关键词：心肌缺血；再灌注；血管紧张素Ⅱ；心脏保护
摘要：许多证据表明，心肌缺血再灌注损伤过程中，心脏局部肾素血管紧张素系统(RAS)被激活，局部增多的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)会对心脏产生进一步的损害作用。于是认为，如果在缺血再灌注前给予外源性AngⅡ势必会加重心肌的损害。然而，我们的研究却表明，大鼠离体心脏缺血前随灌流液给予1nmol/L AngⅡ 5min灌流，然后再给5min正常灌流不但对随后40min缺血及20min再灌注的心肌没有加重损伤，反而对心脏有一定的保护作用，且这种效应不被AT1 受体阻断剂Losartan阻断。由此推测，缺血前给予少量的外源性AngⅡ有可能通过非AT1 途径对心脏发挥保护作用。其机制可能与缺血性预处理的某些过程有关，其意义和机理值得进一步探讨。
中图分类号：R541 文献标识码：A
文章编号： 1001-6325(2000)06-0054-03
Effect of cardioprotection with AngⅡ preteatment on myocardial
ischemia-reperfusion injury in rat
YE Gang ZHANG Shang-ming YANG Fang etal
(The Division of Cardiovascular Research, Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054, China)
Abstract: There is now evidence that thelocal intracardiac renin angiotensin system (RAS) is a ctivated during the period ofmyocardial ischemia and reperfusion, and the increased endogenous AngⅡ in cardiactissues was likely to accelerate the myocardial damage. Therefore, there may be a moredeleterious effect of exogenous AngⅡ on myocardial ischemia-reperfusion injury. However,our study demonstrated that 5 min perfusion of 1nmol/L AngⅡ following 5 min normal KHperfusion before ischemia could attenuate myocardial injury subsequently after 40 minmyocardial ischemia and 20 min reperfusion in rat, and Losartan couldn’t antagonize sucheffect, implying that minor exogenous AngⅡ prior to ischemia may have somecardioprotective effect related to ischemic preconditioning. The mechanism needs furtherstudy.
Key words: myocardial ischemia; reperfusion; AngⅡ; cardioprotectiveeffect
局部组织存在肾素血管紧张素系统(RAS)已是不争的事实，在某些病理状态下心脏局部存在的RAS有可能被激活，造成其活性物质血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在心脏组织中浓度增高并对心肌细胞产生损伤效应Ⅱ[1] ，这种作用主要是由AngⅡ1型受体(AT1 )介导[2] 。由此而推测，如果在心肌缺血前外源性给予AngⅡ可能会进一步加重心脏的损害。本实验正是基于这一设想，观察了外源性AngⅡ对缺血后心脏功能和心肌细胞磷酸肌酸激酶(CK)释放的影响，然而结果却出乎意料，AngⅡ反而显示出保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠，体重(250±40)g，首都医科大学动物中心提供。
1.2 主要仪器与试剂
RM6000八导生理记录仪(日本光电)，PERKIN ELMER 3B可见紫外分光光度计(美国)，AngⅡ(Sigma),Losartan(美国DupontMerck)，磷酸肌酸激酶(CK)测定试剂盒(中国科学院中生公司)，其他化学试剂均为分析纯。
1.3 动物模型
