴)