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关键词：T细胞活化；CD69；动力学
[摘 要]目的 为明确CD69体内外表达动力学并进一步探讨其作用。方法 ConA体内外 刺激小鼠T细胞后，选取不同时间点，流式细胞仪观察T细胞CD69表达率。结果 ConA刺激后2hCD69即有明显表达，6～8h达到峰值；CD8- 与CD8+ T细胞相比无明显差异；体外条件对CD69的表达有显著的影响。结论 结果提示CD8- 和CD8+ T细胞的活化均需要CD69的参与；T细胞可能在活化早期一过性高表达CD69；CD69很可能是一个T细胞增殖的共刺激信号。
[中图分类号]R392.12 [文 献标识码]A
[文章编号]1000-8861(2000)03-0210-04
Dynamics of CD69expression on ConA acti vated mice T lymphocytes in v itro and in vivo
ZHANG Lei，MIN Zhi-lian
(Department of Urology，Changz heng Hospital，Shanghai 200003，China)
GE Qi，ZENG Yao-ying
(N ational Professional Laboratory of Tissu e Transplantation and Immunology，Jinan University ，Gunangzhu 510632，China)
SUN Er-wei
(Dep artment of Kidney Transplantation，Zhujia ng Hospital，Guangzhou 510282，China)
[Abstract]Objective Inorde r investigated the dynamics of CD69 expr ession on ConA stimulated T lymphocytes in vitro and in vivo.Methods The CD69 expression were observed by cytometry atselected time points after ConA stimulation in vitro and in vivo.Results The expression of CD69 started to express within 2 hours of stimulation and reached its clima x 6～8hours later.There were no signific ant differ ences of expression between CD8- and CD 8+ subsets.The culture conditions had obvious influence onCD69.Conclusions CD69，which may transiently express on T cell at its early stage of activation，is a promising candidate of T lymphocyte co-stimulators that is re quiredin the activation of both CD8- and CD8+ subsets
[Key words]T lymphocyte；act ivation；CD69
T细胞是免疫系统发挥作用的核心，其活化过程一直是免疫学关注的焦点之一。T细胞活化产生各种改变：有生化学的改变，如磷脂酰肌醇的代谢以及细胞内钙离子升高；还可引发一些特殊基因的表达。T细胞活化后表达数个膜表面分子，CD69是其中表达最早的一个，刺激后1～2h即可在T细胞表面发现CD69。CD69早期被称为AIM(activation inducer molecule)，EA-1，Leu-23和MLR3，是由两个相同的单体经不同的糖基化后构成的细胞表面双体蛋白，分子量60kDa，属于C型选择素受体家族[1] 。T细胞表面CD69与其单克隆抗体的结合可引发细胞外Ca++ 的内流[2] ；细胞内TNF、IFN-γ等细胞因子的分泌[3] IL-2及其受体的合成与表达[4] ，增强转录因子AP-1的活性[5] ，并通过细胞内的信号传导[6] ，增强T细胞的增殖。因此它被认为是一个T细胞增殖的共刺激信号[1] 。但CD69的配体至今尚未发现，其生物学功能也未确定[6] ，那么CD69在T细胞活化的过程中产生什么作用？在哪个阶段起作用？对T细胞活化时CD69的表达动力学研究将有助于这些问题的解决。
T细胞活化时CD69的表达情况，已有数个报道。用以刺激的活化剂有美洲商路[7] 、PHA及PMA[8] 等。这些报道的资料均有来源于对T细胞的体外研究。目前，关于T细胞CD69表达尚未见有体内研究的资料发表。那么体外实验是否会受到人工培养环境的影响，其结果是否和体内的真实情况相符？本课题比较了ConA的刺激下小鼠T细胞CD69表达的体内外动力学变化，以进一步探讨CD69的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要试剂及仪器
1.1.1 动物：Balb/c近交系小鼠，雄性，6～8周龄，购自中山医科大学实验动物中心。