大鼠戊巴妥钠40mg/kg腹腔麻醉后，静脉注射肝素200IU，5min后迅速开胸取出心脏，主动脉插管悬挂于自制的Langendorff灌流装置上，用改良的Krebs-Henseleit(KH)缓冲液行主动脉逆行灌流，溶液组成为(mmol/L)：NaCl113.8, NaHCO3 22.0， KCl 4.7, KH2 PO4 1.2, MgSO4 1.1, CaCl2 2.5,葡萄糖 11.0, 丙酮酸钠2.0。灌流压为8.65kPa，温度稳定在37℃，灌流液充以95%O2 —5%CO2 混合气饱和；将一个充满水的薄壁胶囊经左房插入左心室，调节囊内压使其在1.33kPa以内，连接于压力换能器记录左心室收缩发展压LVDP(Leftventricular developed pressure)及左心室最大收缩与最大舒张速率±dP/dtmax (kPa/s)并读取心率HR(Heartrate)和左室舒张末压LVEDP(Left ventricular end diastolic pressure)，根据单位时间内灌流液的流出量估计当时的冠脉流量(CF，mL/min)。心脏功能稳定15min后开始正式实验，停止灌流模拟心脏缺血，实验中留取冠脉流出液测定CK。
1.4 CK测定原理
磷酸肌酸+ADP磷酸肌酸激酶(CK)肌酸+ATP
ATP+葡萄糖己糖激酶(HK)葡萄糖-6-磷酸+ADP
葡萄糖-6-磷酸+NADP+ 6磷酸葡萄糖脱氢酶6-磷酸葡萄糖+NADPH+ +H+
NADPH在340nm波长有最大吸收，NADPH形成的速率与样本中CK的活性成正比，测定340nm波长下吸光度增加的速率，即可测出样本中CK的活性(国际单位/升，IU/L)。
1.5 实验分组
正常对照组(C)：心脏功能稳定后正常KH液灌流70min，大鼠6只；缺血再灌组(IR)：心脏功能稳定后正常KH液灌流10min，缺血40min，再灌20min，大鼠6只；缺血前+AngⅡ组(AngⅡ)：心脏功能稳定后AngⅡ1nmol/L加入KH液中灌流 min，然后KH液灌流5min，缺血40min，KH液再灌20min，大鼠6只：AngⅡ+Losartan(LA)组：同AngⅡ组，但AngⅡ与Losartan5μmol/L同时给予，大鼠6只
1.6 统计方法
实验数据以
±s表示，利用SPSS软件包，单因素方差分析，组间比较采用Duncan检验。
2 结果
2.1 大鼠心脏缺血40min，再灌20min后心功能的改变及AngⅡ的影响(表1)
大鼠心脏缺血40min再灌注20min后，心脏各项功能指标明显受损，HR，LVDP，±dP/dtmax 与对照组比明显降低(P<0.05or 0.01)，LEDP则明显上升(P<0.01)；缺血前10min给予AngⅡ 1nmol/L后，HR和LVDP及±dP/dtmax 有短暂的升高，持续约1min，很快恢复正常(数据未列出)，再灌时发现缺血前给予AngⅡ的大鼠心脏功能恢复较好，而缺血前与Losartan5μmol/L同时混合给予对再灌后这种心功能恢复的影响并不是很大。
表1 大鼠心脏缺血40min,再灌20min后心功能的改变及AngⅡ的影响
Table 1 The effect of AngⅡ on the cardiac function in vitro after 40 min globalmyocardial ischemia and 20min reperfusion (±s, n=6)
| HR (beat/min) | LVEDP (kPa) | LDP (kPa) | +dP/dtmax (kPa/s) | -dP/dtmax (kPa/s) | CF (ml/min) | |
| Con | 283±18 | 0.82±0.15 | 14.36±1.38 | 421.3±18.8 | 260.7±22.2 | 15.2±1.1 |
| IR | 210±46** | 3.55±0.90** | 7.87±2.65** | 279.3±64.6* | 128.6±31.1** | 12.0±3.8* |
| AngⅡ | 240±28* | 1.90±0.45**# | 11.86±2.31＃ | 336.9±83.5 | 186.2±65.2* | 11.6±1.4* |
| LA | 258±16# | 1.99±0.99* | 11.31±3.46# | 317.0±94.0* | 175.6±76.6* | 12.7±1.8 |
Con: control; IR: ischemia+reperfusion; AngⅡ： AngⅡ; LA: Losartan+AngⅡ
2.2 AngⅡ对大鼠再灌注时磷酸肌酸激酶(CK)释放的影响(图1)
如图1所示，缺血再灌注损伤后，冠脉流出液中CK的释放明显增加，与对照组比较，差异极其显著(P<0.01)，AngⅡ和AngⅡ+Losartan均可使CK的释放较IR组降低(P<0.01)，但与对照组相比，差异仍很显著(P<0.01)，LA组虽从数值上较AngⅡ组要高一些，但差异并不显著，说明Losartan在此条件下并没有阻断AngⅡ造成的CK释放减少作用。
