头孢噻肟钠细菌内毒素检查方法的研究
【摘要】 目的 建立头孢噻肟钠的细菌内毒素检查方法。 方法 参照中国药典2000年版细菌内毒素检查法进行试验。 结果 头孢噻肟钠经2倍稀释，进行细菌内毒素检查，没有出现干扰作用。 结论 头孢噻肟钠的热原检查可用细菌内毒素检测法。
【关键词】 头孢噻肟钠 细菌内毒素 干扰试验
Study on bacdterial endotoxin test for cefotaxim sodium
Lu Jinghua，Wang Yajuan，Cui Shengzuo
Department of Pharmaceutical Chemistry，Jinzhou Medical University，Jinzhou121001.
【Abstract】 Objective To set up a method of bacterial endotoxin test for Cefotaxime Sodium.Methods Ac-cording to bacterial endotoxin test in China pharmacopoeia(second part，2000)we did these experiment.Results Ce-fotaxime sodium in2-fold dilution had no interference to bacterial endotoxin.Conclusion Bacterial endotoxin testcould be used for pyrogen test of cefotaxim sodium.
【Key words】 getotaxime sodium bacterital endotoxins inteference experiment
头孢噻肟钠属于β-内酰胺类抗生素，临床上主要用于治疗革兰氏阴性菌、绿脓杆菌引起的呼吸系统、泌尿系统的感染。中国药典2000年版头孢噻肟钠的热原检查仍采用家兔法，为了探讨其细菌内毒素检查方法，本文参照中国药典的要求;通过干扰试验，确立了头孢噻肟钠的细菌内毒素检查方法。
1 仪器与试剂
鲎试剂(TAL，批号:0312081，灵敏度:0.125EU/ml，规格:0.1ml/支，湛江安度斯生物有限公司);细菌内毒素检查用水(BET水，批号:0403080，规格:5ml/支，湛江安度斯生物有限公司)，细菌内毒素工作标准品(CS8，批号:0401170，规格:12EU/支，湛江安度斯生物有限公司);头孢噻肟钠(供试品，批号:K040433、K040409、K210220，深圳九新制药厂);BET-40细菌内毒素检查仪;ZH-2自动旋涡混合品。其余试验材料均经250℃干燥1h。
2 方法与结果
2.1 TAL灵敏度的复核 按中国药典附录 [1] 细菌内毒素检查法进行复核，结果见表1，表明标示灵敏为0.125EU/ml的TAL符合规定。
表1 鲎试剂灵敏度的复核 内毒素浓度(略)
2.2 细菌内毒素限值(L)的确定 [2] 按公式L=K/M，式中K为规定给药途径，即人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5.0EU/(kg·h);M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/(kg·hr)、mg/(kg·hr)、u/(kg·hr)表示，人均体重按60kg计算，注射时间小于1h，按1h计算。参考药师手册 [3] ，M=100mg/(kg·hr)计算内毒素限值L=0.05EU/mg。
2.3 供试品的干扰预试验
2.3.1 内毒素及供试品的稀释 用BET水将CSE稀释成0.25，0.125，0.06，0.03EU/ml浓度的内毒素备用，根据最大有限稀释倍数MVD=CL/λ，L为提供试品的细菌内毒素限值，λ为本次试验选用的鲎试剂的灵敏度;C为供试品溶液的浓度5mg/ml，由此计算得最大有效稀释倍数MVD为2倍。对于灵敏度0.25，0.125，0.06，0.03EU/ml的鲎试剂，头孢噻肟钠选择稀释倍数分别为1，2，4，8倍，用BET水将1批供试品(批号K040433)稀释成以上4个浓度备用。