1.1.2 主要试剂和仪器：刀豆素A(ConA)购自美国SIGMA公司；RPMI 1640和胎牛血清(FCS)购自美国HYCLONE公司；谷氨酰胺(L-Glu)由美国GIBCO公司生产；2巯基乙醇(2-ME)为日本Nacalai公司生产。所用抗小鼠单克隆抗体见表1。
表1 本实验所用抗小鼠单克隆抗体
Tab1 The monoclone antibodies used in this study
| Species | Isotype | Clone | PN | Company | |
| CD3-PE | RAT | IgG2A | HT3 | IM2769 | IMMUNOTECH |
| CD8-Cy-Chrome | RAT | IgG2A,k | 53-6,7 | 01504D | PHARMINGEN |
| CD69-FITC | HAMSTER | IgG,group 1，λ | H1,2F3 | 01048A | PHARMINGEN |
二氧化碳孵箱为Shel-lab(美国)产品，高速低温离心机由Universal(美国)出品，激光流式细胞仪为美国BD公司FACStarplus 型。
1.2 方法
1.2.1 ConA刺激的小鼠T淋巴细胞CD69表达动力学研究
体外实验：无菌条件下取6只Balb/c小鼠的脾脏，实验组与对照组各3只。碾磨后细胞悬于RPMI1640培养液(含20%胎牛血清)，100目尼龙网滤过。取少量细胞悬液，0.4%台盼蓝侵染检查细胞活率(>98%)，3%乙酸溶液稀释后细胞计数板计数，用培养液将细胞数调至106 /ml后进行实验。实验组加入ConA溶液(1mg/ml，20μl)终浓度10μg/ml，对照组加入等量PBS。将细胞置于37°C，5%CO2 孵箱内孵育。2，4，6和20h后分别取样，PBS洗1次，标记荧光抗体，流式细胞仪检测T细胞CD69阳性率。
体内实验：3只Balb/c小鼠尾静脉注射ConA-PBS溶液(浓度1mg/ml，10μg/g体重)(实验组)，或等体积PBS溶液(对照组)。于注射后0，4，8和24h分别于尾静脉取血30μl。标记荧光抗体后，流式细胞仪检测T细胞CD69阳性率。
1.2.2 淋巴细胞荧光抗体标记：三色直接荧光标记法：体外实验所收集的样品中加入适量PBS洗1次，离心后尽可能去尽上清，加入荧光直标抗体anti-CD3-PE，anti-CD8-Cy-Chrome，anti-CD69-FITC各10μl，轻轻混匀，避光，室温孵育30min，PBS洗1次，1%多聚甲醛PBS固定10min后流式细胞仪待测。体内实验的血标本直接标记抗体之后，用红细胞裂解液溶血，PBS洗1次，固定，待测。
1.2.3 流式细胞仪数据获取及分析：全部数据用流式细胞仪和软件LYSYSⅡ进行三色荧光参数获取及分析。简述如下：在前散射(FSC)和侧散射(SSC)的二维Dot-plot图中，划出淋巴细胞区(R1)，然后对淋巴细胞作PE、FITC和Cy-Chrome荧光强度检测，其中荧光1(FL1)为FITC，滤光片带通为530±10nm，荧光2(FL2)为PE，滤光片带通为575±10nm，荧光3.1(FL3.1)为Cy-Chrome，滤光片带通为660±10nm。先根据淋巴细胞PE荧光强度划出CD3+ T细胞区(R2)，再检测T细胞FITC和Cy-Chrome荧光强度，数据显示于双色Dot-plot(FL1vs FL3.1)图中。 数据分析时，根据Isotype的非特异性荧光强度设定界限，以确定双阳性、双阴性和单阳性区。
1.3 统计学处理 全部数据均由SPSS7.5软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 体外实验 ConA刺激前，小鼠CD3+ T细胞表面CD69弱表达(9.33%±2.69%)。ConA刺激2h后，既可观察到CD69表达开始增多(23.9%±11.7%)，6h达到峰值(83.9%±2.7%)，20h出现减弱趋势(76.6%±10.3%)。这与文献[8] 报道的PMA刺激下的T细胞CD69表达动力学基本一致。CD3+ T细胞中的CD8+ 和CD8- 亚群。CD69表达无显著性差异，表现为本底值的相似(9.3%±2.6%vs9.3%±2.8%)，对ConA的反应速度相似(刺激2h的表达率为29.9%±12.4%vs21.6%±10.1%)，高峰出现的时间(6h)和数值相似(84.3%±4.9%vs83.8%±2.7%)以及20h后表现出相似的下降趋势(79.4%±10.0% vs 76.5%±11.3%)(见图1)。对照组CDT69弱表达，各时间点表达率无显著性差异。
图1 小鼠T淋巴细胞体外CD69表达动力学
Fig.1 The dynamics of CD69 expression on mouse T lymphoytes in vitro
2.2 体内实验 体内实验与体外实验的结果有许多相似之处，CD3+ T细胞ConA刺激后CD69表达高峰的出现时机(8h)和峰值相似(81.0%± 1.6%)，CD8+ T细胞与CD8- T细胞CD69表达无显著性差异I各时间点P值均>0.05).同时，体内与体外实验也存在明显的差异，体内T细胞CD69表达率的本底值明显低于体外(2.7%± 1.1% vs9.33%± 2.69%，P=0.017)；体内T细胞CD69一过性高表达之后,下降的速度快、幅度大，24h的T细胞的CD69表达率仅为21.4%±0.8%(见图2).对照组CD69弱表达，各时间点表达率无显著性差异.