图1 心肌缺血及再灌注损伤后心脏CK的
释放及外源性AngⅡ的影响
Fig 1 The CK release after 40 min myocardial
ischemia and 20min reperfusion and the
effect of AngⅡ(±s,n=6)
** P<0.01 vs Con, ## P<0.01 vs IR
3 讨论
据报道AngⅡ对心肌有直接的损伤作用[3] ，在心肌缺血的情况下其作用更甚[4] 。于是许多作者认为在缺血再灌注前给予外源性AngⅡ势必会进一步加重心肌的损害。如Yoshiyama等在心肌缺血15min前5min随灌流液给予离体心脏AngⅡ10ng/ml[4] 或心肌缺血30min前5min给予1ng/ml[5] 均发现可以加重再灌时心肌的损害。然而，Liu[6] 等在兔心肌缺血再灌注模型上却发现缺血前给予AngⅡ5min，再用正常灌流液灌流10min，然后阻断左冠状动脉缺血30min，再灌120min，可以使心肌梗死面积明显减低；Losartan可以完全抵销这种效应，而AT2 受体阻断剂PD123199 则无此作用，提示这种效应可能是通过AT1 受体实现的。他们认为，AngⅡ的这种作用很可能是一种模拟缺血性预处理效应。
我们的研究表明，缺血前给予AngⅡ 1nmol/L 5min灌流，随后再给予5min正常KH液灌流，对缺血40min再灌20min后的心脏有保护作用。表现在心功能较单纯的缺血再灌有明显的改善，其中以LVEDP，LVDP的恢复最为明显，同时CK释放也较单纯缺血再灌有显著的下降。与Yoshiyama等的不同之处在于，虽然我们在缺血前给予心脏的AngⅡ量与之相同，但随后5min的正常KH液灌流很可能将AngⅡ在心肌组织内的滞留量减少了许多；也就是说，滞留在心肌组织内外源AngⅡ量的多少与随后缺血心肌的损伤是否加重有关，少量外源AngⅡ的存在极可能发挥一个药物性预处理效应。但是，我们却发现同时给予AT1 阻断剂Losartan没有能够阻断AngⅡ的这种心脏保护效应，提示这种效应并不是通过AT1 受体而起作用的。
Wiemer等曾发现AT2 受体在大鼠离体缺血性心脏灌流中可能激活并有一定的功能意义。认为在缺血心脏的某些特定条件下，如AT1 受体被阻断，心脏局部AngⅡ增高的情况下，AngⅡ可通过刺激AT2 受体增加缓激肽的合成和释放从而促进NO的产量增加而发挥心脏保护作用[7] 。由此看来，我们实验中Losartan没能抵销AngⅡ心脏保护作用的机理也有可能部分是由于此原因造成，也就是说，尽管Losartan有可能通过阻断AngⅡ与AT1 受体的结合而使其潜在的预处理效应不能发挥，但此时AT2 受体的激活又可能对心脏功能的恢复有利。因此，AngⅡ对缺血再灌注损伤心脏的保护作用究竟是通过AT1 受体模拟预处理还是通过AT2 受体起到了作用值得进一步、深入地研究，对其机理的阐明无疑会使我们对心脏局部RAS的生理意义有更新更符合实际的认识。
参考文献：
[1] McAlpine HM, Morton JJ, Leckie B, et al.Neuroendocrine activation after myocardial infarction[J]. Br Heart J, 1988,60:117-124.
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[4] Yoshiyama M, Kim S, Yamagishi H, et al. The deleterious effects of exogenousangiotensin I and angiotensin Ⅱ on myocardial ischemia-reperfusion injury[J]. JpnCirc J, 1994,58:362-368.
[5] Yoshiyama M, Kim S, Yamagishi H, et al. Cardioprotective effect of the angiotensinⅡ type 1 receptor antagonist TCV-116 on ischemia-reperfusion injury[J]. Amer HeartJ, 1994,128:1-6.
[6] Liu HG, Tsuchida A, Cohen MV, et al. Pretreatment with angiotensin Ⅱ activatesprotein kinase C and limits myocardial infarction in isolated rabbit hearts[J]. J MolCell Cardiol, 1995,27:883-892.
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收稿日期：1999-05-12
修回日期：1999-12-17 , 百拇医药