清脂健肝方对酒精性肝损伤的防治作用
戴宁, 大连医科大学第一附属医院消化内科 辽宁省大连市 116011
曾民德,李继强,邱德凯,上海市消化疾病研究所 上海市 200001
通讯作者:戴宁,116011, 辽宁省大连市西岗区中山路222号,大连医科大学第一附属医院消化内科. daining@dl.cn
电话: 0411-83635963-3163
收稿日期:2005-02-28 接受日期:2005-04-01
摘要目的:从细胞学水平研究自研中药清脂健肝方对酒精性肝损伤的防治作用.
, 百拇医药
方法:原位灌流法分离大鼠肝细胞，建立酒精性肝损伤的体外培养模型，分别加入不同浓度中药原液，观察其对酒精性肝损伤的防治作用.
结果:不同浓度的中药原液均可显著抑制肝细胞ALT、AST的漏出;减少肝细胞3H-甘油掺入率;降低肝细胞脂质过氧化产物丙二醛的升高，具有稳定肝细胞膜的作用，并呈现出量效关系.
结论:从细胞学水平进一步证实，清脂健肝方能提高肝细胞的抗氧化力，可对酒精性肝病起防治作用.
戴宁,曾民德, 李继强,邱德凯.清脂健肝方对酒精性肝损伤的防治作用.世界华人消化杂志 2005;13(12):1457-14591 正常肝细胞 (×30).
, http://www.100md.com
2.2 药物对培养液ALT、AST活性的影响 原代培养大鼠肝细胞加入80mmol/L乙醇24h后，培养液中ALT、AST的活性比正常对照组显著升高(P<0.01)，而各剂量组的中药原液均可显著抑制培养液中ALT、AST的升高(表1).
2.3 药物对3H-甘油掺入率的影响加入80mmol/L乙醇24h后，肝细胞3H-甘油掺入率比正常组显著升高(P<0.01)，而不同剂量的中药原液均可减少3H-甘油掺入率，其中10mg和30 mg剂量组的效果相同，而90mg剂量组效果较好(表1).
2.4药物对肝细胞MDA变化的影响 加入80 mmol/L乙醇24 h后，肝细胞MDA的含量比正常组显著升高(P<0.01)，而不同剂量的中药原液均可减少MDA的含量，其中10 mg和30 mg剂量组的效果相同，而以90mg剂量组的效果较好(表1).
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2.5细胞膜流动性 加入80 mmol/L乙醇24 h后，荧光偏振度显著升高(P<0.01)，细胞膜的流动性降低，而不同剂量的中药原液均可使荧光偏振度减少，以90mg剂量组效果较好(P>0.05).
表1 中药对ALT、AST活性及3H-甘油掺入率、MDA变化的影响(mean±SD)
, 百拇医药
aP<0.05，bP<0.01 vs正常对照组.
3 讨论研究证实，乙醇及其代谢物乙醛对肝细胞有直接的毒性作用，可使肝细胞的代谢活性下降[4-5].我们的研究结果也表明，在原代培养的大鼠肝细胞内加入80mmol/L乙醇(相当于肝脏每天代谢乙醇60g)可使反映肝细胞损害的酶学指标ALT、AST的含量显著升高，AST升高明显高于ALT的升高，不同浓度的药物原液均可显著抑制肝细胞ALT、AST的漏出.
体外实验证实，乙醇可以使原代培养肝细胞TG的合成增加，其机制是增加合成TG的底物FFA的吸收而降低极低密度脂蛋白(VLDL)的分泌.甘油是合成TG的另一重要底物.甘油可以合成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油一方面可以直接合成甘油三酸酯，另一方面，脂肪酸的氧化或脂化取决于线粒体外膜上肉碱乙酰转移酶或磷酸甘油乙酰转移酶之间的活性，3-磷酸甘油浓度的升高可使酒精的氧化还原反应向脂肪酸的酯化方向发展而不是向氧化的方向发展[6].我们的研究结果表明，在原代培养的大鼠肝细胞内加入80mmol/L乙醇培养24h，3H-甘油掺入率明显增加，相应细胞内甘油三脂的合成增加，而不同浓度的药物原液均可降低3H-甘油的掺入率，这说明药物可直接阻止肝细胞脂质的合成.
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体内外研究证实，脂质过氧化反应在酒精性肝损伤的发病机制中起重要作用[7-10]，而抗氧化治疗则能有效防治酒精性肝损伤[11-13].乙醇可使原代培养肝细胞产生强烈的氧应激，而使细胞内的抗氧化剂含量如谷胱甘肽(GSH)下降[14]，氧化与抗氧化机制的失衡使有害自由基产生增多，细胞膜中富含多不饱和脂肪酸，极易受自由基攻击，发生脂质过氧化反应，脂质过氧化终产物MDA能与膜脂质、膜蛋白交联而降低细胞膜的流动性[5，9，15].我们的结果显示，加入80mmol/L乙醇后，反映脂质过氧化反应的可靠指标MDA的含量显著升高，同时细胞膜的流动性降低，而不同浓度的药物原液均可使MDA的含量下降，恢复细胞膜的流动性，并呈现量效关系.
