关键词：黄芪多糖；淋巴细胞；血管内皮细胞；粘附分子
[摘 要]目的 从影响淋巴细胞与血管内皮细胞粘附的角度探讨黄芪多糖免疫增强作用的机制。方法 以体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型，应用蛋白染料染色、细胞ELISA、免疫细胞化学等方法，研究黄芪多糖对淋巴细胞与血管内皮细胞粘附的影响及其分子机制。结果 黄芪多糖作用于HUVEC，能促进HUVEC与淋巴细胞粘附，并与IL-1、TNF有协同增强作用，其主要分子机制为促进HUVEC表面粘附分子ICAM-1的表达；黄芪多糖作用于淋巴细胞，不增强淋巴细胞与HUVEC粘附，同时也不提高淋巴细胞表面粘附分子CD18的表达。结论 通过提高细胞表面粘附分子的表达而促进淋巴细胞与内皮细胞的粘附，从而促进淋巴细胞再循环可能是黄芪多糖发挥免疫增强作用的机制之一。
[中图分类号]R392.11；R285.5 [文献标识码]A
[文章编号]1000-8861(2000)03-0206-04
Effect ofastragalus polysaccharin(APS)on lymphocyte-endothelium adhesion and the molecularmechanism
HAO Yu，QIU Quan-ying，WUJun
(Department of Immunology，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)
[Abstract] Objective To investigatethe effect of APS on lymphocyte-endothelium adhesion and cell adhesion molecules(CAMs).Methods Basedon the model of human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)，this study adopted RoseBengal Stain，cell ELISA，immunocytochemistry techniques to investigate the effect ofAPS on lymphocyte-endothelium adhesion and the molecular mechanism.Results Incubation ofHUVEC with APS markedly enhanced HUVEC adherence for lymphocyte and APS had synergism withIL-1 and TNF.The main molecular mechanism is that APS upregulate the expression of ICAM-1on the HUVEC.The lymphocyte treated with APS did not show increase in their adherence toHUVEC，and had no upregulation of CD18 expression.Conclusion It is one of themechanisms of immunopotentiation of APS that it promote lymphocyte-endothelium adhesion byupregulating the CAMs expression to promote lymphocyte recirculation.
[Key words]lymphocyte；HUVEC；adhesion molecule；astragaluspolysaccharin(APS)
黄芪多糖(astragalus polysaccharin，APS)是中药黄芪的活性成分，具有多种药理作用，如抗感染、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等。研究表明：黄芪多糖是通过其免疫增强作用而发挥功效的。近年来，淋巴细胞与血管内皮细胞间的粘附在淋巴细胞再循环及免疫应答中的作用日益受到重视。本研究从黄芪多糖影响淋巴细胞与血管内皮细胞粘附的角度探讨黄芪多糖免疫增强作用的机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 试剂：M199培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清(美国GIBCO)，内皮细胞生长因子(ECGF德国B.M)，Ⅰ型胶原酶(美国SIGMA)，虎红(RoseBegal化学纯，北京化工厂)，淋巴细胞分层液(天津中国医学科学院血液病研究所)，抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体、免疫组化染色SP试剂盒、鼠抗人ICAM-1单克隆抗体(美国ZYMED)，鼠抗人CD18单克隆抗体、重组IL-1、重组TNF、APAAP试剂盒(邦定生物医学公司)。