图2 小鼠T淋巴细胞体内CD69表达动力学
Fig.2 The dynamics of CD69 expression on mouse T lymphoytes in vivo
3 讨论
T细胞活化是其执行功能的前奏和基础，包含有深刻而广泛的细胞内变化，一些特殊的基因在T细胞活化时表达，这些基因可被分为立即表达(刺激15～30min后即可表达)；早期表达(刺激后30min至48h)以及晚期表达(刺激后2～14d)。其中包括数个膜表面分子的表达，IL-2受体CD25，转铁蛋白受体CD71和CD69是其中的代表，这些分子被称为活化标志[9] 。CD69是其中表达最早的分子[3] 。
本课题以ConA为刺激剂，体内外对照观察了T细胞CD69表达的动力学变化。结果表明：ConA刺激的体外实验结果与文献报道的以PHA、PMA[8] 及美洲商路[7] 为刺激剂的结果相似。刺激2h后即可观察到CD69的明显表达，6h达到峰值，20h虽已有下降的趋势但仍维持在较高的水平。体内实验的结果与体外实验有一定的相似性，同时也存在显著性差异。体内T细胞CD69表达率的本底值明显低于体外，这表明淋巴细胞的分离和培养过程对T细胞CD69的表达产生了影响。而体内实验中T细胞CD69一过性高表达之后迅速、大幅的下降则与以往“CD69在T细胞表面稳定表达数天”[3] 的看法出现了分歧。作者倾向于认为刺激后T细胞CD69确为一过性高表达。对T细胞的研究显示，刺激后CD69的mRNA水平出现迅速而短暂的增高，30～60min即可达到峰值并在8h恢复到静息态水平[10] 。一些体内迅速降解的细胞因子和原癌基因的mRNA的3’端非翻译区存在一个AU富含区，CD69的mRNA也存在这个序列[11 ]。这些资料支持本课题的体内实验结果。之所以在体外培养环境中持续表达可能是由于刺激剂的持续存在，而在体内刺激剂则可被代谢清除。事实是否如此需要进一步的研究。
本课题的结果表明：CD8- 和CD8+ T细胞CD69的表达无明显差异，活化前几乎不表达CD69，受到刺激后可迅速而短暂的表达CD69。这提示CD8 -和CD8+ T细胞的活化均需要CD69的参与，CD69所起的作用很可能是在活化早期传递活化信号，而细胞的后期活化过程则不依赖于CD69的存在。
近年来的免疫学进展显示：免疫反应的早期事件决定T细胞是否反应，产生何种反应，其中共刺激信号起着决定性的作用。CD69做为一个新的可能的共刺激信号，越来越受到人们的关注[12] ，对该抗原的深入研究必将加深人们对于T细胞活化过程和控制机制的认识。
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(39870724，39970705)
[作者简介]张雷(1973-)，男，江苏南京市人，博士研究生，主要从事T细胞活化与耐受的研究。
[参考文献]
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[收稿日期]2000-01-04 ；[修回日期]2000-01- 21 (张雷 葛琪 孙尔维 曾耀英 闵志廉)