重组HLA-B*0702．75-84融合蛋白诱导同种移植免疫耐受的实验研究
关键词：HLA肽 融合蛋白 移植免疫耐受 心肌移植 T细胞极化
器官移植是治疗终末期器官功能衰竭的有效手段，但排斥反应是影响其成功率的主要障碍。尽管强力免疫抑制剂(如CsA等)应用于临床以来，排斥反应的发生率有所下降，但早期急性排斥反应发生率仍很高，加之长期服用免疫抑制剂引起的毒副作用等，极大地影响了器官移植的成功率。要解决上述问题，较为理想的办法是诱导受者产生特异性免疫耐受。综观现有研究资料，诱导免疫耐受的方法中，于围手术期给予HLA肽的方法效果最好。现有研究资料显示，合成相当于HLA-B7超型α1肽合槽保守区氨基酸序列的肽，有可能成为最理想的用于诱导人体移植免疫耐受的候选HLA肽。尽管HLA肽诱导移植免疫耐受的机制目前尚不十分清楚，但国外已开始进行临床实验。近年来实验还发现，合成的HLA肽与载体相偶连(如生物素等)不但不影响HLA肽的活性，反而还可增强其活性。目前国内尚未见有关此方面的详细报道。本实验拟重组HLA-B* 0702.75-84融合蛋白用于移植免疫耐受的实验研究。
人工合成HLA-B 0701.75-84(P1 )和HLA-B 0702.75-84(P2 )，HPLC纯化，纯度>95%以上，合成效率达95%。结果这两种肽在体外均可抑制淋巴细胞对由丝裂原和同种原引起的增殖反应，P2 还可抑制CTL的细胞毒效应，这种抑制作用没有等位基因特异性。
化学合成HLA-B* 0702.75-84cDNA，将其定向克隆于含有13kDa生物素化标记蛋白的PinPoinTXa-3表达载体，再将该表达载体转化大肠杆菌JM109 ，IPTG诱导表达，所表达的融合蛋白对HLA-B 0702.75-84的功能没有影响，可抑制CTL的细胞毒效应，与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。
于围手术期给予受者小鼠重组HLA-B* 0702.75-84融合蛋白结合应用亚治疗剂量CsA，观察了对同种移植心肌存活时间的影响，结果有50%的小鼠移植心肌存活时间超过30d，与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)，表明受者对同种异基因移植物产生了免疫耐受。
用Western印迹法确定生物素化标记蛋白HLA-B* 0702.75-84结合于淋巴细胞表面的分子为两个亚基，分子量分别约为40～45kDa，两个亚基均可与HLA-B 0702.75-84肽结合，这可能就是TCR；RT-PCR检测融合蛋白对淋巴细胞IL-2和IL-10表达的影响，发现重组生物素化标记蛋白/HLA-B* 0702.75-84可抑制IL-2的表达，而促进IL-10的表达。对HLA肽诱导移植免疫耐受的可能机制进行了讨论。
(汪泽厚 朱锡华)人工合成HLA-B 0701.75-84(P1 )和HLA-B 0702.75-84(P2 )，HPLC纯化，纯度>95%以上，合成效率达95%。结果这两种肽在体外均可抑制淋巴细胞对由丝裂原和同种原引起的增殖反应，P2 还可抑制CTL的细胞毒效应，这种抑制作用没有等位基因特异性。
化学合成HLA-B* 0702.75-84cDNA，将其定向克隆于含有13kDa生物素化标记蛋白的PinPoinTXa-3表达载体，再将该表达载体转化大肠杆菌JM109 ，IPTG诱导表达，所表达的融合蛋白对HLA-B 0702.75-84的功能没有影响，可抑制CTL的细胞毒效应，与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。
于围手术期给予受者小鼠重组HLA-B* 0702.75-84融合蛋白结合应用亚治疗剂量CsA，观察了对同种移植心肌存活时间的影响，结果有50%的小鼠移植心肌存活时间超过30d，与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)，表明受者对同种异基因移植物产生了免疫耐受。
用Western印迹法确定生物素化标记蛋白HLA-B* 0702.75-84结合于淋巴细胞表面的分子为两个亚基，分子量分别约为40～45kDa，两个亚基均可与HLA-B 0702.75-84肽结合，这可能就是TCR；RT-PCR检测融合蛋白对淋巴细胞IL-2和IL-10表达的影响，发现重组生物素化标记蛋白/HLA-B* 0702.75-84可抑制IL-2的表达，而促进IL-10的表达。对HLA肽诱导移植免疫耐受的可能机制进行了讨论。