关键词：脑缺血；再灌流损伤；凋亡；葛根素
【摘要】 目的： 观察缺血再灌流损伤大鼠脑细胞凋亡及葛根素对其影响。方法： 采用Pulsinelli大鼠4血管阻塞模型，缺血20min后恢复血流，随机分为对照组、再灌流生理盐水组及再灌流葛根素组，按规定时间取脑，用流式细胞仪检测凋亡细胞数。结果： 对照组中可见少量凋亡细胞，缺血再灌流组中随再灌流时间延长，凋亡细胞数也增加(P<0.01)，再灌流组与对照组相比细胞凋亡数增加(P<0.05)，再灌流盐水组与再灌流葛根素组细胞凋亡数无差异(P>0.1)。结论： 细胞凋亡存在于脑缺血再灌流损伤中，在24h内随时间延长凋亡细胞数增加。
Cerebrocellularapoptosis resulted from ischemic reperfusion injury and intervention with pueraria root
Liu Yugeng ， Xia Chengqing ， Wang Peiyan ， et al .
( Emergency Department ， Beijing Red Cross Chaoyang Hospital ， Capital University of Medical Sciences ， Beijing 100020 )
【
Abstract 】 Objective ： To investigate the apoptosis of brain cells in rats afterischemic reperfusion injury and the effect of pueraria root . Methods ： The four-vessel occlusion model of Pulsinelli was used andreperfusion was started at 20min after ischemia . The rats were randomly divided into group N.S . reperfusion ， pueraria root reperfusion and control . After samples were taken from the brain on time ， the number of cerebrocellularapoptosis was determined by flow cytometer . Results ： There were more apoptotic cells in two reperfusive groupsthan control ( P < 0.05) ； the longer the reperfusive time ， the more the apoptotic cells ( P < 0.01) ， but there was no significant difference in apoptotic cell numbersbetween N.S . andpueraria root reperfusion group ( P > 0.1) . Conclusion ： Cerebrocellular apoptosis is associated with ischemic reperfusioninjury and the apoptotic cells increase with time during the 24h experimental period .【 Key words 】 Cerebralischemia Reperfusioninjury Apoptosis Pueraria root
脑细胞凋亡常见于心跳骤停后脑复苏综合征，本实验通过制备大鼠全脑缺血再灌流动物模型，用流式细胞仪测定再灌流后脑细胞凋亡数量，了解凋亡细胞出现的时间以及葛根素对其影响。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备 采用健康Wistar大鼠54只，体重185～230g，雌雄不限，由军事医学科学院动物实验室提供。将大鼠用2%戊巴比妥钠麻醉，采用Pulsinelli大鼠4血管阻塞模型[1] 。首先分离双侧颈总动脉，置线备用，然后将双侧椎动脉烧闭，24h后用动脉夹闭双侧颈总动脉，缺血20min后恢复颈总动脉血流。对照组仅做4血管解剖暴露。
1.2 实验方法 随机分成7组：对照组10只，缺血再灌流1h盐水组、葛根素组各10只，4h、24h四组各6只。在再灌流同时腹腔内分别注射等容量0.9%盐水、葛根素溶液(由广东燕塘生物化学药业有限公司提供)，剂量为1mg/g体重，在缺血再灌流1h、4h、24h3个时点进行观察。相应时点断头取脑，制备成单个细胞悬液，调节细胞浓度为106 /ml，用AnnexinV及PI对神经细胞进行双标记，以美国Becton Dickinson公司生产PACSCalibur流式细胞仪记录AnnexinV阳性PI阴性细胞数的百分比，即早期凋亡细胞百分数。