1.1.2 仪器：CO2 恒温培养箱(美国Forma)，倒置相差显微镜及显微照相系统(日本Olympus)，低温冷冻离心机(日本HITACHI)，酶标仪(美国Bio-Rad2550)，细胞离心涂片机(军事医学科学院)。
1.1.3 实验用药：黄芪多糖(Astragalus Polysac-charin，中国药品生物制品检定所)，用M199培养基配制，0.22μm，孔滤膜过滤。
1.2 实验方法
1.2.1 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养：收集健康产妇正常分娩胎儿的脐带，静脉灌入0.1%胶原酶，于37°C消化10min分离内皮细胞，用完全M199(含20%FCS，20μg/mlECGF)接种细胞于培养瓶(预先用1%明胶包被)，置37°C 5%CO2 孵箱培养，当细胞融合成单层时，以0.125%胰酶-0.02%EDTA消化传代，实验用第3～5代，将细胞传于96孔板。
1.2.2 HUVEC的鉴定[1] ：相差显微镜观察细胞形态呈铺路石样排列，第Ⅷ因子相关抗原检测(SP免疫细胞化学染色法)阳性，透射电镜观察胞浆内有WeibelPalade小体。
1.2.3 制备人外周血淋巴细胞：抽取健康成人静脉血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分出单个核细胞层，用RPMI1640培养，37°C 5%CO2 孵育48h供用。
1.2.4 淋巴细胞与HUVEC粘附实验[2] ：用药物处理呈单层的HUVEC或淋巴细胞20h后进行细胞粘附实验，每组3复孔。HUVEC中加入淋巴细胞3×105 ～5×105 个细胞/孔，37°C5%CO2 孵育1h，用PBS洗去未粘附细胞，加入0.25%虎红，100μl/孔，室温作用10min，洗去游离虎红，加PBS-乙醇(1∶1)200μl/孔，室温作用1h后，酶标仪570nm测A值。最后用实验孔A值减去空白孔(未加淋巴细胞)A值表示粘附量。①黄芪多糖处理HUVEC或淋巴细胞后进行粘附实验。②黄芪多糖加IL-1处理HUVEC或淋巴细胞后进行粘附实验。③黄芪多糖加TNF处理HUVEC或淋巴细胞后进行粘附实验。
1.2.5 HUVEC表面ICAM-1表达的检测[3] ：用细胞ELISA法。实验分组如下：①对照组；②黄芪多糖组；③IL-1组；④IL-1加黄芪多糖组；⑤TNF组；⑥TNF加黄芪多糖组。每组3复孔，用上述药物处理HUVEC 20h后，PBS洗2遍，进行细胞ELISA实验：用4%多聚甲醛于4°C固定40min后，以2%BSA-PBS200μl/孔封闭40min，然后加入鼠抗人ICAM-1单抗50μl/孔(用0.1%BSA-PBS稀释1∶200)，37°C孵育1h后加入酶标羊抗鼠IgG抗体100μl/孔(1∶2000稀释)，37°C孵育1h后加入邻苯二胺底物液200μl/孔，室温避光15min，2mol/L H2 SO4 50μl/孔中止反应，酶标仪492nm测A值。每步都用0.05%Tween20-PBS洗板3次。
1.2.6 淋巴细胞CD18表达的检测：用APAAP法。实验分组同上。用不同药物处理淋巴细胞20h后，用离心涂片机制备细胞涂片(每组3张片)，用APAAP法检测。显微镜下计数200个淋巴细胞，计算阳性细胞百分率。
1.3 统计学处理 t检验。
2 结果
2.1 黄芪多糖对淋巴细胞与HUVEC间粘附的影响 表1结果表明：黄芪多糖处理HUVEC后，可促进其与淋巴细胞间的粘附，与对照组比有明显差异(见图1、图2)，且有剂量依赖趋势；黄芪多糖处理淋巴细胞后，对其与HUVEC的粘附无明显作用。
表 1 黄芪多糖对淋巴细胞与HUVEC间粘附的影响
Tab1 Effect of APS on lymphocyte-endothelium adhesion
| Group | Dose | EC-LC adhesion A value(  ±s)(pretreat EC) | LC-EC adhesion A value( ±s)(pretreat LC) |