我们从细胞学水平进一步证实，自研的复方中药既有直接保护肝细胞的作用，也可以减少肝细胞的脂质合成，又具有抑制脂质过氧化反应从而起到稳定肝细胞膜的作用，其作用机制是提高了肝细胞的抗氧化能力，阻止了乙醇及其代谢物对肝细胞的直接毒性作用.
, 百拇医药
4 参考文献1 鲁晓岚,陶明, 罗金燕, 耿燕,赵平, 赵红莉. 西安酒精性肝病流行病学.世界华人消化杂志 2003;11:719-722
2 厉有名, 陈卫星, 虞朝辉,乐敏, 刘有恃, 徐根云,季峰, 李舒丹. 浙江省酒精性肝病流行病学调查概况.
中华肝脏病杂志 2003;11:647-649
3 戴宁, 曾民德, 彭延申,李继强, 邱德凯, 陆伦根.复方中药对酒精性脂肪肝肝细胞色素P450ⅡE1表达的影响.
中华肝脏病杂志 2003;11:657-659
4 Henzel K, Thorborg C, Hofmann M, Zimmer G, Leuschner U. Toxicity ofethanol and acetaldehyde in hepatocytes
, 百拇医药
treatedwith ursodeoxycholic or tauroursodeoxycholic acid. Biochim Biophys Acta 2004;1644:37-45
5 Sergent O, Pereira M, Belhomme C, Chevanne M, Huc L,Lagadic-Gossman D. Role for membrane fluidity in
ethanol-inducedoxidative stress of primary rat hepatocytes. J Pharmacol Exp Ther 2005;313:104-111
6 Lamb RG, Koch JC, Snyder JW, Huband SM, Bush SR. An in vitro modelof ethanol-dependent liver cell injury.
, 百拇医药
Hepatology 1994;19:174-182
7 Stewart SF, Vidali M, Day CP, Albano E, Jones DE. Oxidative stressas a trigger for cellular immune responses in
patientswith alcoholic liver disease. Hepatology 2004;39:197-203
8 易辉, 王新,苗继延,樊代明.环氧合酶-2对酒精性肝损伤大鼠氧化/抗氧化的作用.
世界华人消化杂志 2004;12:1934-1936
9 Castilla R, Gonzalez R, Fouad D, Fraga E, Muntane J. Dual effect ofethanol on cell death in primary culture of human
, http://www.100md.com
andrat hepatocytes. Alcohol Alcohol 2004;39:290-296
10 Nieto N, Friedman SL, Cederbaum AI. Stimulation and proliferationof primary rat hepatic stellate cells by
cytochrome P450 2E1-derived reactiveoxygen species. Hepatology 2002;35:62-73
11 高健, 吴显才, 李孝生,沈鼎明. 还原型谷胱甘肽治疗酒精性肝病的研究.世界华人消化杂志 2002;10:809-811
12 崔巍, 苏小林, 傅宝玉.抗纤复方1号抗酒精性肝病的实验研究.世界华人消化杂志 2002;10:1245-1249
, http://www.100md.com
13 Wheeler MD, Nakagami M, Bradford BU, Uesugi T, Mason RP, Connor HD,Dikalova A, Kadiiska M, Thurman RG.
Overexpression of manganesesuperoxide dismutase prevents alcohol-induced injury in the rat.
J Biol Chem 2001;276:36664-36672
14 Cardin R, D,Errico A, FiorentinoM, Cecchetto A, Naccarato R, Farinati F. Hepatocyte proliferation andapoptosis in
relation to oxidativedamage in alcohol-related liver disease. Alcohol Alcohol 2002;37:43-48
15 Abraham P, Wilfred G, Ramakrishna B. Oxidative damage to thehepatocellular proteins after chronic ethanol intake
in the rat. Clin Chim Acta 2002;325:117-125
编辑 徐协群 审读 张海宁, 百拇医药( 戴 宁, 曾民德, 李继强, 邱德凯)
曾民德,李继强,邱德凯,上海市消化疾病研究所 上海市 200001
通讯作者:戴宁,116011, 辽宁省大连市西岗区中山路222号,大连医科大学第一附属医院消化内科. daining@dl.cn
电话: 0411-83635963-3163
收稿日期:2005-02-28 接受日期:2005-04-01
摘要目的:从细胞学水平研究自研中药清脂健肝方对酒精性肝损伤的防治作用.