2.3.2 干扰预试验 取10支灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂，其中5支做供试品阴性对照(NPC)系列反应;另外5支做供试品阳性对照(PPC)系列反应。试验结果见表2。表明供试品阴性对照液系列反应全部阴性。供试品阳性对照液在供试品稀释倍数<2时为阴性，≥2时为阳性。表明供试品在较高浓度时对细菌内毒素有抑制干扰作用，而供试品至少2倍稀释并选用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂则无干扰作用。
表2 头孢噻肟钠预试剂结果 供试品稀释(略)
2.4 供试品干扰试验 用细菌内毒素检查用水和稀释2倍的三批供试品分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品0.25EU/ml，0.125EU/ml，0.06EU/ml，0.03EU/ml四种浓度的内毒素溶液，每一浓度平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和供试品溶液各2支作为水溶液阴性对照管和供试品阴性对照管，分别对K040433、K040409、K210220三批样品做干扰试验，稀释步骤如下，将效价为12EU/支的细菌内毒素工作标准品用砂轮在瓶颈上部划痕，然后启开，加细菌内毒素检查用水1.2ml稀释成10EU/ml溶液结果见表3。表明λc=λs=0.125EU/ml，即λc，λs都在0.5λ～2λ范围内，表明供试品经2倍稀释，使用灵敏度0.125EU/ml的鲎试剂对细菌内毒素无干扰，进一步验证了预实验的结果。
2.5 细菌内毒素检查 根据中国药典细菌内毒素检查法，将3批供试品2倍稀释，与0.125EU/ml鲎试剂进行细菌内毒素检测，并同时进行3批供试品的家兔热原对比试验，均符合药典对其有效性的规定。
3 讨论
3.1 干扰预试验的目的是评价供试品浓度对鲎试剂与细菌内毒素凝集反应的干扰程度，以便初步筛选出其干扰试验的起始浓度。这样既可以避免干扰试验的盲目性，同时又节省了大量的时间和鲎试剂，降低了成本，提高了工作效率。
表3 供试品干扰试验结果(略)
3.2 通过试验表明，头孢噻肟钠热原检查可用细菌内毒素检查法代替传统的家兔法，检查时只要将其至少2倍稀释，选择相应灵敏度的鲎试剂，即可进行。该法与传统的家兔热原法相比，具有操作简便快捷，结果准确，检测灵敏度高，实用性强等优点。
参考文献
1 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(二部)，2000年版.北京:化学工业出版社，2000，附录86.
2 夏振民.药品细菌内毒素检查的限值.药物分析杂志，1995，15(3):54.
3 裘学友，孙定人，喻维新.药师手册，北京:人民军医出版社，1999，323.
(编辑子 萱)
作者单位:121001辽宁省锦州医学院药学院
116021辽宁省大连美罗大药厂, 百拇医药(卢静华 王亚娟 崔升佐)
【关键词】 头孢噻肟钠 细菌内毒素 干扰试验
Study on bacdterial endotoxin test for cefotaxim sodium
Lu Jinghua，Wang Yajuan，Cui Shengzuo
Department of Pharmaceutical Chemistry，Jinzhou Medical University，Jinzhou121001.
【Abstract】 Objective To set up a method of bacterial endotoxin test for Cefotaxime Sodium.Methods Ac-cording to bacterial endotoxin test in China pharmacopoeia(second part，2000)we did these experiment.Results Ce-fotaxime sodium in2-fold dilution had no interference to bacterial endotoxin.Conclusion Bacterial endotoxin testcould be used for pyrogen test of cefotaxim sodium.
