四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆
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李玉富；孙声桃；李继昌；李福胜；张智清
四环素抗性|hGM-CSF|克隆|筛选,关键词：
参见附件(77kb)。
李玉富；孙声桃；李继昌；李福胜；张智清 河南省肿瘤医院生物治疗中心 郑州450008；河南省眼科研究所；郑州450003；河南医科大学第一附属院内科；郑州450052 河南医科大学学报 2001 3
关键词：四环素抗性；hGM-CSF；克隆；筛选
目的:应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法:将四环素抗性基因(TetR)克隆到载体pBV220中构建筛选载体pBV223;根据氨基酸密码子的简并性,在保持原有氨基酸序列不变的情况下,人工合成外源基因的cDNA5′端简并引物库,以hGM CSF基因为例进行筛选。把hGM CSFcDNA简并文库克隆到pBV223中的TetR上游位置,构建pBV223/hGM CSF克隆文库,导入大肠杆菌DH5α中,构建转基因的细菌文库,在不同质量浓度(20mg/L,40mg/L,50mg/L,60mg/L)的四环素培养基中培养。结果:从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV223/hGM CSF克隆,测序结果显示该克隆的hGM CSFcDNA5′端序列与天然序列比较有7个碱基发生突变,且符合实验设计的要求。通过基因重组,构建成最终的高效表达克隆pBV220/hGM CSF,其表达hGM CSF的量占细菌总量的18%,较原表达水平提高80%。结论:可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。
关键词：四环素抗性；hGM-CSF；克隆；筛选
目的:应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法:将四环素抗性基因(TetR)克隆到载体pBV220中构建筛选载体pBV223;根据氨基酸密码子的简并性,在保持原有氨基酸序列不变的情况下,人工合成外源基因的cDNA5′端简并引物库,以hGM CSF基因为例进行筛选。把hGM CSFcDNA简并文库克隆到pBV223中的TetR上游位置,构建pBV223/hGM CSF克隆文库,导入大肠杆菌DH5α中,构建转基因的细菌文库,在不同质量浓度(20mg/L,40mg/L,50mg/L,60mg/L)的四环素培养基中培养。结果:从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV223/hGM CSF克隆,测序结果显示该克隆的hGM CSFcDNA5′端序列与天然序列比较有7个碱基发生突变,且符合实验设计的要求。通过基因重组,构建成最终的高效表达克隆pBV220/hGM CSF,其表达hGM CSF的量占细菌总量的18%,较原表达水平提高80%。结论:可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。
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