, 百拇医药
方法:原位灌流法分离大鼠肝细胞，建立酒精性肝损伤的体外培养模型，分别加入不同浓度中药原液，观察其对酒精性肝损伤的防治作用.
结果:不同浓度的中药原液均可显著抑制肝细胞ALT、AST的漏出;减少肝细胞3H-甘油掺入率;降低肝细胞脂质过氧化产物丙二醛的升高，具有稳定肝细胞膜的作用，并呈现出量效关系.
结论:从细胞学水平进一步证实，清脂健肝方能提高肝细胞的抗氧化力，可对酒精性肝病起防治作用.
戴宁,曾民德, 李继强,邱德凯.清脂健肝方对酒精性肝损伤的防治作用.世界华人消化杂志 2005;13(12):1457-14591 正常肝细胞 (×30).
, http://www.100md.com
2.2 药物对培养液ALT、AST活性的影响 原代培养大鼠肝细胞加入80mmol/L乙醇24h后，培养液中ALT、AST的活性比正常对照组显著升高(P<0.01)，而各剂量组的中药原液均可显著抑制培养液中ALT、AST的升高(表1).
2.3 药物对3H-甘油掺入率的影响加入80mmol/L乙醇24h后，肝细胞3H-甘油掺入率比正常组显著升高(P<0.01)，而不同剂量的中药原液均可减少3H-甘油掺入率，其中10mg和30 mg剂量组的效果相同，而90mg剂量组效果较好(表1).
2.4药物对肝细胞MDA变化的影响 加入80 mmol/L乙醇24 h后，肝细胞MDA的含量比正常组显著升高(P<0.01)，而不同剂量的中药原液均可减少MDA的含量，其中10 mg和30 mg剂量组的效果相同，而以90mg剂量组的效果较好(表1).
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2.5细胞膜流动性 加入80 mmol/L乙醇24 h后，荧光偏振度显著升高(P<0.01)，细胞膜的流动性降低，而不同剂量的中药原液均可使荧光偏振度减少，以90mg剂量组效果较好(P>0.05).
表1 中药对ALT、AST活性及3H-甘油掺入率、MDA变化的影响(mean±SD)
| 组别 | n | ALT(nkat/L) | AST(nkat/L) | 3H-甘油掺入率(cpm/1.5×106细胞) | MDA(nmol/mL) |
| 正常对照组 | 6 | 4 129.16±6.77 | 4 760.95±7.12 | 1 967.50±232.97 | 18.24±7.01 |
| 乙醇 80 mmol/L | 6 | 8 163.30±16.15b | 10 255.38±12.11b | 2 740.17±420.40b | 37.94±11.36b |
| 乙醇 80 mmol/L+10 mg/mL中药原液 | 6 | 6 001.20±11.41 | 6 878.04±9.52 | 2 414.66±375.00a | 33.82±10.01a |
| 乙醇 80 mmol/L+30 mg/mL中药原液 | 6 | 5 207.71±10.96 | 5 952.86±12.61 | 2 399.61±330.34a | 29.79±10.36a |
| 乙醇 80 mmol/L+90 mg/mL中药原液 | 6 | 4 965.99±10.56 | 5 221.04±11.31 | 2 288.00±318.98 | 21.39±8.38 |
, 百拇医药
aP<0.05，bP<0.01 vs正常对照组.
3 讨论研究证实，乙醇及其代谢物乙醛对肝细胞有直接的毒性作用，可使肝细胞的代谢活性下降[4-5].我们的研究结果也表明，在原代培养的大鼠肝细胞内加入80mmol/L乙醇(相当于肝脏每天代谢乙醇60g)可使反映肝细胞损害的酶学指标ALT、AST的含量显著升高，AST升高明显高于ALT的升高，不同浓度的药物原液均可显著抑制肝细胞ALT、AST的漏出.
体外实验证实，乙醇可以使原代培养肝细胞TG的合成增加，其机制是增加合成TG的底物FFA的吸收而降低极低密度脂蛋白(VLDL)的分泌.甘油是合成TG的另一重要底物.甘油可以合成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油一方面可以直接合成甘油三酸酯，另一方面，脂肪酸的氧化或脂化取决于线粒体外膜上肉碱乙酰转移酶或磷酸甘油乙酰转移酶之间的活性，3-磷酸甘油浓度的升高可使酒精的氧化还原反应向脂肪酸的酯化方向发展而不是向氧化的方向发展[6].我们的研究结果表明，在原代培养的大鼠肝细胞内加入80mmol/L乙醇培养24h，3H-甘油掺入率明显增加，相应细胞内甘油三脂的合成增加，而不同浓度的药物原液均可降低3H-甘油的掺入率，这说明药物可直接阻止肝细胞脂质的合成.