1.3 统计学分析 数据以x±s表示，SPSS软件进行统计学处理，各组间比较采用方差分析。
2 结 果
由表1可知，正常对照组可见少量凋亡细胞；缺血再灌流组中随再灌流时间延长，凋亡细胞数也增加(P<0.01)；再灌流盐水组及再灌流葛根素组与对照组相比细胞凋亡数增加(P<0.05)；再灌流盐水组与再灌流葛根素组无差异(P>0.1)。
表1 各组在脑缺血再灌流不同时间细胞凋亡的比较
| 组别 | 例数 | 缺血再灌流细胞凋亡数(%) | ||
| 1h | 4h | 24h | ||
| 对照组 | 10 | 0.53±0.25 | ||
| 盐水组 | 22 | 1.36±0.84* | 1.79±0.97＃* | 2.10±1.11＃* |
| 葛根素 | 22 | 1.13±0.26* | 1.59±0.11＃* | 1.66±0.83＃* |
3 讨 论
传统观点认为缺血性神经元死亡以坏死为表现[2] ，但最近许多学者经一系列脑缺血动物模型的研究，从形态学、生化、药物学和基因等多角度证明凋亡存在于脑缺血再灌流损伤中[3，4] ，且发现凋亡细胞出现时间及数量与选用动物、观察部位及缺血程度有关[5～7] 。
细胞凋亡最早发生的变化之一是磷脂酰丝胺酸(PS)迁移到细胞膜外，其后则有细胞核及DNA的变化。AnnexiV是一种35～36KD Ca2+ 依赖性磷脂凝集蛋白，与PS有高度亲和力，与之结合后可结合到荧光物质上，可通过流式细胞仪检测。此法比基于核或DNA碎片的核变化实验能更早确定细胞凋亡。AnnexinV法与Propidium iodide(PI)染色法结合使用可区别细胞凋亡和实验中的机械损伤。
本实验中对照组也可见少量凋亡细胞，相似结果亦见于苏志强等的实验中，考虑可能是正常生长发育过程中的一种生理性死亡[8] 。有报道用流式细胞仪检测在再灌流1d时凋亡数最多[8] 。本实验观察时间点少而未能显示凋亡细胞高峰，但在24h内则随再灌流时间延长而凋亡细胞数增加。
本实验中盐水组与葛根素组凋亡细胞数在统计学上无明显差异，考虑：1)腹腔给药后，与腹膜吸收量多少及吸收时间长短有关；2)血脑屏障对药物的影响；3)观察时间短，药物对细胞凋亡的影响尚未表现出来。因而尚有待进一步的研究。
参考文献
1，Pulsinelli WA，BrierleyJB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.Stroke，1979，10：267～272
2，Ignatowicz E，Vezzini AM，Rizzi M，et al.Nerve cell death induced in vivo bykainic acid and quinolinic acid does not involve apoptosis.Nueroreport，1991，2：651～662
3，Charriaut MC，Ben AY.Cerebral ischemia：is cell death a type of apoptosis？ArchPediatr，1996，3：245～247
4，Rosomff HF，Kochanck PM，Clark R，et al.Resuscitation from severe brain trauma.CritCare Med，1996，24：48～56
5，Volpe BT，Wessel TC，Mukherjee B，et al.Temporal pattern of internucleosomal DNAfragmentation in the striatum and hippocampus after transient forebrain ischemia.NeuroscienLetters，1995，186：157～160
6，Yili，Chopp M，Jang N，et al.Temporal profile of in situ DNA fragmentation aftertransient middle cerbral artery occlusion in the rat.J Cerebral Blood Flow Metabolism，1995，15：389～397
7，Linnik MD，Miller JA，Sprinkle CJ，et al.Apoptotic DNA fragmentation in the ratcerebral cortex induced by permanent middle cerebral artery occlusion.Brain Res，1995，32：116～124
8，苏志强，刘亢丁，饶明俐.流式细胞仪检测大鼠局灶性脑缺血再灌流后细胞凋亡的研究.中风与神经疾病杂志，1997，14：197～199
(收稿：2000-02-16 ，修回：2000-04-20 ) , http://www.100md.com