【Key words】 getotaxime sodium bacterital endotoxins inteference experiment
头孢噻肟钠属于β-内酰胺类抗生素，临床上主要用于治疗革兰氏阴性菌、绿脓杆菌引起的呼吸系统、泌尿系统的感染。中国药典2000年版头孢噻肟钠的热原检查仍采用家兔法，为了探讨其细菌内毒素检查方法，本文参照中国药典的要求;通过干扰试验，确立了头孢噻肟钠的细菌内毒素检查方法。
1 仪器与试剂
鲎试剂(TAL，批号:0312081，灵敏度:0.125EU/ml，规格:0.1ml/支，湛江安度斯生物有限公司);细菌内毒素检查用水(BET水，批号:0403080，规格:5ml/支，湛江安度斯生物有限公司)，细菌内毒素工作标准品(CS8，批号:0401170，规格:12EU/支，湛江安度斯生物有限公司);头孢噻肟钠(供试品，批号:K040433、K040409、K210220，深圳九新制药厂);BET-40细菌内毒素检查仪;ZH-2自动旋涡混合品。其余试验材料均经250℃干燥1h。
2 方法与结果
2.1 TAL灵敏度的复核 按中国药典附录 [1] 细菌内毒素检查法进行复核，结果见表1，表明标示灵敏为0.125EU/ml的TAL符合规定。
表1 鲎试剂灵敏度的复核 内毒素浓度(略)
2.2 细菌内毒素限值(L)的确定 [2] 按公式L=K/M，式中K为规定给药途径，即人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5.0EU/(kg·h);M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/(kg·hr)、mg/(kg·hr)、u/(kg·hr)表示，人均体重按60kg计算，注射时间小于1h，按1h计算。参考药师手册 [3] ，M=100mg/(kg·hr)计算内毒素限值L=0.05EU/mg。
2.3 供试品的干扰预试验
2.3.1 内毒素及供试品的稀释 用BET水将CSE稀释成0.25，0.125，0.06，0.03EU/ml浓度的内毒素备用，根据最大有限稀释倍数MVD=CL/λ，L为提供试品的细菌内毒素限值，λ为本次试验选用的鲎试剂的灵敏度;C为供试品溶液的浓度5mg/ml，由此计算得最大有效稀释倍数MVD为2倍。对于灵敏度0.25，0.125，0.06，0.03EU/ml的鲎试剂，头孢噻肟钠选择稀释倍数分别为1，2，4，8倍，用BET水将1批供试品(批号K040433)稀释成以上4个浓度备用。
2.3.2 干扰预试验 取10支灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂，其中5支做供试品阴性对照(NPC)系列反应;另外5支做供试品阳性对照(PPC)系列反应。试验结果见表2。表明供试品阴性对照液系列反应全部阴性。供试品阳性对照液在供试品稀释倍数<2时为阴性，≥2时为阳性。表明供试品在较高浓度时对细菌内毒素有抑制干扰作用，而供试品至少2倍稀释并选用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂则无干扰作用。
表2 头孢噻肟钠预试剂结果 供试品稀释(略)
2.4 供试品干扰试验 用细菌内毒素检查用水和稀释2倍的三批供试品分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品0.25EU/ml，0.125EU/ml，0.06EU/ml，0.03EU/ml四种浓度的内毒素溶液，每一浓度平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和供试品溶液各2支作为水溶液阴性对照管和供试品阴性对照管，分别对K040433、K040409、K210220三批样品做干扰试验，稀释步骤如下，将效价为12EU/支的细菌内毒素工作标准品用砂轮在瓶颈上部划痕，然后启开，加细菌内毒素检查用水1.2ml稀释成10EU/ml溶液结果见表3。表明λc=λs=0.125EU/ml，即λc，λs都在0.5λ～2λ范围内，表明供试品经2倍稀释，使用灵敏度0.125EU/ml的鲎试剂对细菌内毒素无干扰，进一步验证了预实验的结果。
2.5 细菌内毒素检查 根据中国药典细菌内毒素检查法，将3批供试品2倍稀释，与0.125EU/ml鲎试剂进行细菌内毒素检测，并同时进行3批供试品的家兔热原对比试验，均符合药典对其有效性的规定。
3 讨论
3.1 干扰预试验的目的是评价供试品浓度对鲎试剂与细菌内毒素凝集反应的干扰程度，以便初步筛选出其干扰试验的起始浓度。这样既可以避免干扰试验的盲目性，同时又节省了大量的时间和鲎试剂，降低了成本，提高了工作效率。
表3 供试品干扰试验结果(略)
3.2 通过试验表明，头孢噻肟钠热原检查可用细菌内毒素检查法代替传统的家兔法，检查时只要将其至少2倍稀释，选择相应灵敏度的鲎试剂，即可进行。该法与传统的家兔热原法相比，具有操作简便快捷，结果准确，检测灵敏度高，实用性强等优点。
参考文献
1 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(二部)，2000年版.北京:化学工业出版社，2000，附录86.
2 夏振民.药品细菌内毒素检查的限值.药物分析杂志，1995，15(3):54.
3 裘学友，孙定人，喻维新.药师手册，北京:人民军医出版社，1999，323.
(编辑子 萱)
作者单位:121001辽宁省锦州医学院药学院
116021辽宁省大连美罗大药厂, 百拇医药(卢静华 王亚娟 崔升佐)