, http://www.100md.com
体内外研究证实，脂质过氧化反应在酒精性肝损伤的发病机制中起重要作用[7-10]，而抗氧化治疗则能有效防治酒精性肝损伤[11-13].乙醇可使原代培养肝细胞产生强烈的氧应激，而使细胞内的抗氧化剂含量如谷胱甘肽(GSH)下降[14]，氧化与抗氧化机制的失衡使有害自由基产生增多，细胞膜中富含多不饱和脂肪酸，极易受自由基攻击，发生脂质过氧化反应，脂质过氧化终产物MDA能与膜脂质、膜蛋白交联而降低细胞膜的流动性[5，9，15].我们的结果显示，加入80mmol/L乙醇后，反映脂质过氧化反应的可靠指标MDA的含量显著升高，同时细胞膜的流动性降低，而不同浓度的药物原液均可使MDA的含量下降，恢复细胞膜的流动性，并呈现量效关系.
我们从细胞学水平进一步证实，自研的复方中药既有直接保护肝细胞的作用，也可以减少肝细胞的脂质合成，又具有抑制脂质过氧化反应从而起到稳定肝细胞膜的作用，其作用机制是提高了肝细胞的抗氧化能力，阻止了乙醇及其代谢物对肝细胞的直接毒性作用.
, 百拇医药
4 参考文献1 鲁晓岚,陶明, 罗金燕, 耿燕,赵平, 赵红莉. 西安酒精性肝病流行病学.世界华人消化杂志 2003;11:719-722
2 厉有名, 陈卫星, 虞朝辉,乐敏, 刘有恃, 徐根云,季峰, 李舒丹. 浙江省酒精性肝病流行病学调查概况.
中华肝脏病杂志 2003;11:647-649
3 戴宁, 曾民德, 彭延申,李继强, 邱德凯, 陆伦根.复方中药对酒精性脂肪肝肝细胞色素P450ⅡE1表达的影响.
中华肝脏病杂志 2003;11:657-659
4 Henzel K, Thorborg C, Hofmann M, Zimmer G, Leuschner U. Toxicity ofethanol and acetaldehyde in hepatocytes
, 百拇医药
treatedwith ursodeoxycholic or tauroursodeoxycholic acid. Biochim Biophys Acta 2004;1644:37-45
5 Sergent O, Pereira M, Belhomme C, Chevanne M, Huc L,Lagadic-Gossman D. Role for membrane fluidity in
ethanol-inducedoxidative stress of primary rat hepatocytes. J Pharmacol Exp Ther 2005;313:104-111
6 Lamb RG, Koch JC, Snyder JW, Huband SM, Bush SR. An in vitro modelof ethanol-dependent liver cell injury.
, 百拇医药
Hepatology 1994;19:174-182
7 Stewart SF, Vidali M, Day CP, Albano E, Jones DE. Oxidative stressas a trigger for cellular immune responses in
patientswith alcoholic liver disease. Hepatology 2004;39:197-203
8 易辉, 王新,苗继延,樊代明.环氧合酶-2对酒精性肝损伤大鼠氧化/抗氧化的作用.
世界华人消化杂志 2004;12:1934-1936
9 Castilla R, Gonzalez R, Fouad D, Fraga E, Muntane J. Dual effect ofethanol on cell death in primary culture of human
, http://www.100md.com
andrat hepatocytes. Alcohol Alcohol 2004;39:290-296
10 Nieto N, Friedman SL, Cederbaum AI. Stimulation and proliferationof primary rat hepatic stellate cells by
cytochrome P450 2E1-derived reactiveoxygen species. Hepatology 2002;35:62-73
11 高健, 吴显才, 李孝生,沈鼎明. 还原型谷胱甘肽治疗酒精性肝病的研究.世界华人消化杂志 2002;10:809-811
12 崔巍, 苏小林, 傅宝玉.抗纤复方1号抗酒精性肝病的实验研究.世界华人消化杂志 2002;10:1245-1249
, http://www.100md.com
13 Wheeler MD, Nakagami M, Bradford BU, Uesugi T, Mason RP, Connor HD,Dikalova A, Kadiiska M, Thurman RG.
Overexpression of manganesesuperoxide dismutase prevents alcohol-induced injury in the rat.
J Biol Chem 2001;276:36664-36672
14 Cardin R, D,Errico A, FiorentinoM, Cecchetto A, Naccarato R, Farinati F. Hepatocyte proliferation andapoptosis in
relation to oxidativedamage in alcohol-related liver disease. Alcohol Alcohol 2002;37:43-48
15 Abraham P, Wilfred G, Ramakrishna B. Oxidative damage to thehepatocellular proteins after chronic ethanol intake
in the rat. Clin Chim Acta 2002;325:117-125
编辑 徐协群 审读 张海宁, 百拇医药( 戴 宁, 曾民德, 李继强, 邱德凯)