| Control | 0.0397±0.0064 | 0.0697±0.0059 | |
| APS | 40μg/ml | 0.0623±0.0070* | 0.0693±0.0081 |
| 200μg/ml | 0.0683±0.0105* | 0.0713±0.0081 | |
| 1mg/ml | 0.0807±0.0108** | 0.0793±0.0092 |
图1 淋巴细胞与未经处理的HUVEC间的粘附×66
Fig1 Lymphocyte-HUVEC (unpretreated) adhesion
图2 淋巴细胞与经黄芪多糖处理的HUVEC间的粘附×66
Fig2 Lymphocyte-HUVEC(pretreated with APS)adhesion
2.2 黄芪多糖对IL-1刺激的淋巴细胞与HUVEC粘附的影响 表2结果表明：IL-1处理HUVEC后能显著增强其与淋巴细胞间的粘附，黄芪多糖和IL-1共同处理HUVEC后，高、中剂量组均可增强其与淋巴细胞间的粘附，与IL-1组比有显著差异，且有剂量依赖趋势；经IL-1处理的淋巴细胞能明显增强与HUVEC的粘附，黄芪多糖对其无协同增强作用。
表2 黄芪多糖对IL-1刺激的淋巴细胞与HUVEC粘附的影响
Tab2 Effect of APS on IL-1 induced lymphocyte-endothelium adhesion
| Group | Dose | EC-LC adhesion A value( ±s)(pretreat EC) | LC-EC adhesion A value( ±s)(pretreat LC) |
| Control | 0.0190±0.0070 | 0.0320±0.0054 | |
| IL-1 | 1000U/ml | 0.0417±0.0081* | 0.0423±0.0035* |
| IL-1+APS | 40μg/ml | 0.0567±0.0062 | 0.0420±0.0045 |
| 200μg/ml | 0.0625±0.0080** | 0.0423±0.0065 | |
| 1mg/ml | 0.0707±0.0071*** | 0.0490±0.0026 |
2.3 黄芪多糖对TNF刺激的淋巴细胞与HUVEC粘附的影响 表3结果表明：TNF处理HUVEC能明显增强其与淋巴细胞胞间的粘附，黄芪多糖高剂量组与TNF共同处理HUVEC可增强TNF的作用。TNF处理的淋巴细胞未见与HUVEC粘附增加，黄芪多糖与TNF共同处理淋巴细胞与TNF单独处理淋巴细胞无明显差异。
表3 黄芪多糖对TNF刺激的淋巴细胞与HUVEC粘附的影响
Tab3 Effect of APS on TNF induced lymphocyte-endothelium adhesion
| Group | Dose | EC-LC adhesion A value( ±s)(pretreat EC) | LC-EC adhesion A value( ±s)(pretreat LC) |
| Control | 0.0333±0.0035 | 0.0423±0.0071 | |
| TNF | 1000U/ml | 0.0740±0.0061* | 0.0470±0.0056 |
| TNF+APS | 40μg/ml | 0.0740±0.0098 | 0.0430±0.0044 |
| 200μg/ml | 0.0787±0.0073 | 0.0410±0.0066 | |
| 1mg/ml | 0.0983±0.0071** | 0.0443±0.0038 |
2.4 黄芪多糖对HUVEC表面ICAM-1表达的影响 表4结果表明：黄芪多糖、IL-1、TNF均能增加HUVEC表面ICAM-1的表达，作用强度依次为TNF>黄芪多糖>IL-1，且黄芪多糖可增强IL-1、TNF的作用。
表4 黄芪多糖对HUVEC表面ICAM-1表达的影响
Tab4 Effect of APS on the expression of ICAM-1 on the HUVEC
| Group | ICAM-1 A value( ±s) | P | |
| 1 Control | 0.0840±0.0060 | ||
| 2 APS 1mg/ml | 0.1900±0.0031 | 2∶1 | <0.01 |
| 3 TNF 1000U/ml | 0.2090±0.0055 | 3∶1 | <0.01 |
| 4 TNF+APS 1mg/ml | 0.2230±0.0030 | 4∶3 | <0.05 |
| 5 IL-1 1000U/ml | 0.1707±0.0038 | 5∶1 | <0.01 |
| 6 IL-1+APS 1mg/ml | 0.1980±0.0053 | 6∶5 | <0.01 |
| 2.5 黄芪多糖对淋巴细胞表面CD18表达的影响 表5用APAAP法进行免疫细胞化学染色后计数淋巴细胞CD18阳性百分率显示：黄芪多糖、TNF均对淋巴细胞CD18阳性百分率无影响；IL-1可增加CD18阳性淋巴细胞百分率，黄芪多糖不增强IL-1的作用。 表5 黄芪多糖对淋巴细胞表面CD18表达的影响 |
| Group | LC CD18+ % ( ±s) | P | ||
| 1 | Control | 49.00±2.31 | ||
| 2 | APS 1mg/ml | 50.67±2.05 | 2∶1 | >0.05 |
| 3 | TNF 1000U/ml | 49.33±2.87 | 3∶1 | >0.05 |
| 4 | TNF+APS 1mg/ml | 48.33±2.09 | 4∶3 | >0.05 |
| 5 | IL-1 1000U/ml | 61.33±3.25 | 5∶1 | <0.01 |
| 6 | IL-1+APS 1mg/ml | 60.67±2.18 | 6∶5 | >0.05 |
淋巴细胞在血液和淋巴组织之间的再循环为机体提供了能不断监视抗原侵入的免疫细胞，同时也有利于淋巴细胞与其他免疫细胞的相互作用，这对于免疫应答的诱导和调节是非常重要的。淋巴细胞再循环的重要环节就是血液中的淋巴细胞与淋巴结、集合淋巴结或脾脏的毛细血管后静脉HEV及其类似结构粘附，继而渗出血管进入淋巴组织[4] 。我们以人脐静脉内皮细胞为模型，观察了黄芪多糖对淋巴细胞与HUVEC粘附作用的影响，结果表明黄芪多糖能促进淋巴细胞与HUVEC的粘附，作用于HUVEC而不作用于淋巴细胞，提示黄芪多糖可通过增强淋巴细胞与内皮细胞的粘附而促进淋巴细胞再循环，增加淋巴细胞与抗原的接触机会，从而扩大免疫反应，增强机体免疫功能。此外，内皮细胞作为抗原呈递细胞与T细胞接触可为T细胞活化提供重要的共刺激信号，参与免疫应答进程[5] 。因而，黄芪多糖对淋巴细胞与内皮细胞粘附的影响也影响免疫应答时T细胞的活化。
在机体发生免疫反应时，体内产生大量细胞因子，诱导淋巴细胞和内皮细胞表面粘附分子的表达和释放。因此，目前认为细胞因子也是影响淋巴细胞粘附及跨内皮迁移的重要因素[6] 。本研究结果表明，IL-1、TNF处理HUVEC可显著增强淋巴细胞与HUVEC的粘附，此与其他学者的报道是一致的。黄芪多糖可协同IL-1、TNF增强HUVEC与淋巴细胞的粘附。关于IL-1、TNF处理淋巴细胞后对粘附的影响，各实验室报道的结果不尽相同。如DURIE等发现：用IL-1预先处理淋巴细胞，并不导致它们与HUVEC粘附增强[7] ，而我国学者报道用IL-1、TNF预先处理淋巴细胞可使其与HUVEC粘附增强[8] 。本实验的结果是，IL-1处理淋巴细胞可导致其与HUVEC粘附增强，TNF无此作用。各实验室的结果不同有待于进一步研究。以上结果提示：在免疫反应状态下，淋巴细胞与HUVEC粘附作用增强，黄芪多糖可作用于HUVEC，使粘附进一步加强，促进免疫反应。
淋巴细胞与血管内皮细胞粘附的分子基础在于细胞表面粘附分子的相互作用[9] 。迄今为止，已发现的参与淋巴细胞与血管内皮细胞粘附的粘附分子有十几种。为了探讨黄芪多糖影响淋巴细胞-内皮细胞粘附的分子机制，本文检测了在淋巴细胞与内皮细胞稳定粘附中起主要作用的粘附分子ICAM-1和CD18的表达。实验结果表明：IL-1、TNF、黄芪多糖均能使HUVEC表面ICAM-1表达增多，且黄芪多糖与IL-1、TNF具有协同作用。IL-1可增加淋巴细胞CD18阳性百分率，TNF未表现出此作用。黄芪多糖对CD18的表达无影响。这些结果与细胞粘附实验结果是相吻合的，说明黄芪多糖诱导HUVEC表面ICAM-1增多是其增强淋巴细胞与HUVEC粘附的主要分子机制。
[基金项目]国家自然科学基金(39870949)和教委博士点基金(9858)资助项目
[作者简历]郝钰(1964-)，女，山西太原市人，副教授，硕士，主要从事中药免疫调节作用的研究。
[参考文献]
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[收稿日期]2000-01-04 (郝钰 邱全瑛 吴珺)